CC BY
26
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 577.12.543.862.2
ОКИСЛЕНИЕ ФЕНОЛА И КАТЕХОЛА ИММОБИЛИЗОВАННЫМИ КЛЕТКАМИ АКТИНОБАКТЕРИЙ RHODOCOCCUS GORDONIAE
ЬКТО
Т. Н. Кувичкина, В. Е. Носулич, Е. Н. Капаруллина, Н. В. Доронина, А. А. Макаренко, А. Н. Решетилов
Из почвы промышленной зоны г. Самара выделен штамм Leto - деструктор фенола и катехола. Изолят представлен грамположительными неподвижными короткими палочками. Оптимально растет при 28-37° С и рН 7.5 с 0.25 г/л фенола в качестве единственного источника углерода и энергии, а также может использовать широкий спектр полиуглеродных субстратов (углеводы, спирты и органические кислоты). Секвенирование гена 16SрРНК штамма Leto выявило высокое сходство (99,7%) с Rhodococcus gordoniae W4937T, что дало основание отнести изолят к этому виду. Исследовано окисление фенола и катехола иммобилизованными клетками Rhodococcus gordoniae Leto на амперометрическом биосенсоре.
Ключевые слова: Rhodococcus, деструктор фенола и катехола (пирокатехина), биосенсор амперометрический, кислородный электрод.
Введение
Фенол (гидроксибензол) — простейший представитель класса фенолов. Благоприятные условия для использования фенольных продуктов создает сочетание в молекуле фенола ароматического ядра и оксигруппы, являющейся одним из сильнейших орто-пара-ориентирующих заместителей [1]. Фенол применяют в нефтехимии, в синтезе фенолформальдегидных смол, в производстве красителей, фармацевтических препаратов, в процессах добычи и транспортировки нефти [2]. Мировое производство фенола в 2006 год составляло 8,3 млн т/год, в России в 2018 году было произведено 201 986 т. синтетического фенола (https://alto-group.ru). Фенол проявляет селективность при удалении из масел смолистых веществ, различных полициклических ароматических углеводородов с короткими боковыми цепями, а также соединений, содержащих серу [3]. Фенол токсичен для животных и человека. В настоящее время фенол относится к числу наиболее распространенных загрязнителей поверхностных вод и почв, попадающих в окружающую среду. Производное фенола - катехол (пирокатехин, 1,2-дигидроксибензол, орто-диоксибензол) находит свое применение как реактив при проявлении фотоматериалов, также как краситель при глубоком окрашивании галантерейных кож и мехов. Используется для получения адреналина (медпрепарат), ализарина (служит преимущественно в производстве полиграфических и художественных красок), гваякола (производство
душистых веществ: ванилина, санталидола, эвгенола и изоэвгенола; лекарственных препаратов папаверина и фтивазида; является отдушкой в пищевой и парфюмерной промышленности). Катехол относится к аллергенам, а также имеет мутагенные и канцерогенные свойства, способен вызывать сильное раздражение кожи и дерматиты [4].
Для определения фенола в водном растворе применим метод обращенно-фазовой микроколоночной высокоэффективной жидкостной хроматографии с предварительной стадией пробоподготовки методом жидкостной экстракции ацетонитрилом [5]. Хроматографические методы определения фенола в образцах водных растворов и почвы требуют наличия дорогостоящего оборудования и квалифицированных специалистов.
Альтернативным методом определения фенола является микробный биосенсор, так как он обладает высокой чувствительностью и простотой конструкции. Кроме того, для анализа необходим меньший объем пробы. Микроорганизмы деструкторы фенола обладают системой ферментов, окисляющих фенол с потреблением молекулярного кислорода. Потребление кислорода деструкторами позволяет применять их в качестве биорецепторов амперометрических биосенсоров, где в качестве преобразователя используется кислородный электрод типа Кларка.
Ранее выделены два штамма деструкторов фенола, идентифицированные как Rhodococcus gordoniae. Штамм МТСС 1534, выделеный из суспензии фенол-содержащей почвы около города Чандигарха (Индия), деградировал фенол в качестве единственного источника углерода в концентрациях выше 25 мМ [6]. Известно, что аэробные бактерии-деструкторы фенола могут быть биорецепторами амперометрического биосенсора, регистрирующего сигналы на введение в кювету фенола и/или катехола [7, 8].
