Галотолерантные бактерии-деструкторы полициклических ароматических углеводородов рода Arthrobacter Текст научной статьи по специальности «Экологические биотехнологии»

ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА

2007 Биология Вып. 5 (10)

УДК 579.222:579.252.5:579.871.2

ГАЛОТОЛЕРАНТНЫЕ БАКТЕРИИ-ДЕСТРУКТОРЫ ПОЛИЦИКЛИЧЕСКИХ АРОМАТИЧЕСКИХ УГЛЕВОДОРОДОВ РОДА ARTHROBACTER

О. В. Ястребова3, Е. Г. Плотниковаа,ь

аИнститут экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, 614081, Пермь, ул. Голева, 13 ьПермский государственный университет, 614990, Пермь, ул. Букирева, 15

Методом накопительных культур из почв и донных отложений района солеразработок выделено пять штаммов бактерий рода Аг^гоЬа^ег, способных к росту на нафталине как единственном источнике углерода и энергии при содержании 1 М №С1 в среде культивирования. Штамм А. globiformis SF27 утилизирует фенантрен в присутствии 1 М №С1. Установлены пути метаболизма фенантрена клетками Аг^гоЬа^ег sp. В1 через образование 1,2-ди-гидроксинафталина, салицилата и клетками А. globiformis SF27 - через 1-гидрокси-2-нафтоат, 2-карбоксибензальдегид, орто-фталат. В штаммах А. globiformis DF14, SF27 и А. тсо^апае SN17 обнаружены плазмиды размером 120 т.п.н. и 85 т.п.н.

В большинстве случаев загрязнение объектов окружающей среды в промышленных районах носит комплексный, полихимический характер. Наряду с повышенным содержанием поллютантов, к которым относятся моно- и полиароматические углеводороды (ПАУ), почвы и водоемы могут подвергаться воздействию других экстремальных факторов, в частности высокой минерализации. Возможность микробной деструкции ПАУ в данных условиях определяется устойчивостью бактерий к повышенному содержанию солей и способностью проявлять при этом биодеградативные свойства (Kastner et al., 1998; Boonchan et al., 2000).

В последние годы появляется все больше публикаций о грамотрицательных и грамположитель-ных бактериях, способных разлагать широкий спектр токсичных органических соединений различной химической природы, обладающих устойчивостью к экстремальным условиям существования, в том числе к высокой минерализации среды (Luz et al., 1997; Kastner et al., 1998). В то же время, процессы утилизации ПАУ более подробно изучены у грамотрицательных бактерий, в частности у бактерий родов Pseudomonas и Burkholderia (Yen, Serdar, 1988; Laurie, Lloyd-Jones, 1999). Имеются лишь единичные работы о подробных исследованиях биохимических путей и генетических системах разложения нафталина и фенантре-на у грамположительных бактерий (Keuth, Rehm, 1991; Boldrin et al., 1993; Kanaly, Harayama, 2000).

Ранее, из образцов почв и донных отложений района солеразработок нами были выделены бактериальные культуры, отнесенные к родам Pseudomonas, Rhodococcus, Arthrobacter, Bacillus, а

также сообщества микроорганизмов, способные использовать нафталин, фенантен и бифенил в качестве единственного источника углерода и энергии (Алтынцева, 2001; Плотникова и др., 2001).

Цель исследования - изучение бактерий рода Arthrobacter, способных к деструкции нафталина и фенантрена в условиях повышенной минерализации среды.

Методы исследования

Бактериальные культуры. В работе использованы бактериальные штаммы, выделенные из почв и донных отложений, загрязненных отходами химических производств (г. Березники, Пермская область): Arthrobacter globiformis SF27, Arthrobac-ter globiformis DF14, Arthrobacter nicotianae SN17, Arthrobacter sp. В45 и Arthrobacter sp. В1 (Алтынцева, 2001; Плотникова и др., 2001).

