CC BY
93
УДК 579.22
ШТАММЫ PSEUDOMONAS EXTREMA USTRALIS 7-31 И PSEUDOMONAS FLUORESCENS 7-41, ДЕГРАДИРУЮЩИЕ АЛИФАТИЧЕСКИЕ И АРОМАТИЧЕСКИЕ УГЛЕВОДОРОДЫ
О.И. Сазонова, А.А. Ветрова, Р.А. Стрелецкий, А.Б. Гафаров, И.А. Кошелева, А.Е. Филонов, С.Л. Соколов
Исследованы два штамма рода Pseudomonas - 7-31 и 7-41, выделенные из сайтов нефтяных месторождений Нефтеюганского района Ханты-Мансийского автономного округа - Югры. Микроорганизмы способны к катаболизму алифатических и ароматических углеводородов, деградируют нефть при температуре 24°С. На основании анализа последовательности гена 16S рРНК штамм 7-31 был отнесен к виду P. extremaustralis, а штамм 7-41 к P. fluorescens. Показано, что в клетках бактерий 7-31 и 7-41 присутствуют катаболические плазмиды группы несовместимости Р-7размером 150 т.п.н. и 210 т.п.н., соответственно. Анализ исследуемых штаммов на наличие известных последовательностей генов катаболизма ароматических и алифатических углеводородов показал, что они одновременно содержат последовательности генов нафталин-1,2-диоксигеназы (nahAc), салицилат-1-гидроксилазы (nahG), а также гена мета-пути расщепления катехола - катехол-2,3-диоксигеназы (nahH), что свидетельствует о присутствии в данных штаммах «классических» оперонов катаболизма нафталина. Специфичная амплификация гена алкан гидроксилазы, alkß, также наблюдалась у изучаемых микроорганизмов.
Ключевые слова: Pseudomonas sp., alkB, nahG, nahAc, nahH, нефть, деградация, плазмиды группы несовместимости Р-7
Нефть является одним из важных энергетических ресурсов и сырьем для химической промышленности. Однако, из-за случайных разливов в результате ее добычи, транспортировки и переработки возникают серьезные экологические проблемы, особенно если разливы происходят в большом масштабе. Биоремедиация является более эффективной, экономически выгодной и универсальной альтернативой физико-химической обработке загрязненных сайтов. Алифатические, разветвленные и циклоалифатические алканы, а также различные моно - и полициклические ароматические углеводороды являются наиболее распространенными углеводородами, входящими в состав нефти и продуктов ее переработки. Несмотря на то, что почвенные микроорганизмы утилизируют широкий класс субстратов, для очистки территорий, загрязненных таким сложным комплексом углеводородов, внимание исследователей до настоящего времени было сфокусировано на совместном участии/использовании микроорганизмов, обладающих различными генетическими системами катаболизма углеводородов. Несомненный интерес для биоремедиации представляют индивидуальные
штаммы, способные к катаболизму широкого спектра субстратов, относящихся к различным классам углеводородов.
Известно, что бактерии рода Pseudomonas способны к деструкции различных компонентов нефти, таких как алифатические и моно- и полициклические ароматические углеводороды (ПАУ), гетероциклические, галогенированные и метилированные органические соединения. Часто эта способность контролируется мобильными генетическими элементами, прежде всего плазмидами, которые играют основную роль в процессе горизонтального переноса генов и генетических систем биодеградации, тем самым способствуя быстрой адаптации микроорганизмов сообщества к изменяющимся условиям среды обитания [1]. Хорошо изучена организация и регуляция генов деградации n-алканов на примере октановой плазмиды (OCT) группы несовместимости P-2 из штамма P. putida GPol (ранее P. oleovorans GPo1) [2]. С развитием геномного секвенирования было обнаружено, что хромосомная локализация более характерна для alk - генов [3]. В то же время опероны катаболизма моно- и полициклических ароматических углеводородов у псевдомонад обычно располагаются на конъюгативных плазмидах большого размера, относящимся к группам несовместимости P-2, P-7 и P-9 [4-12].