Цель данной работы - характеристика нового грамположительного штамма-деструктора фенола и катехола и исследование окисления им этих соединений на амперометрическом биосенсоре.
Материалы и методы
Объект исследования. Объектом исследования служил штамм Leto, выделенный из образца почвы очистных сооружений промышленной зоны г. Самара. Навеску почвы (1 г) развели в 10 мл физраствора и высеяли на чашки Петри с селективной средой «Е», инкубировали в термостате при 28°С до появления единичных колоний, которые затем пересевали на скошенный агар и проверяли на чистоту.
Среды и условия культивирования. Агаризованная селективная синтетическая среда «Е» содержала (г/л): КН2РО4 - 8,7; N^0 - 0,535; СаСЪ - 1,11; (Ж4)МО7024-4Н20 - 0,0618; Mga2•6H2O - 0,1197; Na2SO4 -0,142; агар - 5,0; фенол - 0,25. Кроме того, использовали
Среда «К» содержала (г/л): КН2РО4 - 2,0; (NHO2SO4 - 2,0; NaCl -0,5; MgSO4-7H2O - 0,1; FeSO4-7H2O - 0,002; pH 7,4.
Питательная среда 5/5: аминопептид - 60 мл, триптон - 5 г, дрожжевой экстракт - 1 г, соевый экстракт - 30 мл, агар-агар - 20 г, вода дистиллированная до 1000 мл; рН 7.2. Среды стерилизовали автоклавированием в режиме 0,5 атм в течение 30 минут.
Изучение культуральных и физиолого-биохимических свойств изолята. Для изучения морфологии и подвижности клеток штамм Leto выращивали на агаризованных средах «E», «К» и 5/5 (2% агар "Difco", США). Температурный диапазон роста определяли, выращивая культуру в жидкой среде «К» с 0.25 г/л фенола в герметично закрытых флаконах на качалке (120 об/мин) при температуре 24-37°С. Рост изолята при различных значениях концентрации фенола, солености и рН исследовали на среде «К». При изучении способности изолята использовать различные органические соединения в качестве источника углерода и энергии в минеральную среду вместо фенола вносили 0.05-0.3 % (в/об) испытуемого вещества, инокулировали культурой и инкубировали 14 сут на качалке при оптимальной температуре. Все летучие вещества вносили в количестве 0.5 % по объему среды.
Материалы и реактивы. В качестве источника углерода и энергии использовали фенол («Реактив», Россия). Для приготовления питательной среды использовали реактивы аналитической чистоты («Реахим», Россия).
Микроскопия. Изучение морфологии клеток в режиме фазового контраста проводили с помощью фазово-контрастного флуоресцентного микроскопа AXIO Imager A1 («ZEISS», Германия), цифровой фотокамеры AxioCam (ZEISS) с объективом Achroplan 100x/1,25 PH3 «Zeiss» (Германия), и программы для обработки изображения AxioVision AC. Микроскопия проводилась мл. науч. сотр. Звонаревым А.Н. (ФИЦ ПНЦ БИ РАН ИБФМ РАН, Пущино).
Выделение и анализ ДНК. ДНК выделяли с использованием набора ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrep ("Zymo Research", США) в соответствии с рекомендациями фирмы - производителя. Ген 16S рРНК амплифицировали ПЦР, используя универсальные для прокариот праймеры 27f и 1492r [9]. Продукты реакции разделяли методом электрофореза в 1 %-ном агарозном геле. Выделение и очистку фрагментов ДНК из легкоплавкой агарозы проводили на колонках с использованием набора Zymoclean Gel DNA Recovery Kit ("Zymo Research", США), согласно инструкции фирмы-производителя. Секвенирование ПЦР-фрагментов проводили с помощью набора реактивов CEQ Dye Terminator Cycle Sequencing kit ("Beckman Coulter", США) на анализаторе CEQ2000 XL ("Beckman Coulter", США).