Среды и условия культивирования. Для роста микроорганизмов использовали минеральную среду Раймонда (Розанова, Назина, 1982) с разным содержанием хлорида натрия. В качестве полноценной среды использовали модифицированную среду Раймонда при добавлении 5 г/л триптона и 2.5 г/л дрожжевого экстракта. Нафталин, фенан-трен, бифенил использовали как субстраты в концентрации 1 г/л при культивировании в жидкой минеральной среде. При выращивании микроорганизмов на агаризованных средах добавляли нафталин и бифенил, которые наносили на крышку перевернутой чашки Петри. Культивирование проводили при температуре 28°С.

© О. В. Ястребова, Е. Г. Плотникова, 2007

Ростовые характеристики штаммов-деструкторов изучались в периодической культуре. Оптическую плотность (ОД) определяли на ФЭК-56М при длине волны 540 нм и толщине кюветы 0.5 см. Количество колониеобразующих единиц (КОЕ) определяли методом серийных разведений с последующим высевом и подсчетом колоний микроорганизмов на чашках с агаризованной полноценной средой.

Плазмидную ДНК выделяли модифицированным методом щелочного лизиса (Marco et. al., 1982), методом Бабыкина (Бабыкин и др., 1984), методом Портного-Уайта (Методы общей бактериологии, 1983).

Электрофорез в агарозном геле осуществляли в соответствии с рекомендациями (Маниатис и др., 1984).

Элиминация бактериальных плазмид была выполнена согласно стандартной методике (Rheinwald et al., 1973).

Анализ метаболитов проводили методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) с применением пластин Silufol UV 254 (Kavalier, Чехия) и системы растворителей гексан : этилацетат : уксусная кислота (10:3:1). Пластины анализировали под ультрафиолетом (254 нм).

Результаты и обсуждение

Характеристика бактерий-деструкторов

Выделенные из почв и донных отложений, загрязненных отходами химических и соледобывающего предприятий, 5 штаммов-деструкторов нафталина и фенантрена были идентифицированы как представители рода Arthrobacter. Штаммы

SF27 (=ВКМ Ас-2063) и DF14 (=ВКМ Ас-2064) отнесены к виду "A. globiformis", штамм SN17 (=ВКМ Ас-2065) определен как представитель вида "A. nicotianae". Два бактериальных штамма -В1 и В45 до вида не определены (Алтынцева, 2001; Плотникова и др., 2001).

Исследуемые бактериальные культуры были проверены на способность к утилизации ряда ароматических соединений и продуктов их метаболизма. Установлено, что все штаммы растут на нафталине и салицилате. Два штамма A. globi-formis - SF27 и DF14, способные к эффективному росту на фенантрене, утилизируют возможные продукты его метаболизма - 1-гидрокси-2-нафтоат и орто-фталат, а также растут на гентизате - одном из основных метаболитов нафталина. Штамм A. nicotianae SN17 способен к росту на нафталине и его ключевых метаболитах (табл. 1).

Методом ТСХ были определены продукты метаболизма разложения нафталина и фенантрена у A. globiformis SF27 и Arthrobacter sp. В1. Установлено, что при росте на фенантрене в среде культивирования штамма A. globiformis SF27 присутствуют 1-гидрокси-2-нафтоат и два неидентифици-рованных метаболита. В среде культивирования штамма Arthrobacter sp. В1 были зафиксированы 1-гидрокси-2-нафтоат, 1,2-дигидрокси-нафталин и аналогичные неидентифицированные продукты.

При выращивании штаммов SF27, В1 и В45 на нафталине установлено, что в среде культивирования всех трех штаммов в низкой концентрации присутствует салицилат. В культуральной среде A. globiformis SF27 обнаружен также катехол, являющийся ключевым метаболитом утилизации салицилата.

Таблица 1

Характеристика бактерий-деструкторов ПАУ рода Arthrobacter

Штамм Ростовые субстраты*

Нафталин Бифенил Фенантрен Салицилат Орто-фталат Г ентизат 1H2N

DF14 + - + + + + +

SF27 + - + + + + ±

SN17 + ± - + + + -

B45 + - - + - - -

B1 + - ± + - - -

Примечание. + - выраженный рост; ± - слабый рост; - - нет роста; 1H2N - 1-гидрокси-2-нафтоат; * рост штаммов проверяли в минеральной среде Раймонда в присутствии 0.5 М №С1.

