CC BY
1616. Ульянова Т. Н. Полезные сорные растения во флоре СССР. Каталог мировой кол. ВИР, вып. 643. С-Пб.: ВИР, 1993. 160 с.
17. Ульянова Т. Н. Сорные растения во флоре России и других стран СНГ. Санкт-Петербург: ВИР, 1998, 344 с.
18. Учебно-полевые опыты с сельскохозяйственными растениями. Методическое пособие для учителей
биологии. -Воронеж: Центр.-Чернозем. кн. изд-во, 1986. -267 с.
19. Фисюнов А.В. Сорные растения. - М.: Колос, 1984. -243 с.
20. Фисюнов А.В. Справочник по борьбе с сорняками. -М.; 1985 - 255 с.
ДЕГРАДАЦИЯ ДИЭТИЛЕНТРИАМИНПЕНТААЦЕТАТА И ЕГО КОМПЛЕКСОВ С МЕТАЛЛАМИ ИММОБИЛИЗОВАННЫМИ КЛЕТКАМИ БАКТЕРИЙ CHELATIVORANS
OLIGOTROPHICUS ВКМ В-2395
Кувичкина Татьяна Николаевна
кандидат биологических наук, научный сотрудник, Сафонов Алексей Владимирович кандидат химических наук, старший научный сотрудник руководитель группы биотехнологии
и радиоэкологии, Капаруллина Елена Николаевна кандидат биологических наук, научный сотрудник, Решетилов Анатолий Николаевич профессор, доктор химических наук, заведующий лабораторией биосенсоров, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, г. Пущино, Московская область, Институт
физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина РАН, г. Москва
DEGRADATION OF DIETHYLENETRIAMINEPENTAACETATE AND ITS COMPLEXES WITH METALS BY IMMOBILIZED CELLS OF BACTERIA CHELATIVORANS OLIGOTROPHICUS VKM В-2395 Kuvichkina Tatiana, Candidate of Science, Researcher,
Safonov Alexey, Candidate of Science Senior Researcher, Head of biotechnology and radioecology group, Kaparullina Elena, Candidate of Science, Researcher,
Reshetilov Anatoly, Professor, Doctor of Science, Head of Biosensor laboratory, G.K.Skryabin Institute of biochemistry and physiology of microorganisms, RAS, Pushchino, Moscow region, A.N. Frumkin Institute of Physical Chemistry and electrochemistry RAS, Moscow АННОТАЦИЯ
Рассмотрена окислительная деградация диэтилентриаминпентаацетата и его комплексов с металлами, осуществляемая иммобилизованными клетками штамма Chelativorans oligotrophicus ВКМ B-2395. Впервые показано, что данный штамм, известный как облигатный деструктор этилендиаминтетраацетата, обладает способностью к разложению диэтилентриаминпентаацетата и его комплексов с ионами металлов Mg2+, Mn2+, Co2+, Ni2+. В перспективе данное исследование может помочь в поиске решения проблемы обращения с органическими радиоактивными отходами, образующимися после дезактивации оборудования АЭС. ABSTRACT
Enzymatic oxidative degradation of diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA) and DTPA complexes with metals has been investigated using immobilized cells Chelativorans oligotrophicus VKM B-2395. For the first time it has been found that Mg-DTPA, Mn-DTPA, Co-DTPA and Ni-DTPA complexes undergo degradation by bacteria under study. This work is a solution-directed study searching for the ways of managing organic radioactive wastes formed after post-operational clean out of the equipment at Atomic Power Station.
Ключевые слова: диэтилентриаминпентаацетат; комплексы с металлами; иммобилизация; бактерии Chelativorans oligotrophicus; амперометрический биосенсор.
Keywords: diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA); DTPA complexes with metals; immobilization; bacteria Chelativorans oligotrophicus; amperometric biosensor.