Многие факторы, такие как физические условия, питание, различное соотношение присутствующих структурных углеводородов, биодоступность субстрата, могут влиять на биоремедиацию загрязненных нефтью почв [13]. С этим же связывают то, что один штамм может разлагать только один вид или определенный тип соединений, входящих в состав сырой нефти и продуктов ее переработки. В последние годы обнаруживают микроорганизмы, которые способны и к деградации алканов, и к деградации ПАУ [14]. Присутствие систем катаболизма и алифатических и ароматических углеводородов в пределах одного бактериального штамма позволит использовать его в качестве перспективного объекта для исследования механизма деградации углеводородов нефти и выявления факторов, которые могут ограничивать эффективность этого процесса.
Цель работы - изучение деградативных свойств в отношении нефти и анализ генетических систем деградации ПАУ и н-алканов у двух штаммов рода Pseudomonas, способных к катаболизму как ароматических, так и алифатических соединений.
Материалы и методы
Штаммы микроорганизмов, использованные в работе, были выделены методом накопительного культивирования в жидкой минеральной среде Эванса [15] при рН=5,0 с 10 % нефти (по объему) и 3% хлорида натрия (по массе) при температуре 7°С в течение 20 суток.
Для определения спектра утилизируемых субстратов микроорганизмы культивировали в пробирках с жидкой минеральной средой Эванса с добавлением углеводородов в концентрации 2% (по массе/объему) при температуре 24°С в течение 10 суток. В качестве единственного источника углерода и энергии в минеральную среду добавляли один из следующих углеводородов: нафталин, фенантрен, октан, додекан, толуол, о-ксилол, п-ксилол, м-ксилол, ундекан, протокатехоат, этилбензол, декан, флуорен, нонан, 4 -метилкатехол, антрацен, пирен, камфора, гексадекан, ß-метилнафталин, фенол или салицилат. Рост культур определяли визуально по помутнению среды.
Для оценки степени деградации нефти бактерии культивировали в 100 мл жидкой минеральной среды Эванса с 2% (об/об) нефти при температуре 24°С в течение 10 суток. Инокулирование колб проводили
у
суспензией микроорганизмов (посевная доза 2,5*10 КОЕ/мл). Остаточное содержание углеводородов нефти в среде определяли методом газовой хроматографии в соответствии с ГОСТ 31953 -2012 [16]. Для проведения измерений использовался газовый хроматограф с пламенно-ионизационным детектором «Agilent 6890N» (Agilent, США) и капиллярная колонка типа DB-1 (30м*0,25мм*0,50мкм). Условия хроматографирования: скорость газа носителя (гелий) - 1 см /мин, скорость подачи воздуха - 400 см /мин, скорость подачи водорода - 40
3 3
см /мин, скорость поддувки гелием - 39 см /мин, температура детектора -320°С, температура испарителя - 350°С. Температурная программа: изотермический режим 1 мин при начальной температуре 60°С, линейное программирование 5 °С/мин до 90 °С, линейное программирование 10°С/мин до температуры 320°С, изотермический режим 10 мин. Степень деградации углеводородов оценивали по сравнению с контролем (колба с минеральной средой Эванса и нефтью без микроорганизмов).
Геномную ДНК бактерий выделяли с использованием набора реагентов diaGene (Россия). Выделение плазмидной ДНК проводили методом щелочного лизиса [17] c некоторыми модификациями.
Для гидролиза препаратов плазмидных ДНК использовали буферный раствор и эндонуклеазу рестрикции EcoRI фирмы "Fermentas" (Литва). Общий объем реакционной смеси составлял 40 мкл. Обработку ДНК эндонуклеазой рестрикции проводили по протоколу фирмы-изготовителя при 37°С в течение 1,5 - 2 часов. Реакцию останавливали прогреванием при 65°С в течение 15 минут.
Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) осуществляли в термоциклере GeneAmp PCR System 9700 («Applied Biosystems», США). Реакцию проводили в объеме 25 мкл. Смесь для ПЦР содержала: буфер для фермента (10 мМ Трис-HCl (pH 8,4), 50 мкМ KCl, 0,1 мкг/мкл желатина), ДНК - матрицу, 18 пМ каждого праймера, дезоксирибонуклеозидтрифосфаты в конечной концентрации 200 мкМ, 1,5
мМ или 2 мМ MgCl2 (для амплификации гена nahAc) и 1,5-2,5 единицы ДНК полимеразы DreamTaq фирмы «Thermo Scientific» (США). Для амплификации гена салицилат гидроксилазы (nahG) в смесь в качестве денатурирующего агента добавляли диметилсульфоксид (ДМСО) («Sigma», США) до конечной концентрации 5%. Нуклеотидная последовательность, температура отжига праймеров и размер ПЦР продуктов приведены в табл. 1.