На основании полученных данных можно предположить, что утилизация нафталина штаммами SF27, В1 и В45 идет по наиболее распространенному у штаммов-деструкторов нафталина пути с образованием салицилата и катехола в качестве ключевых метаболитов и расщеплением катехола по мета- и орто-пути (рис. 1). Утилизация фенантрена штаммом В1 возможна с образо-

ванием 1,2-дигидрокси-нафталина и салицилата в качестве основных метаболитов, а штаммом A. globiformis SF27 - с образованием 1-гидрокси-2-нафтоата, 2-карбоксибензальдегида и орто-фталата в качестве ключевых метаболитов без участия ферментов утилизации нафталина (Куо-hara et а1., 1976; ^аЬисЫ, Нагауата, 1998).

Фенантрен

NAD(P) NAD(P)H

OH t V J

2

1,2-дигидрокси-

нафталин

СООН Салициловая кислота

3|

COOH

1-Г идрокси-

2-нафтойная кислота

COOH

COOH

о-Фталевая кислота

COOH Протокатежвая

кислота

орто-

расщепление

мета-

расщепление

/ \

орто - метарасщепление расщепление

Рис. 1. Метаболические пути биодеградации нафталина и фенантрена (Yen, Serdar, 1988; Iwabuchi, Harayama, 1998): 1 - фенантрен диоксигеназа; 2 - 1-гидрокси-2-нафтоат гидроксилаза; 3 - салицилат 1-гидроксилаза; 4 - о-фталат

гидроксилаза

Рост бактерий-деструкторов при повышенных концентрациях хлорида натрия

Установлено, что все выделенные штаммы-деструкторы ПАУ рода АНгоЬа^ег способны к росту как на средах, не содержащих хлорид натрия, так и на средах с повышенным содержанием №С1: до 2 М - на полноценной среде и до 1 М - на минеральной среде с нафталином в качестве субстрата. Полученные результаты позволяют отнести исследуемые штаммы к умеренно галотоле-рантным микроорганизмам, по классификации Кашнера (Кашнер, 1981).

Из литературных источников известна способность ряда грамположительных бактерий к утилизации алифатических и моноароматических со-

единений в условиях повышенной минерализации среды et а1., 1997). Нами изучено влияние различных концентраций №С1 на способность штамма А. globiformis SF27 к росту и деструкции фенантрена (рис. 2 А, В). Как показали результаты опыта, повышение концентрации №С1 в среде культивирования штамма SF27 до 0.4 М приводило к снижению максимального значения оптической плотности культуры по сравнению с культурой в контроле, однако количество жизнеспособных клеток культуры оставалось на уровне контроля. В присутствии 0.7 М NaQ в ростовой среде наблюдалось значительное снижение оптической плотности и количества жизнеспособных клеток культуры, а также увеличение лаг-фазы роста культуры. Повышение концентрации №С1 в среде

культивирования до 1 М ингибировало рост штамма на фенантрене, однако при определении количества колониеобразующих единиц выявлены жизнеспособные клетки (рис. 2 А, В).

Время, ч

В

Время, ч

Рис. 2. Рост АгЛгоЪааег globiformis SF27 в минеральной среде с фенантреном при разных концентрациях ЫаС1 (М): 1 - контроль (без №С1); 2 - 0.4 М; 3 - 0.7 М; 4 - 1 М

Влияние засоления среды на ростовые характеристики штамма АгЛгоЪа^ег globiformis SF27 изучалось в сравнении со штаммом Аг^тЪа^ег globiformis КЗТ-1, выделенным из огородной почвы Подмосковья (Зайцев, Карасевич, 1981). Культивирование штаммов проводилось на среде Раймонда с добавлением триптона и дрожжевого экстракта в качестве субстратов. При увеличении концентрации №С1 в ростовой среде штамма А. globiformis SF27 до 0.4 М наблюдались более высокие значения оптической плотности культуры по сравнению с показателями, зарегистрированными при культивировании в условиях обычной минерализации (рис. 3 А, В). При концентрации

1 М №С1 максимальная оптическая плотность культуры штамма SF27 достигала уровня контроля, но за более продолжительный период. Значения оптической плотности для штамма КЗТ-1 при данной концентрации №С1 были существенно ниже, чем при выращивании в среде с обычной

минерализацией. При повышении содержания №С1 в ростовой среде до 1.5 М отмечалось снижение максимальной оптической плотности культуры штамма SF27 в 2 раза, по сравнению с контролем, а также увеличение лаг-фазы. В присутствии 1.5 М №С1 в среде культивирования рост штамма Аг^гоЬа^ег globiformis КЗТ1 практически отсутствовал (рис. 3 А, В).