Диэтилентриаминпентаацетат (диэтилентриамин-^^№,№',№'-пентауксусная кислота ДТПА) занимает особое место среди хелатообразующих соединений. ДТПА является пятиосновной кислотой, имеющей строение тройного бетаина. Представляет интерес комплексообра-зующие свойства ДТПА, являющимся одним из наиболее
универсальных органических лигандов. ДТПА применяют в качестве титранта в комплексонометрии и маскирующего агента в аналитической химии; для разделения редкоземельных и трансурановых элементов методом экстракции, для стабилизации бумаги в процессе искусствен-
ного теплового старения [4]. Кроме того, благодаря способности образовывать водорастворимые комплексы с двух- и трёхвалентными металлами, ДТПА может использоваться при дезактивации ядерных реакторов [1,3]. При этом образуются большие объёмы растворов, содержащие комплексы металлов с ДТПА, что затрудняет утилизацию отходов.
Существуют два способа разрушения ДТПА: физико-химический и микробиологический. Физико-химический способ представляет собой фотохимическое разложение комплекса Fe(NI)^TnA под воздействием ультрафиолета на поверхности естественных водоёмов. Этот процесс зависит от климатических условий, освещенности, сезона и не может рассматриваться, как существенный фактор разрушения ДТПА в природе [12]. Несколько групп исследователей наблюдали в почвах микробиологический распад ДТПА [8,11]. Однако нами не найдено сообщений о деградации ДТПА чистыми культурами микроорганизмов. Показано, что фермент этилендиаминтетра-ацетат-монооксигеназа, выделенный из факультативного деструктора Chelativorans multitrophicus DSM 9103, имеет широкую субстратную специфичность. Этот фермент разрушает не только этилендиаминтетраацетат (ЭДТА), но и пентаацетат (ДТПА) [13]. Ферментативные и полярографические исследования, а также анализ продуктов разложения, показали, что у облигатного деструктора Chelativorans oligotrophies ВКМ B-2395 первый этап разложения ЭДТА катализирует ЭДТА-монооксигеназа, подобная той, которая обнаружена ранее у факультативного деструктора C. multitrophicus DSM 9103 [2,7]. Мы предположили, что ЭДТА-монооксигеназа C. oligotrophicus ВКМ B-2395 также имеет широкую субстратную специфичность и сможет разрушать ДТПА и его комплексы с металлами. Микробиологическое разложение комплексов ДТПА с металлами могло бы помочь в решении проблемы утилизации отходов (дезактивации оборудования АЭС) и предприятий ядерно-топливного цикла. На данный момент не существует простого и недорогого метода деструкции органических комплексонов. Процесс разложения ЭДТА микроорганизмами происходит с потреблением молекулярного кислорода, данный факт позволил использовать биосенсорный подход для изучения процесса разложения ЭДТА [2].
Целью данной работы являлось исследование у иммобилизованных клеток штамма Chelativorans oligotrophicus ВКМ B-2395 способности к окислительной деградации диэтилентриаминпентаацетата и его комплексов с ионами металлов Mg2+, Mn2+, Co2+, Ni2+.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалы и реактивы. В качестве источника углерода, азота и энергии использовали ЭДТА (ч.д.а. «ДиаэМ», Германия). Соли для приготовления питательной среды и для приготовления комплексов металлов с ДТПА были аналитической чистоты («Реахим», Россия). Агаризован-ные среды готовили с бакто-агаром Type USA («Difco», США).
Объект исследования. В работе использовали штамм Chelativorans oligotrophicus ВКМ В-2395, выделенный в лаборатории физиологии микроорганизмов ИБФМ РАН из активного ила городских очистных сооружений г. Пущино [6]. Штамм хранится во Всероссийской коллекции культур (ВКМ).