Таблица 1
ПЦР праймеры, использованные в работе
Ген Праймеры Нуклеотидная последовательность (5'^3') Температура отжига, оС Размер ПЦР продукта, п.н. Ссылка
16S рРНК 27f 1492r AGAGTTTGATCCTGGCTCAG GGTTACCTTGTTACGACTT 52 1484 [18]
alkB alcBF alcBR TAC GGN CAC TTY TAC VYC GA CCR TAR TGY TCG AGR TAG TT 50 344 [19]
nahAc Ac149f Ac1014r CCC YGG CGA CTA TGT CTC RGG CAT GTC TTT TTC 43 865 [20]
nahG shc1_up shc1 lo CGG CKT THG GTG ARG TCG GTG C GGC GAG GAA RTA GGC GTC CTC AAG 64 893 [21]
nahH 23OF 23OR ATG GAT DTD ATG GGD TTC AAG GT ACD GTC ADG AAD CGD TCG TTG AG 52 721 [22]
nagG sgp319F 1238R TGCCCCTAYCAYCARTGG CGCCAGTABTBGTACATGCC 51 920 [11]
IncP-9 repAB repF repR CCAGCGCGGTACWTGGG GTCGGCAICTGCTTGAGCTT 54 554 [23]
IncP-7 rep- область Upper Lower CCCTATCTCACGATGCTGTA GCACAAACGGTCGTCAG 52 524 [24]
Полученные ПЦР-продукты очищали, используя GeneJET PCR Purification Kit («Thermo Scientific», США) по протоколу фирмы-изготовителя [25].
Определение нуклеотидной последовательности ампликонов проводили на секвенаторе Applied Biosystems 3130x1 с использованием набора для секвенирования BigDye v.3.1. Анализ идентичности нуклеотидных последовательностей выполняли с помощью программы BLASTN [26].
Для гидролиза препаратов плазмидных ДНК использовали буферный раствор и эндонуклеазу рестрикции EcoRI фирмы «Fermentas» (Литва). Общий объем реакционной смеси составлял 40 мкл. Обработку ДНК эндонуклеазой рестрикции проводили по протоколу фирмы-изготовителя при 37 °С в течение 1,5 - 2 часов. Реакцию останавливали прогреванием при 65°С в течение 15 минут.
Электрофорез проводили в горизонтальном агарозном геле [17]. Для этого использовали 0,8-1% агарозу и 0,5 * трис-боратный буфер. Визуализацию ДНК проводили путем добавления бромистого этидия в агарозу в конечной концентрации 0,5 мкг/мл. Для нанесения проб использовали буфер следующего состава: 0,025% ксилолцианол, 0,025% бромфеноловый синий, 2,5% фиколл (тип 400).
Пульс-электрофорез препаратов плазмидных ДНК, обработанных эндонуклеазой рестрикции EcoRI, проводили по протоколу фирмы -производителя («Bio-Rad», США).
В качестве маркерной ДНК использовали стандарт Gene Ruler 1 Kb Plus DNA Ladder фирмы «Thermo Scientific» (США), конкатемеры ДНК фага X фирмы «Bio-Rad» (США) и Gene Ruler 2,5 Kb фирмы «Bio-Rad» (США). Изображения получали, используя систему гель-документации Biotest Color (Россия).
Результаты и их обсуждение
Характеристика и идентификация штаммов-деструкторов. Бактериальные штаммы 7-41 и 7-31 были выделены методом накопительного культивирования из сайтов нефтяных месторождений Нефтеюганского района Ханты-Мансийского автономного округа - Югры. Анализ субстратной специфичности изолятов показал, что они способны к активной деградации как линейных алканов длинной С8-С12, так и ароматических углеводородов, таких как нафталин, ß-метилнафталин в жидкой минеральной среде Эванса при температуре 24°С через 7 суток. Слабый рост бактерий наблюдался в среде с салицилатом, который обладает бактерицидным действием. Штамм микроорганизма 7-31 также был способен к росту в среде с протокатехоатом, в отличие от 7-41. Исследуемые бактерии не росли на средах со следующими углеводородами: фенантрен, антрацен, пирен, флуорен, камфора, этилбензол, фенол, 4-метилкатехол.