Филогенетический анализ. Предварительный анализ сходства последовательностей гена 16S рРНК проводили по базе данных GeneBank
[NCBI] с помощью пакета программ BLAST [http://ncbi.nlm.nih.gov]. Для более точного определения филогенетического положения изолята нуклеотидные последовательности гена 16S рРНК выравнивали с последовательностями референтных штаммов с помощью программы CLUSTAL W [10]. Филогенетический анализ выполнен при помощи программы MEGA 5 [11]. Филогенетические деревья (филограммы) строили методом присоединения соседей ("neighbor-joining") [12]. Статистическую достоверность ветвления оценивали с помощью "bootstrap-анализа" 100 альтернативных филограмм.
Иммобилизация клеток. Для иммобилизации аликвоту клеточной суспензии центрифугировали при 10 000 g в течение 3 мин при комнатной температуре. Клетки отмывали дважды 30 мМ калий-фосфатным буфером, рН 7,5. Иммобилизацию клеток осуществляли методом физической адсорбции. Для этого клеточную суспензию, содержащую 10 мкл калий-фосфатного буферного раствора (30 мМ, рН 7,5) с 1 мг сырой биомассы, наносили на полоску хроматографической стеклобумаги («Whatman GF/A», Великобритания), формируя пятно диаметром 3 мм. Пятно подсушивали при комнатной температуре в течение 20 мин. Биорецептор на основе иммобилизованных клеток (ИмК) фиксировали на измерительной поверхности кислородного электрода типа Кларка («Кронас», Россия) с помощью нейлоновой сетки.
Условия измерений. Измерения проводили в калий-фосфатном буфере (30 мМ, рН 7,5), насыщенном кислородом, в открытой кювете объёмом 2 мл с помощью потенциостата IPC-Micro («Кронас», Россия). Регистрируемым параметром являлась максимальная скорость изменения выходного сигнала dI/dt (нА/с), связанная пропорциональной зависимостью со скоростью изменения концентрации потреблённого кислорода (ответ биосенсора). Объем пробы субстрата составлял 100 мкл.
Построение зависимостей ответа биосенсора от значений pH. Для измерения рН-зависимости использовали 50 мМ калий-фосфатный буфер со значениями pH 5,3, 6,0, 7,3, 8,2, 9,1, 10,3, которые устанавливали добавлением 1М NaOH и 5 н HCl. В качестве субстрата использовали 250 мкМ фенола. Все исследования проверялись в трёх повторностях.
Субстратная специфичность. Оценку субстратной специфичности биорецептора провели по 9 субстратам: фенол, катехол (пирокатехин), D-сорбит, L(-)-арабит, D(+)-целлобиоза, а-кетоглутаровая кислота, янтарная кислота, DL-лизин гидрохлорид, D-глюкоза. Концентрация субстратов в кювете 0,1 мМ.
Результаты и обсуждение
Морфология и физиология изолята. Из образца почвы очистных сооружений промышленной зоны г. Самара на среде с фенолом выделен штамм Leto. Изолят представлен грамположительными неподвижными,
овоидными плеоморфными палочками (1,8 до 3,0 мкм) (рис. 1). На селективной агаризованной минеральной среде с фенолом или среде 5/5 колонии выпуклые, блестящие, розовато-коралловые с нитевидными краями.
Штамм оптимально растет в диапазоне 28-37°С, рН 7,0-7.5 в присутствии 0.25 г/л (2.7 мМ) фенола, в качестве единственного источника углерода и энергии, а также использует широкий спектр полиуглеродных субстратов (углеводы, спирты и органические кислоты) без агрегации клеток и выделения пигмента в среду, ингибируется 5% №С1.
Рис. 1. Морфология клеток штамма Leto, выращенного на феноле.
Использован фазовый контраст, длина масштабной метки
равна 5 мкм
Генотипическая характеристика. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК показал, что исследуемый штамм Leto имеет высокое сходство с представителями рода Rhodococcus^. 99,7% с Rhodococcus gordoniae W4937T, 99,3% с Rhodococcus biphenylivorans TG9T и 99,1% с Rhodococcus pyridinovorans PDB9T Наибольшее сходство изолят проявил с Rhodococcus gordoniae W4937T , что дает основание отнести его к данному виду. Таким образом, на основании секвенирования гена 16S рРНК штамм Leto идентифицирован как новый штамм известного вида Rhodococcus gordoniae Leto (рис. 2).