Среды и условия культивирования. Культуру поддерживали на минеральной агаризованной (2%) среде следующего состава (г/л): MgSO4 -7H2O - 1.0, KH2PO4 -0.26, CaCl2-2H2O - 0.40, Na2HPO4-12H2O - 0.83, Ш2ЭДТА-1.0. Микроэлементы (мг/л): FeCl3-4H2O - 1.5, H3BO3 -0.06, MnCl2-4H2O - 0.1, CaCl2-6H2O - 0.12, ZnCl2 - 0.07, NiCl2-6H2O - 0.025, CuCl2-2H2O - 0.015, Na2MoCl4 - 0.025. Использовали смесь следующих витаминов (мг/л): пири-доксин-HCl - 0.1, тиамин-HCl - 0.05, рибофлавин - 0.05, никотиновая кислота - 0.05, кальций пантотенат - 0.05, Р -аминобензойная кислота - 0.05, липоевая кислота - 0.05, никотинамид - 0.05, витамин В12 - 0.05, биотин - 0.02, фо-лиевая кислота - 0.02. Витамины и микроэлементы готовили в виде концентрированных стерильных растворов и добавляли в среду перед посевом в количестве 1 и 2 мл/л соответственно. Начальное значение рН составляло 7.0.
Музейную культуру штамма C. oligotrophicus ВКМ В-2395 пересевали на скошенный ЭДТА-агар и выдерживали в термостате при 28°С в течение 5 суток. Смыв со свежей культуры в количестве 1-2 мл переносили в стерильные колбы Эрленмейера объемом 750 мл со 100 мл среды. Для выращивания биомассы использовали жидкую среду того же состава. Периодическое культивирование бактерий проводили в колбах на качалке 150 об/мин при 28°С в течение 5-7 суток. Биомассу (конец экспоненциальной фазы роста) отделяли центрифугированием при 5000 g в течение 30 мин, +4°С. Клеточную суспензию хранили в холодильнике при +4°С.
Иммобилизация клеток. Для иммобилизации алик-воту клеточной суспензии центрифугировали при 10 000 g в течение 3 мин при комнатной температуре. Клетки отмывали дважды 30 мМ HEPES- буфером, рН 7.4. Иммобилизацию клеток C. oligotrophicus ВКМ В-2395 осуществляли методом физической адсорбции. Для этого клеточную суспензию, содержащую 10 мкл HEPES-буфера (рН 7.4) с 2 мг сырой биомассы, наносили на полоску хрома-тографической стеклобумаги («Whatman GF/A», Великобритания), формируя пятно диаметром 3 мм. Пятно подсушивали при комнатной температуре в течение 20 мин. Подготовленный распознающий элемент (биорецептор) на основе иммобилизованных клеток (ИмК) C. oligotrophicus ВКМ В-2395 фиксировали на измерительной поверхности кислородного электрода типа Кларка («Кронас», Россия) с помощью нейлоновой сетки.
Условия измерений. Измерения проводили при комнатой температуре в открытой кювете объёмом 2 мл в 30 мМ HEPES-буфере (рН 7.4), насыщенном кислородом, с помощью потенциостата IPC-Micro («Кронас», Россия). Объем пробы субстрата составлял 100 мкл. Регистрируемым параметром являлась максимальная скорость изменения выходного сигнала dI/dt (нА/с), связанная пропорциональной зависимостью со скоростью изменения концентрации потреблённого кислорода (ответ сенсора).
Приготовление комплексов ДТПА с металлами. Водные растворы комплексов ДТПА с металлами (Ме-ДТПА) готовили, смешивая эквимолярные концентрации водных растворов ДТПА и соответствующей соли металла за 24 ч до начала эксперимента.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В условиях эксперимента были использованы не-растущая культура C. oligotrophicus BKM B-2395, для кото-
рой следует ожидать стабильные стехиометрические соотношения между количеством потреблённого кислорода и ДТПА (Ме-ДТПА)
ДТПА +О2 монооксигеназа^ продукты реакции Кинетические константы скорости потребления кислорода и деградации ДТПА идентичны. Максимальные скорости обоих процессов взаимно пропорцио-
нальны. Сравнение значений скорости потребления кислорода является обоснованным для подобного параметра деградации ДТПА. Для изучения влияния концентраций Ме-ДТПА на потребление кислорода иммобилизованными клетками концентрации субстратов варьировали от 0.5 до 5.0 мМ. На рисунке 1 представлены градуи-ровочные кривые зависимости ответов сенсора на основе ИмК штамма С. oligotrophicus ВКМ В-2395 от концентрации ДТПА (А), Mg-ДТПА (б).