Видовую принадлежность выделенных штаммов определяли по культурально-морфологическим признакам, а также определением нуклеотидной последовательности фрагмента гена 16S рРНК. Анализ полученных данных позволил отнести штамм 7-31 к виду P. extremaustralis, а штамм 7-41 к P. fluorescens.
Была проведена оценка эффективности деградации углеводородов изучаемыми штаммами в жидкой минеральной среде с нефтью через 10 суток при температуре 24°С по сравнению с контролем. Каждый вариант системы использовался в трех повторах.
Наибольшая степень деградации нефти была выявлена у штамма P. extremaustralis 7-31 и составила около 49%, что подтверждается данными остаточного содержания углеводородов различных фракций (табл. 2). В состав среднекипящей фракции входят полициклические ароматические,
циклические и ненасыщенные углеводороды. Причем данный микроорганизм в большей степени способен к деструкции углеводородов алкановой и среднекипящей фракций, что соотносится с данными субстратной специфичности. Степень деградации нефти штаммом P. fluorescens 7-41 составила 19% через 10 суток, что обусловлено равномерной деструкцией углеводородов всех фракций.
Таблица 2
Остаточное содержание углеводородов в контрольной колбе и колбах с _микроорганизмами_
Система Фракции углеводородов Остаточное содержание углеводородов, мг/дм3
контроль Алкановая (н-алканы С12-С36) 511,21±77,17*
среднекипящая 3101,13±465,36
высококипящая 2365,41±355,27
7-31 Алкановая (н-алканы С12-С36) 268,07±40,42
среднекипящая 1255,42±188,34
высококипящая 1506,38±226,44
7-41 Алкановая (н-алканы С12-С36) 428,12±64,31
среднекипящая 2498,33±375,49
высококипящая 1908,79±286,18
* Стандартное отклонение
Анализ штаммов-деструкторов на наличие плазмид IncP-7 и IncP-9. Известно, что гены, ответственные за катаболизм различных ксенобиотиков, могут иметь как хромосомную локализацию, так и располагаться на коньюгативных плазмидах большого размера [21]. Методом щелочного лизиса удалось получить препараты плазмидной ДНК обоих изучаемых штаммов. Для определения сходства и различия между выделенными в ходе работы плазмидами проводили рестрикционный анализ препаратов плазмидных ДНК с использованием эндонуклеазы рестрикции EcoRI, фрагменты разделяли в 1%-ном агарозном геле с помощью одномерного пульс-электрофореза по протоколу фирмы-изготовителя («Bio-Rad», США). Результаты RFLP-анализа (restriction fragments length polymorphism) представлены на рис. 1.
RFLP-анализ показал, что несмотря на сходство большинства полос, рестрикционные профили выявленных плазмид отличаются друг от друга. Размер плазмидной ДНК у штамма P. extremaustralis 7-31 составляет около 150 т.п.н., в то время как в P. fluorescens 7-41 присутствует плазмида размером около 21 0 т.п.н.
Плазмиды биодеградации нефти и нефтепродуктов в большинстве случаев относятся к группам несовместимости P-7 и P-9, вносят существенный вклад в биодеградативный потенциал среды и часто обнаруживаются в загрязненных сайтах [21, 24]. В связи с этим с препаратами плазмидных ДНК исследуемых микроорганизмов проводили
ПЦР с праймерами специфичными для 1псР-7 и 1псР-9 репликонов (табл.2). На основании данных ПЦР анализа плазмиды из штаммов Р. ех^ешаш^аШ 7-31 и Р. Аыогезсет 7-41 были отнесены к группе несовместимости Р-7.
Ml 2 М
Рис. 1. RFLP-анализ катаболических плазмид М - маркерная ДНК GeneRuler 2.5 Kb («Bio-Rad», США); 1 - P. extremaustralis 7-31, 2 - P.
fluorescens 7-41
Амплификация генов деградации n-алканов и ароматических углеводородов. Генетический контроль деградации алифатических алканов и ароматических углеводородов исследовали методом ПЦР со специфичными праймерами к последовательностям известных катаболических генов: alkß, nahAc, nahG, nahH и nagG, которые кодируют алкан гидроксилазу, большую субъединицу нафталин 1,2-диоксигеназы, салицилат 1- гидроксилазу, катехол 2,3-диоксигеназу и большую субъединицу оксигеназного компонента салицилат 5-гидроксилазы, соответственно (табл. 1).