Д1
ДЗ
61
юс
95
Л
с
100
61
99" Ье1о
72 Ююс1ососсш гс1отар- \У49Я 7Т (АУ233201) КгЮсЬссссш руг1(1то\-огат РБВ9 т (АР 173005) КИосЬсоссш ЬгркеЩ'!когат ТС91 (0546454) — ШюсЬсоссж гНойосЪгош Б5М 43241Т (Х79288)
Шюдососсш шчечиншеУ1М 65754т (011367155) ~ ЮюАососсж ркепоЬсж С2Р ~ (А \г5 3 3 293) ЮюсЬсоссж гор/пО&М 441081" (АР 191343) Ююскюоссш гиЬег Б5М43333г (Х80625) — ШюсЬсоссж аеХИе.гоуюгат 0Ьс312т (АР447391)
Вковососсш аегоЫш РАМС 273671 (КМ044053) ШюсЬсоссж г ко сЬт В 8М43 3 3 6т (Х80621)
-Зкегтата рпи/огти ХВКС 15 05 9Т (23 543 5)
- МШиш Ъггхк 1811 (АУ534742)
-ШППтжш тигаШ МА140-96Т (У17384)
-ТзикатигеПаражотеЛаЪо1а ББМ 20162 г (АР283280)
СагупвЪас1епит сЬрЫкепае№1'ТС 11397т (Х84248) -ТипсеИа о Шгс1и 234Т(Х73 976)
0.01
Рис. 2. Филогенетическое положение штамма Leto, основанное на сравнении нуклеотидных последовательностей гена 16SрРНК. Масштаб соответствует 10 нуклеотидным заменам на каждые 100 нуклеотидов (эволюционным расстояниям). Корень определен включением последовательности Turicella otitidis 234^X73976) в качестве внешней группы. Цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления, определенная с помощью «bootstrap»-анализа 100 альтернативных деревьев
Биосенсорные иследования. Ярко выраженная способность к деградации фенола и высокая скорость роста штамма Я. gordoniae Leto на селективной среде с фенолом в качестве источника углерода и энергии позволили использовать при создании биосенсора. В условиях эксперимента были применены нерастущие культуры, для которых следует ожидать стабильные стехиометрические соотношения между количеством потреблённого кислорода и фенола:
фенол +О2 ЯЪосЬсосси* 8ог^отае ^ продукты реакции
Кинетические константы для скоростей потребления кислорода и деградации фенола идентичны. Максимальные скорости обоих процессов взаимно пропорциональны. Сравнение значений скоростей для потребления кислорода является обоснованным для подобного параметра деградации фенола. Для изучения влияния концентраций фенола на потребление кислорода ИмК концентрации субстрата варьировали от 100 до 500 мкМ. На рис. 3 представлена градуировочная зависимость ответов
биосенсора на основе R. gordoniae Leto от концентрации фенола и катехола.
100 200 300 400 500
Концентрация фенола, мкМ
0 100 200 300 400 500 600
Концентрация катехола, мкМ
Рис. 3. Градуировочная зависимость ответов биосенсора на основе Rhodococcus gordoniae Leto от концентрации фенола и катехола
0
Скорость деградации фенола и катехола повышалась по мере повышения их концентрации. Диапазон определения составлял от 50 до 500 мкМ.
Оценку субстратной специфичности биорецептора на основе R. gordoniae Leto проводили по следующим 9 субстратам: фенол, катехол (пирокатехин), D-сорбит, L(-)-арабит, D(+)-целлобиоза, а-кетоглутаровая кислота, янтарная кислота, DL-лизин гидрохлорид, D-глюкоза. Ответы сенсора на разные субстраты отличались (рис. 4).
100
123456789
Рис. 4. Субстратная специфичность биосенсора на основе Rhodococcus gordoniae Leto. Субстраты: 1 - фенол; 2 -катехол; 3 - D-сорбит; 4 - L(-) арабит; 5 - D-глюкоза; 6 - D(+)-целлобиоза; 7 - а-кетоглутаровая кислота; 8 - янтарная кислота; 9 - DL-лизин гидрохлорид
Наибольшие значения величины ответов биосенсора наблюдались при введении в кювету катехола. Это свидетельствует о наличии фенолдеградирующей активности у данного штамма, так как чаще всего катехол является основным промежуточным продуктом метаболизма фенола у фенолдеградирующих микроорганизмов.