2,0 1,8 1,6 1,4 1,2
I s
i 1,0
<
I
0,8 0,6 0,4 0,2 0,0
•I 0,8 <
ДТПА. мМ МдДТПА, мМ
Рисунок 1. Градуировочные кривые зависимости ответа сенсора на основе ИмК штамма C. oligotrophicus BKM B-2395
от концентрации ДТПА (А), Mg-ДТПА (Б)
На рисунке 2 представлены градуировочные кривые зависимости ответа сенсора на основе ИмК штамма С. oligotrophicus BKM B-2395 от концентрации комплексов с
ионами металлов 4-го периода Периодической системы: Mn-ДТПА (В), Co- ДТПА (Г), Ni-ДТПА (Д).
Mn-ДТПА, мМ Со-ДТПА, мМ М-ДТПА, мМ
Рисунок 2. Градуировочные кривые зависимости ответа сенсора на основе ИмК штамма C. oligotrophicus BKM B-2395
от концентрации Mn-ДТПА (В), Co- ДТПА (Г), Ni-ДТПА (Д)
Для всех изученных субстратов скорость деградации ДТПА росла по мере повышения концентрации ДТПА-субстратов. Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата (определяемого вещества) лежит в основе градуировочной зависимости биосенсора с биораспознающим элементом каталитического типа. Известно, что ферментный комплекс ЭДТА-моноок-сигеназа факультативных деструкторов ЭДТА состоит из двух субъединиц [6,8]. Однако в условиях нашего эксперимента коэффициент Хилла (^ был близок к единице,
что свидетельствовало об отсутствии кооперативного эффекта. Используя кривые субстратной зависимости (граду-ировочная зависимость) и компьютерную программу для нелинейной регрессии, вычислили значения максимальной скорости потребления кислорода ИмК ^макс.) и кажущиеся константы сродства к субстрату (КМ(каж)) для ДТПА и его комплексов с ионами металлов по уравнению Михаэлиса - Ментен (рисунки 1, 2). v=Vмакс./ (1+КМ (каж)/С) (1), где С - концентрация ДТПА-субстрата, мМ
Таблица 1
Кинетические константы штамма Chelativorans oligotrophicus BKM B-2395 в процессе разложения
ДТПА - содержащих субстратов
0 5
0,4
0 3
0,2
0 1
0,0
3 4
Субстрат, содержащий полиаминополиуксусную кислоту Максимальная скорость потребления кислорода ^макс.), нА/мин Кажущаяся константа сродства к субстрату (КМ(каж)), мМ
ДТПА 8.9±6.7 1.1±0.2
Mg-ДТПА 2.1±0.5 5.8±2.0
Mn-ДТПА 4.7±0.5 8.8±1.4
Co-ДТПА 1.3±0.3 14.3±4.7
Ni-ДТПА 4.2±0.4 7.8±1.2
Фермент имеет самую малую КМ(каж) и большее сродство к ДТПА по сравнению с другими субстратами, содержащими полиаминополиуксусную кислоту. Нижний предел определения составлял для ДТПА 0,5 мМ. Долговременная стабильность сохранялась в течение 5 суток. Длительность одного измерения, включающая время отклика и время регенерации, составила 20 минут.
Таким образом показано, что иммобилизованные клетки штамма Chelativorans oligotrophicus ВКМ B-2395 способны к окислительной деградации диэтилентриа-минпентаацетата и его комплексов с ионами металлов Mg2+, Mn2+, Co2+, Ni2+. В перспективе микробиологическое разложение комплексов ДТПА с металлами культурой Chelativorans oligotrophicus ВКМ B-2395 может помочь в решении проблемы утилизации отходов (дезактивации оборудования АЭС) и предприятий ядерно-топливного цикла.
Список литературы
1. Герман К.Э., Мелентьев А.Б., Зубавичус Я.В., Калмыков С.Н., Ширяев А.А., Тананаев И.Г. // Радиохимия. 2011. Т.53. № 2. С. 155-161.