Время, ч

Время, ч

Рис. 3. Рост штаммов ArthroЪacter gloЪiformis SF27 (А) и КЗТ-1 (В) в полноценной среде при разных концентрациях ЫаС (М): 1 - контроль (без ЫаС1); 2 - 0.4 М; 3 -0.7 М; 4 - 1 М; 5 - 1.5 М

Из полученных данных следует, что выделенный из почвы с повышенной минерализацией фе-нантрен-деградирующий штамм Arthrobacter glo-biformis SF27 способен к росту на фенантрене при концентрации №С1 в ростовой среде до 0.7 М и является более устойчивым к высокой минерализации среды, чем представитель того же вида Аг^-robacter globiformis КЗТ1, выделенный из подмосковной почвы.

Ростовые характеристики штамма Arthrobacter sp. В45, выделенного из нафталинутилизирующего сообщества микроорганизмов, исследовались в минеральной среде Раймонда разной минерализации. В качестве субстрата был использован нафталин (рис. 4).

Еремя (ч)

Рис. 4. Рост штамма Arthrobacter globiformis B45 в минеральной среде с нафталином при разных концентрациях NaCl (М)

Опыты показали, что присутствие в среде культивирования NaCl в концентрации 0.4М приводило к небольшому увеличению значений оптической плотности культуры. В литературе описано стимулирующее воздействие небольших концентраций хлорида натрия (1-2%) на ростовые характеристики грамположительных штаммов (Плакунов и др., 1999). В присутствии 1 М NaCl наблюдалось увеличение лаг-фазы роста и снижение ростовых показателей культуры. В то же время сообщество микроорганизмов, включающее штаммы Arthrobacter sp. B45 и В1, способно к утилизации нафталина при концентрации NaCl в среде культивирования до 1.5 М (Алтынцева, 2001).

Роль плазмид в деградации ПАУ

У большинства описанных в литературе штаммов-деструкторов гены, контролирующие разложение нафталина и фенантрена, расположены в плазмидах (Кочетков, Боронин, 1984; Yen, Serdar, 1988;).

Нами был проведен анализ на наличие плаз-мидной ДНК штамма-деструктора нафталина A. nicotiane SN17 и штаммов-деструкторов нафталина и фенантрена A. globiformis DF14 и SF27.

Анализ электрофореграмм показал, что штамм A. nicotiane SN17 содержит плазмиду размером около 85 тпн. В штаммах A. globiformis DF14 и SF27 зарегистрированы плазмиды размером около 120 тпн.

Известно, что способность к деструкции различных ксенобиотиков бактериями рода Arthro-bacter также часто определяется плазмидными генами (Furukawa, Chakrabarty, 1982; Eaton, 2001). В наших исследованиях при обработке клеток штамма A. globiformis SF27 митомицином С в концентрации 0.6 мкг/мл были получены элиминант-ные штаммы. Установлено, что элиминанты не

способны к росту на нафталине, фенантрене и 1-гидрокси-2-нафтоате; в то же время они сохраняют способность к росту на салицилате. Полученные данные позволяют предположить, что ферменты первичной атаки ароматического кольца фенантрена и 1 -гидрокси-2-нафтоата, а также ферменты утилизации нафталина до салицилата у штамма А. globiformis SF27 кодируются плазмид-ными генами.