Изучена зависимость ответов распознающего элемента от ионной силы в диапазоне от 25 до 500 мМ №С1. Я. gordoniae Leto выдерживает высокие концентрации соли до 100 мМ №С1.
Значение рН среды является одним из факторов, влияющих на активность клеточных ферментов распознающего элемента. Для измерения рН-зависимости использовали 50 мМ калий-фосфатный буфер в диапазоне значений рН 5,3- 10,3.
Значения рН
Рис. 5. Влияние значений рН на ответ биосенсора на основе Rhodococcus gordoniae Leto (фенол, 250 мкМ)
Из рис. 5 видно, что наибольшая окислительная активность штамма Я. gordoniae Leto к фенолу наблюдается при значении рН калий-фосфатного буфера раствора 7,5.
Долговременная стабильность биорецептора с Я. gordoniae Leto при хранении электрода в условиях низких температур (+4 С) в 50 мМ калий-фосфатном буферном растворе рН 7,5 составляла 9 суток.
Заключение
Таким образом, представлено доказательство способности нового изолята родокков к окислению фенола и катехола. Новый штамм Яhodococcus gordoniae Leto, очевидно, играет важную биосферную роль и перспективен для применения в биотехнологии, в том числе для создания
биофильтров и биосенсоров для разложения и определения фенола и катехола.
Список литературы
1. Маркушева, Т.В. Журенко Е.Ю., Кусова И.В. Бактерии-деструкторы фенола и его хлорированных производных Уфа: Гилем. 2016. 108 с.
2. Галимова, Р.З. Шайхиев И.Г., Алмазова Г.А. Изучение термодинамики сорбции фенола на отходах валяльно-войлочного производства // Вестник технологического университета. 2016. Т.19. №14. С. 169-171.
3. Яушев Р.Г., Усманов Р. М. Интенсификация процесса селективной очистки масел фенолом. М.: ЦНИИТ Энефтехим, 1988. 76 с.
4. Новый справочник химика и технолога. Радиоактивные вещества. Вредные вещества. Гигиенические нормативы / Редкол.: Москвин А. В. и др. СПб.: АНО НПО «Профессионал», 2004.1142 с.
5. Способ определения фенола в водном растворе / Селеменев В.Ф., Харитонова Л.А., Подолина Е.А. [и др.] // Патент 2415414 Российская Федерация. 2011. Бюл. № 9.
6. Rhodococcus gordoniae sp. nov., an actinomycete isolated from clinical material and phenol-contaminated soil / A.L. Jones, J.M. Brown, V. Mishra [at al.] // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2004. Vol. 54. P. 407-411.
7. Бактерии из почв месторождений Западной Сибири как основа биосенсоров для определения фенола / А. А.Макаренко, И.П. Безвербная, И.А.Кошелева [и др.] // Прикл. биохим. микробиол. 2002. Т. 38. № 1. С. 2934.
8. Подход к поиску и выделению микроорганизмов деструкторов фенола / Т.Н. Кувичкина, В.Е. Носулич, Е.Н. Капаруллина [и др.] // Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Экология родного края: проблемы и пути их решения» г. Киров 16-18 апреля 2019 г. С. 242-246.
9. Lane D.J. 16S/23S rRNA sequencing in nucleic acid techniques in bacterial systematics. Edited by Stackebrandt E., Goodfellow M. Chichester: John Wiley and Sons. 1991. P. 115-175.
10. The ClustalX windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools / J.D. Thompson, T.J. Gibson, F.Plewniak [at al.] // Nucl. Acids Res. 1997. V. 25. P. 4876-4882.
11. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods / K. Tamura, D. Peterson, N. Peterson [at al.] // Mol. Biol. Evol. 2011. V. 38. P. 27312739.
12. Saitou N., Nei M. The neighbour-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees // Mol. Biol. Evol. 1987. V. 4. P. 405-425.