2. Кувичкина Т.Н., Капаруллина Е.Н., Доронина Н.В., Троценко Ю.А., Решетилов А.Н. // Прикл. биохимия и микробиология. 2012. Т.48. №6. С.626-630.
3. Мелентьев А.Б., Машкин А.Н., Тугарина О.В., Колу-паев Д.Н., Герман К.Э., Тананаев И.Г. // Радиохимия. 2011. Т.53. № 2. С. 150-154.
4. Цирульникова Н.В., Дёмина Н.П., Литвинова Т.В., Тёмкина В.Я. // Химическая промышленность. 1977. №6. С.23-26.
5. Chistyakova T.I., Belikova V.L., Satroutdinov A.D., Dedyukhina E.G., Eroshin V.K. // Word J. Microbiol.Biotechnol. 2003. V. 19. № 6. P. 977-980.
6. Doronina N.V., Kaparullina E.N., Trotsenko Y.A., Noertemann B., Bucheli-Witschei M., Weilenmann H.-U., Egli T. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2010. V. 60. №. 5. P. 1044-1051.
7. Eroshin V.K., Satroutdinov A.D., Minkevich I.G., Dedyukhina E.G., Chistyakova T.I., Reshetilov A.N. // Proc. Biochem. 2002. V. 38. № 2. P. 151-154.
8. Means, J.L., Kucak, T. and Crerar, D.A. // Environ. Pollut. Series B.1980. V. 1. P. 45-60.
9. Nispel, F., Baumann, W. and Hardes, G. // Abwasserreinigung.1990. V. 37. P. 707-709.
10. Sillanpäa, M // Chemosphere. 1996. V. 33. P. 293-302.
11. Stumpf, M., Ternes, T.A., Schuppert, B., Haberer, K., Ho.mannP. and Ortner, H.M. // Vom Wasser.1996. V. 86. P. 157-171.
12. Svenson, A., Kaj, L. and Bjo« rndal, H. // Chemosphere. 1989. V.18. P.1805-1808.
13. Witschel, M., Nagel, S. and Egli, T. // J. Bacteriol. 1997. V. 79. P. 6937-6943.
ОСОБЕННОСТИ ОРГАНИЗАЦИИ И ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ ТАКСОЦЕНОЗОВ БЛОХ
СИНАНТРОПНЫХ ГРЫЗУНОВ В КУРСКОЙ ОБЛАСТИ
Кусакина Е.В.
магистрант, направление Биология, магистерская программа «Биоразнообразие и охрана природы»
Курский государственный университет,
BIOLOGICAL AND ECOLOGICAL CHARACTERISTICS OF FLEAS (SIPHONAPTERA) ON COMMENSAL RODENTS (RODENTIA) OF THE SOUTHERN DISTRICTS OF THE KURSK REGION
Kusakina E. V. - graduate student, the direction of Biology, the master's programme in Biodiversity and conservation" Kursk state University,
АННОТАЦИЯ
Цель: Обобщение и анализ сведений по особенностям экологии и биологии блох синантропных грызунов южных районов Курской области для разработки и планирования мероприятий по снижению риска распространения опасных инфекций. Задачи:
- изучить особенности биологии и экологии грызунов в районах исследования
- уточнить видовой состав блох мышевидных грызунов;
- выявить зависимость изменения численности, продолжительности жизни, плодовитости и сроков метаморфоза блох от вида прокормителя, динамики температурного режима.
Практическая значимость: изучение биотических взаимоотношений типа хозяин-паразит имеет большое значение для понимания закономерностей экологических и эпизоотологических процессов и разработки рациональных противоэпидемических мероприятий. Полученные данные использовались при составлении прогнозов и обзоров численности эктопаразитов для учреждений здравоохранения на территории Курской области. ABSTRACT
Purpose: compile and analyze information on the specifics of the ecology and biology of fleas of synanthropic rodents in the southern districts of the Kursk region for the development and planning of measures to reduce the risk of spread of infectious disease.
Objectives:
- to study the biology and ecology of rodents in the study areas