Наиболее распространёнными и хорошо изученными в настоящее время оперонами катаболизма н-алканов являются alkBFGHJKL и alkST, впервые обнаруженные у штамма P.putida GPol (ранее P. oleovorans GPol) в составе коньюгативной плазмиды деградации октана - OCT [2, 27]. Данные опероны кодируют белки, участвующие в превращении н-алканов в жирные кислоты. Терминальное окисление алканов инициируется алкан
гидроксилазой, AlkB [28]. Ген alkB, кодирующий алкан гидроксилазу, является маркером для определения биоремедиационного потенциала территорий, загрязненных нефтью [19]. Исследуемые штаммы были протестированы методом полимеразной цепной реакции на наличие данного гена. Специфичная амплификация гена алкан гидроксилазы, alkB, наблюдалась как у штамма P. extremaustralis 7-31, так и у P. fluorescens 741.
Еще одним хорошим генетическим маркером для оценки биодеградативного потенциала микрофлоры загрязнённых нефтью и нефтепродуктами почв является ген nahAc, кодирующий большую субъединицу нафталин-1,2-диоксигеназы [29, 30]. Гидроксилирующие диоксигеназы, к которым относится нафталин-1,2-диоксигеназа, участвуют в начальных стадиях деградации ПАУ у большинства микроорганизмов. Диоксигеназы хорошо изучены и охарактеризованы у различных бактерий [31-34]. При амплификации гена большой субъединицы нафталин-1,2-диоксигеназы с использованием пары праймеров Ac149f и Ас1014г ПЦР-продукты, соответствующего размера были получены у обоих штаммов.
Как известно, окисление ароматических соединений осуществляется в несколько этапов, но, в конечном счете, пути деградации различных ароматических субстратов сводятся к нескольким ключевым реакциям и одним и тем же промежуточным метаболитам. Одним из таких интермедиатов является салицилат [35-37]. В настоящее время у микроорганизмов известны два пути деградации салицилата: во-первых, трансформация его в катехол с помощью салицилат 1-гидроксилазы с дальнейшим расщеплением последнего по орто- или мета-пути; во-вторых, окисление его салицилат 5-гидроксилазой до гентизиновой кислоты. Методом ПЦР со специфичными праймерами показано, что у штаммов P. extremaustralis 7-31 и P. fluorescens 7-41 присутствуют последовательности генов салицилат 1-гидроксилазы, nahG и катехол 2,3-диоксигеназы, nahH. При амплификации гена nagG ПЦР-продуктов не было получено.
Таким образом, штаммы P. extremaustralis 7-31 и P. fluorescens 7-41 одновременно содержат последовательности генов нафталин-1,2-диоксигеназы, салицилат-1-гидроксилазы, а также гена деградации салицилата по мета-пути расщепления катехола - катехол 2,3-диоксигеназы, что свидетельствует о присутствии в данных штаммах «классических» оперонов катаболизма нафталина [24]. Поскольку наличие гена nahH является косвенным свидетельством плазмидной локализации катаболических оперонов [38], то, весьма вероятно, что у исследуемых штаммов псевдомонад гены биодеградации нафталина также расположены на плазмидах.
Выводы
В ходе настоящей работы выделены два штамма рода Pseudomonas - деструкторы как ароматической, так и алифатической фракций нефти; микроорганизмы одновременно обладают генами, кодирующие ферменты деградации алифатических алканов и полициклических ароматических углеводородов. Штаммы P. extremaustralis 7-31 и P. fluorescens 7-41 могут являться перспективными агентами биопрепаратов для очистки окружающей среды от нефти и нефтепродуктов. В дальнейшем предполагается провести полногеномное секвенирование выделенных микроорганизмов для определения вероятных путей деградации н-алканов и ПАУ, а также роли обнаруженных плазмид в распространении биодеградативных признаков.