Кувичкина Татьяна Николаевна, канд. биол. наук науч. сотр., kuvaiibpm.pushchino. ru, Россия, Пущино, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, обособленное подразделение Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Федеральный исследовательский центр «Пущинский научный центр биологических исследований Российской академии наук»,
Носулич Виктория Евгеньевна, студент victorianosulich'amail.ru, Россия, Самара, Самарский национальный исследовательский университет им. С.П. Королева,
Капаруллина Елена Николаевна, канд. биол. наук, ст. науч. сотр., lenokap80aigmail. com, Россия, Пущино, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН обособленное подразделение Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Федеральный исследовательский центр «Пущинский научный центр биологических исследований Российской академии наук»,
Доронина Нина Васильевна, д-р. биол. наук вед. науч. сотр., doroninaaiibpm.pushchino.ru, Россия, Пущино, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН обособленное подразделение Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Федеральный исследовательский центр «Пущинский научный центр биологических исследований Российской академии наук»,
Макаренко Александр Александрович сотрудник, sansunoaimail. ru, Россия, Самара, ООО Эмульсионные технологии,
Решетилов Анатолий Николаевич, д-р. хим. наук, проф., зав. лабораторией, anatolaiibpm.pushchino. ru, Россия, Пущино, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН обособленное подразделение Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Федеральный исследовательский центр «Пущинский научный центр биологических исследований Российской академии наук»
PHENOL AND CATHECHOL OXIDATION BY IMMOBILIZED CELLS OF ACTINOBACTERIA RHODOCOCCUS GORDONIAE LETO
T. N. Kuvichkina, V. E. Nosulich, E. N. Kaparullina, N. V. Doronina, A. A. Makarenko, A. N. Reshetilov
A phenol and catechol degrading bacterium, designated strain Leto, was isolated from the soil of the industrial zone of Samara city. The isolate is represented by gram-positive nonmotile short ovoid rods. It grows optimally at 28-37°С andpH 7.5 with 0.25 g /1 of phenol as the sole source of carbon and energy, as well as on a wide range of polycarbon substrates (carbohydrates, alcohols and organic acids). Sequencing of the 16S rRNA gene of Leto strain revealed a high similarity (99.7%) with Rhodococcus gordoniae W4937T, which gave reason to attribute the isolate to this species. The oxidation of phenol and catechol by immobilized Rhodococcus gordoniae Leto cells on an amperometric biosensor in the range from 100 to 500 ¡jM was studied.
Key words: Rhodococcus, destructor of phenol and catechol, microorganism, am-perometric biosensor, oxygen electrode.
Kuvichkina Tatiana Nikolaevna, Ph.D. research scientist, kuv@ibpm.pushchino.ru, Russia, Pushchino, Ministry of Science and Higher Education of the Russian Federation, Sci-
ence "Federal Research Center "Pushchino Scientific Center for Biological Research of the Russian Academy of Sciences" G.K. Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms RAS,
Nosulich Victoria Evgenievna, student, victorianosulichaimail. ru, Russia, Samara, S.P. Korolev Samara National- Research University,
Kaparullina Elena Nikolaevna, Ph.D. senior scientist, lenokap8((aigmail. com, Russia, Pushchino, Ministry of Science and Higher Education of the Russian Federation, Science "Federal Research Center "Pushchino Scientific Center for Biological Research of the Russian Academy of Sciences" G.K. Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms RAS,
Doronina Nina Vasilievna, Doctor of Biological Sciences Leading Researcher, do-roninaaiibpm.pushchino. ru, Russia, Pushchino, Ministry of Science and Higher Education of the Russian Federation, Science "Federal Research Center "Pushchino Scientific Center for Biological Research of the Russian Academy of Sciences" G.K. Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms RAS,
Makarenko Aleksandr Aleksandovichr research scientist sansunoaimail.ru, Russia, Samara Emulsion technology,
Reshetilov Anatoliy Nikolaevich, doctor of chemical sciences, professor, head of laboratory, anatolaiibpm.pushchino. ru, Russia, Pushchino, Ministry of Science and Higher Education of the Russian Federation, Science "Federal Research Center "Pushchino Scientific Center for Biological Research of the Russian Academy of Sciences" G.K. Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms RAS