1 2 3 4

Рис. 5. Электрофореграмма плазмидной ДНК: 1 - рБЕ27;

2 - рБИ4; 3 - рБ№7; 4 - NAH7 (83 тпн)

Заключение

Выделенные из почв и донных отложений, загрязненных отходами химических и соледобывающего производств, бактерии рода Arthrobacter имеют большой деградативный потенциал. Установлено, что все исследованные штаммы являются деструкторами нафталина и осуществляют его утилизацию по описанному в литературе для ряда штаммов рода Pseudomonas пути с образованием салицилата и катехола (Yen., Serdar, 1988). Штамм Arthrobacter globiformis SF27, вероятно, способен к деградации фенантрена через 1-гидрокси-2-нафтойную кислоту, 2-карбоксибензальдегид и орто-фталат без участия ферментов утилизации нафталина (Kiyohara, Nagao, 1976; Iwabuchi, Ha-rayama, 1998).

Выделенные бактерии-деструкторы ПАУ рода Arthrobacter являются умеренно галотолерантны-ми бактериями (Кашнер, 1981) и способны к росту на нафталине при концентрации 1 М хлорида натрия в среде культивирования. Установлено, что все исследованные штаммы на полноценной среде способны к росту при более высоких концентрациях NaCl, чем на минеральной среде с нафталином. Из литературных данных известно, что аминокислоты могут выступать в качестве осмопротекторов и накапливаться клетками ряда галотоле-рантных штаммов при повышенном засолении

среды (Galinski, 1993). Штамм Arthrobacter globiformis SF27 способен к утилизации фенантре-на при концентрации NaCl до 1 М и растет при более высоких концентрациях хлорида натрия, чем штамм A. globiformis КЗТ1, выделенный из подмосковной почвы.

Три штамма SN17, SF27 и DF14 содержат плазмиды большого размера. В эксперименте по элиминации плазмиды A. globiformis SF27 получены данные, позволяющие предположить, что ферменты первичной атаки ароматического кольца фе-нантрена и 1-гидрокси-2-нафтоата, а также ферменты утилизации нафталина до салицилата у данного штамма кодируются плазмидными генами.

На основании полученных результатов можно утверждать, что выделенные бактерии-деструкторы нафталина и фенантрена рода Arthrobacter адаптированы к росту и утилизации ароматических субстратов в условиях повышенной минерализации среды и являются перспективными для использования при биоремедиации почв и стоков с повышенным содержанием солей.

Работа поддержана грантом РФФИ-Урал №0404-96042.

Список литературы

Алтынцева О.В. Галотолернтные бактерии-деструкторы полициклических ароматических углеводородов: Дис. ... канд. биол. наук. Пермь, 2001. 139 с.

Бабыкин M.M. и др. Плазмиды различных штаммов Pseudomonas spheroides // Молек. генет. микроорг. и вирусов. 1984. № 7. С. 23-28. Зайцев Г.М., Карасевич Ю. Н. Утилизация 4-хлорбензойной кислоты штаммом Arthrobacter globiformis // Микробиология. 1981. Т. 50. С. 35-40.

Кочетков В.В., Боронин А.М. Сравнительное изучение плазмид, контролирующих биодеградацию нафталина культурой Pseudomonas // Микробиология. 1984. Т. 53. С. 639-644. Кашнер Д. Жизнь микробов в экстремальных условиях. М.: Мир, 1981. 365 с.

Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии // Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984. 390 с.

Методы общей бактериологии / Пер. с англ.; под ред. Ф. Герхардт и др. М.: Мир,1983. Т. 1-3. Плакунов В.К. и др. Взаимосвязь кинетики роста и дыхания у родококков в присутствии высоких концентраций солей // Микробиология. 1999. Т. 68, № 1. С. 40-44.

Плотникова Е.Г. и др. Бактерии-деструкторы по-лициклических ароматических углеводородов, выделенные из почв и донных отложений района солеразработок // Микробиология. 2001. Т. 70, № 1. С. 61-69.

Розанова Е.П., Назына Т.Н. Углеводородокисляю-щие бактерии и их активность в нефтяных пластах // Микробиология, 1982. Т. 51. С. 324-348.

Boldrin B., Tiehm A., Fritzsche C. Degradation of phenanthrene, fluorene, fluoranthene, and pyrene by a Mycobacterium sp. // Appl. Environm. Microbiol. 1993. Vol. 59, № 6. P. 1927-1930.