Список литературы
1. Smalla K., Jechalke S., Top E.M. Plasmid detection, characterization, and ecology// Microbiology Spectrum. 2015. V. 3(1). P. 1-14.
2. Analysis of Pseudomonas putida alkane degradation gene clusters and flanking insertion sequences: evolution and regulation of the alk-genes/ van Beilen J.B., Panke S., Lucchini S. [et al]// Microbiology. 2001. V. 147. P. 16211630.
3. Rojo F. Degradation of alkanes by bacteria // Environmental Microbiology. 2009. V. 11 (10). P. 2477-2490.
4. Kivisaar M., Kasak L., Nurk A. Sequence of the plasmid-encoded catechol 1,2-dioxygenase- expressing gene, pheB, of phenol-degrading Pseudomonas sp. strain EST1001 // Gene. 1991. V. 98(1). P. 15-20.
5. Complete sequence of the IncP-9 TOL plasmid pWW0 from Pseudomonas putida / Greated A., Lambertsen L., Williams P.A. [et al]// Environmental Microbiology. 2002. V. 4 (12). P.856-871.
6. Tsuda M., Iino T. Naphthalene degrading genes on plasmid NAH7 are on a defective transposon // Molecular and General Genetics. 1990. V. 223. P. 33-39.
7. Identification and characterization of the conjugal transfer region of the pCg1 plasmid from naphthalene degrading Pseudomonas putida Cg1/ Park W., Jeon C.O., Hohnstoch-Ashe A.M. [et al] // Applied and Environmental Microbiology. 2003. V. 69. P. 3263-3271.
8. Habe H., Omori T. Genetics of polycyclic aromatic hydrocarbon metabolism in diverse aerobic bacteria //Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 2003. V.67. P.225-243.
9. Dennis J.J., Zylstra G.J. Complete sequence and genetic organization of pDTG1, the 83 kilobase naphthalene degradation plasmid from Pseudomonas putida strain NCIB 9816-4 // Journal of molecular biology. 2004. V. 341(3). P. 753-768.
10. Conjugal transfer and mobilization capacity of the completely sequenced naphthalene plasmid pNAH20 from multiplasmid strain Pseudomonas fluorescens PC20 / E. Heinaru, E. Vedler, J. Jutkina [et al]// FEMS microbiology ecology. 2009. V. 70. P. 563-574.
11. The organization of naphthalene degradation genes in Pseudomonas putida strain AK5 / T.Y. Izmalkova, O.I. Sazonova, M.O. Nagornih [et al]// Research in microbiology. 2013. V. 164. P. 244-253.
12. Complete nucleotide sequence and organization of the naphthalene catabolic plasmid pND6-1 from Pseudomonas sp. strain ND6 / W. Li, J. Shi, X. Wang [et al] //Gene. 2004. V. 336(2). P.231-240.
13. Recent advances in petroleum microbiology / J.D. Close, Van Hamme, A. Singh [et al] // Microbiology and Molecular Biology Reviews. 2003. V. 67. P. 503-549.
14. Degradation of n-alkanes and polycyclic aromatic hydrocarbons in petroleum by a newly isolated Pseudomonas aeruginosa DQ8 / Z. Zhang, Z. Hou, C. Yang [et al] // Bioresource Technology. 2011. V. 105 (5). P.4111-4116.
15. Evans C.G.T., Herbert D., Tempest D.W. The continuous culture of microorganisms 2. Construction of a chemostat: Methods in microbiology. V.2. /Eds.: Norris J.R., Ribbons D.W. London: Acad. Press, 1970. P. 277-327.
16. ГОСТ 31953-2012. Вода. Определение нефтепродуктов методом газовой хроматографии.
17. Маниатис Т., Фрич Э., Самбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М., Мир. 1984. 480 c.
18. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study / W.G. Weisburg, S.M. Barnes, D.A. Pelletier [et al] // Journal of Bacteriology.1991. V. 73. P. 697-703.
19. Dynamic changes in the structure of microbial communities in the Baltic sea coastal seawater microcosms modified by crude oil, shale oil or diesel fuel / S. Viggor, J. Juhanson, M. Jöesaar [et al] // Microbiological Research. 2013. V. 168 №7. P. 415-427.