Boonchan S., Britz M.L., Stanley G.A. Degradation and mineralization of high-molecular-weidht poly-cyclic aromatic hydrocarbons by defined fungal-bacterial cocultures // Appl. Environm. Microbiol. 2000. Vol. 66, № 3. P. 1007-1017.

Furukawa K., Chakrabarty A.M. Involvement of plasmids in total degradation of chlorinated biphenyls // Appl. Envir. Microbiol. 1982. Vol. 44. P. 619-629.

Galinski E.A. Compatible solutes of halophilic eubac-teria: molecular principles, water-solute interaction, stress protection // Experientia. 1993. Vol. 49. P. 487-496.

Eaton R. W. Plasmid-encoded phthalate catabolic pathway in Arthrobacter keyseri 12B // J. Bacte-riol. 2001. Vol. 183. P. 3689-3703.

Iwabuchi T., Harayama S. Biochemical and genetic characterization of trans-2-carboxy-bensalpyru-vate hydratase-aldolase from a phenanthrene-de-grading Nocardioides strain // J. Bacteriol. 1998. Vol. 180. P. 945-949.

Kanaly R. A., Harayama S. Biodegradation of high-molecular-weight polycyclic aromatic hydrocarbons by bacteria // J. Bacteriol. 2000. Vol. 182, № 8. P. 2059-2067.

Кйstner M, Breuer-Jammali M, Mahro B. Impact of inoculation protocols, salinity, and pH on the degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) and survival of PAH-degrading bacteria introduced into soil // Appl Environ Microbiol. 1998. Vol. 64, № 1. Р. 359-362.

Keuth S., Rehm H.-J. Biodegradation of phenanthrene by Arthrobacter polychromogenes isolated from a contaminated soil // Applied Microbiology and Biotechnology. 1991. Vol. 34. P. 804-808.

Kiyohara H. Nagao K., Nomi R. Degradation of phe-nanthrene through o-phthalate by Aeromonas sp. // Agric. Biol. Chem. 1976. Vol. 40. P. 1075-1082.

Laurie Andrew D., Gareth Lloyd-Jones The phn genes of Burkholderia sp. strain RP007 constitute a divergent gene cluster for polycyclic aromatic hydrocarbon catabolism // J. Bacteriol. 1999 Vol. 181. P. 531-540.

Luz M., Paje F. Brett A., Neilan A., Couperwite I. A Rhodococcus species that thrives on medium saturated with liquid benzene // Microbiology. 1997. Vol. 143. P. 2975-2981.

Marko M.A., Chipperfield R., Birnboim H.C. A procedure for the large-scale isolation of highly purified plasmid DNA using alkaline extraction and binding to glass powder // Analit. Biochem. 1982. Vol. 121. P. 382.

Rheinwald J., Chakrabarty A.M., Gunsalus I.C. A Yen K.M., Serdar C.M. Genetic of naphthalene cata-transmissible plasmids controlling camphor oxida- bolism in pseudomonads. CRC // Crit. Rev. Mi-

tion in Pseudomonas putida // Proc. Natl. Acad. crobiol. 1988. Vol. 15. P. 247-268.

Sci. USA. 1973. Vol. 70. P. 885-889. Поступила в редакцию 05.06.2006

Halotolerant bacteria of the genus Arthrobacter, capable of growth on polycyclic aromatic hydrocarbons

O.V. Yastrebova, E.G. Plotnikova

Using method of enrichment culture five bacterial strains of genus Arthrobacter that were able to grow on naphthalene as a sole source of carbon and energy at 1M NaCl have been isolated from soils and bottom sediments from the area of salt mining. A. globiformis strain SF27 utilized phenanthrene in 1 M NaCl presence. Pathways of phenanthrene degradation by Arthrobacter sp. B1 via formation of 1,2-dihydroxynaphthalene and salicylate and by A. globiformis SF27 - via 1-hydroxy-2-naphthoate, 2-carboxybenzaldehyde and ortho-phthalate. Plasmids of 120 kb and 85 kb were detected in A. globiformis strains DF14, SF27 and A. nicotianae strain SN17.