20. Coexistence of two distinct copies of naphthalene degradation genes in Pseudomonas strains isolated from the western mediterranean region/ М. Ferrero, E. Llobet-Brossa, J. Lalucat [et al] // Applied and Environmental Microbiology. 2002. V. 68. P. 957-962.
21. Molecular classification of IncP-9 naphthalene degradation plasmids/ T. Yu. Izmalkova, D. V. Mavrodi, S. L. Sokolov [et al] // Plasmid. 2006. V. 56. P. 1-10.
22. DNA recovery and PCR quantification of catechol-2,3-dioxygenase genes from different soil types/ P. Wilkstrom, A. Wilklund, A.C. Anderson [et al] // Journal of biotechnology. 1996. V. 52. P. 107-120.
23. Greated A., Thomas C.M. A pair of PCR primers for IncP-9 plasmids // Microbiology. 1999. V.145. P.3003-3004.
24. Плазмиды биодеградации нафталина и салицилата Р-7 группы несовместимости в штаммах флуоресцирующих псевдомонад/ Т.Ю. Измалкова, О.И. Сазонова, С.Л. Соколов [и др.] // Микробиология. 2005. Т.74(3). С. 342 -348.
25. URL:https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K0702
26. URL:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ BLAST
27. van Beilen J.B., Wubbolts M.G., Witholt B. Genetics of alkane oxidation by Pseudomonas oleovorans // Biodegradation. 1994. V. 5 (3-4). P. 161-174.
28. van Beilen J.B., Funhoff E.G. Alkane hydroxylases involved in microbial alkane degradation // Applied Microbiology and Biotechnology. 2007. V.74. P. 13-21.
29. Laurie A.D., Lloyd-Jones G. Quanification of phnAc and nahAc in contaminated New Zealand soils by competitive PCR // Applied and Environmental Microbiology. 2000. V. 66. P. 1814-1817.
30. Abundance and diversity of soil petroleum hydrocarbon-degrading microbial communities in oil exploring areas/ Y.Y. Yang, J. Wang, J.Q. Liao [et al] // Applied Microbiology and Biotechnology. 2015. V. 99. P. 1935-1946.
31. Ensley B.D., Gibson D.T. Naphthalene dioxygenase: purification and properties of a terminal oxygenase component // Journal of Bacteriology. 1983. V. 155 (2). P. 505-511.
32. Resnick S.M., Lee K., Gibson D.T. Diverse reactions catalyzed by naphthalene dioxygenase from Pseudomonas sp. strain NCIB 9816 // Journal of Industrial Microbiology. 1996. V. 17 (5-6). P. 438-457.
33. Purification and Characterization of a Novel Naphthalene Dioxygenase from Rhodococcus sp. Strain NCIMB12038 / M.J. Larkin, C.C.R. Allen, L.A. Kulakov [et al] // Journal of Bacteriology. 1999. V. 181(19). P. 6200-6204.
34. Joaunneau Y., Meyer C., Duraffourg N. Dihydroxylation of four- and five-ring aromatic hydrocarbons by the naphthalene dioxygenase from Sphingomonas CHY-1 // Applied Microbiology and Biotechnology. 2016. V. 100. P. 1253-1263.
35. Davies J.I., Evans W.C. Oxidative metabolism of naphthalene by soil pseudomonas: The ring-fission mechanism // Journal of Biochemistry. 1964. V.91. P. 251-261.
36. Evans W.C., Fernley H.N. Griffiths E. Oxidative metabolism of phenantrene and anthracene by soil pseudomonads: the ring-fission mechanism // Journal of Biochemistry. 1965. V. 95. P. 819-831.
37. Doddamani H. P., Ninnekar H. Z. Biodegradation of carbaryl by a Micrococcus species // Current Microbiology. 2001. V. 43. P. 69-73.
38. Analysis and manipulation of plasmid-encoded pathways for the catabolism of aromatic compounds by soil bacteria / K.N. Timmis, P.R. Lehrbach, S. Harayama [et. al.] // Plasmids in Bacteria. 1985. P.719-739.
Сазонова Олеся Ивановна - канд. биол. наук, науч. сотр., olesya.sazonova1@gmail. com, Россия, Пущино, Федеральный исследовательский центр «Пущинский научный центр биологических исследований Российской академии наук»,
Ветрова Анна Андрияновна - канд. биол. наук, науч. сотр., phdvetrovaagmail. com, Россия, Пущино, Федеральный исследовательский центр «Пущинский научный центр биологических исследований Российской академии наук»,
Стрелецкий Ростислав Александрович - канд. биол. наук, ст. науч. сотр., streletskiyrostislavqmail.ru, Россия, Москва, Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова,
Гафаров Арслан Булатович - науч.сотр., gafarov@,ibpm.pushchino. ru, Россия, Пущино, Федеральный исследовательский центр «Пущинский научный центр биологических исследований Российской академии наук»,
Кошелева Ирина Адольфовна - канд. биол. наук, ст. науч. сотр., koshelevaa ibpm.pushchino.ru, Россия, Пущино, Федеральный исследовательский центр «Пущинский научный центр биологических исследований Российской академии наук»,
Филонов Андрей Евгеньевич - д-р биол. наук, вед. науч.сотр., filonov.andreyaibpm.pushchino.ru, Россия, Пущино, Федеральный исследовательский центр «Пущинский научный центр биологических исследований Российской академии наук»,
Соколов Сергей Львович - канд. биол. наук, науч.сотр, slsa ibpm.pushchino.ru, Россия, Пущино, Федеральный исследовательский центр «Пущинский научный центр биологических исследований Российской академии наук»
THE PSEUDOMONAS EXTREMA USTRALIS 7-31 AND PSEUDOMONAS FLUORESCENS 7-41 DEGRADING ALIPHATIC AND AROMATIC
HYDROCARBONS
O. I. Sazonova, A. A. Vetrova, R.A. Streletsky, A.B. Gafarov, I. A. Kosheleva, A. E. Filonov, S. L. Sokolov
Pseudomonas spp. strains 7-31 and 7-41 isolated from oil fields sites of Nefteyugansk district of Khanty-Mansiysk Autonomous Okrug - Yugra are able to degrade aliphatic and aromatic hydrocarbons. Strains are capable of destruction of crude oil at the temperature of 24°C. Pseudomonas spp. 7-31 and 7-41 bear IncP-7 degradative plasmids of 150 kb and 210 kb in size, respectively. The strains contain sequences of the genes coding naphthalene-1,2-dioxygenase (nahAc), salicylate-1-hydroxylase (nahG), as well as the gene of salicylate degradation by the meta-pathway of catechol cleavage - catechol-2,3-dioxygenase (nahH), which indicates the presence of "classical" operons of naphthalene ca-tabolism in these strains. Specific amplification of the alkane hydroxylase gene, alkB, was also observed in the studied microorganisms.
Key words: Pseudomonas sp., alkB, nahG, nahAc, nahH, oil, degradation, p-7plas-mids of incompatibility group
Sazonova Olesya Ivanovna - candidate of biological sciences, researcher, olesya. sazonova1 agmail. com, Russia, Pushchino, Federal research center "Pushchino Research Center of biological researches of the Russian Academy of Sciences ",
Vetrova Anna Andriyanovna - candidate of biological sciences, researcher, phdvetrovaagmail. com, Russia, Pushchino, Federal research center "Pushchino Research Center of biological researches of the Russian Academy of Sciences ",
Streletsky Rostislav Aleksandrovich - candidate of biological sciences, researcher, streletskivrostislav a mail.ru, Russia, Moscow, Lomonosov Moscow State University,
Gafarov Arslan Bulatovich, researcher, gafarovaibpm.pushchino. ru, Russia, Pushchino, Federal research center "Pushchino Research Center of biological researches of the Russian Academy of Sciences ",
Kosheleva Irina Adolfovna - candidate of biological sciences, koshelevaaibpm.pushchino. ru, researcher, Russia, Pushchino, Federal research center "Pushchino Research Center of biological researches of the Russian Academy of Sciences ",
Filonov Andrei Evgeneevich - doctor of biological sciences, researcher, filonov. andreya ibpm.pushchino. ru, Russia, Pushchino, Federal research center "Pushchino Research Center of biological researches of the Russian Academy of Sciences ",
Sokolov Sergei Lvovich - candidate of biological sciences, scientific researcher, slsaibpm.pushchino. ru, Russia, Pushchino, Federal research center "Pushchino Research Center of biological researches of the Russian Academy of Sciences "
