CC BY
284
Известия Тульского государственного университета
Естественные науки 2008. Выпуск 2. С. 186-193
ХИМИЯ
V. I К 579.222.2:543.553
A.A. Ветрова, A.A. Овчинникова, А.Е. Филонов,
И.Ф. Пунтус, А.М. Воронин
Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина РАН, г. Пущино
Путинский государственный университет
ДЕСТРУКЦИЯ НЕФТИ БАКТЕРИЯМИ РОДА PSEUDOMONAS, СОДЕРЖАЩИМИ РАЗЛИЧНЫЕ ПЛАЗМИДЫ БИОДЕГРАДАЦИИ*
Аннотация. Исследованы микроорганизмы, содержащие следующие плазмиды биодеградации — pWWO (толуола), САМ (камфоры) и pBSl 111. pBS216, pOV17 (нафталина). Присутствие плазмиды в клетках микроорганизмов приводит к увеличению степени деструкции нефти по сравнению с бесплазмидными штаммами. Наибольший вклад в деструкцию нефти вносят бактерии, содержащие нафталиновые плазмиды. Максимальную степень деструкции демонстрировал штамм P. chlororaphis PCL1391 с плазмидой pBS216.
Введение. Существующие способы разработки месторождений нефти не дают возможность извлекать из пластов более 50% нефтяных запасов. В большинстве случаев, подобная проблема возникает с увеличением вязкости нефти в процессе нефтеизвлечения [1]. На первых этапах нефтедобычи используются различные химические и физико-химические методы воздействия на нефтяные пласты с целью повышения нефтеотдачи. На следующем этапе применяются микробиологические методы повышения эффективности нефтедобычи, которые привлекают внимание высокой эффективностью, широким разнообразием, экологической безопасностью, относительно невысокими затратами [2].
* Работа поддерживалась Российским фондом фундаментальных исследований в рамках проекта РФФИ-08-04-99019-р_офи, Международным научно-техническим центром (проект МНТЦ 2366), грантом Министерства образования и науки; гос. контрактом Тема РНП 2.1.1.7789; РНП 2.1.19290; СІШР ЇШВ2-010001-Ри-05.
Еще в начале XX в. была показана способность микроорганизмов к окислению нефтей или их отдельных компонентов [3, 4]. Бекманом [5] было высказано предположение о возможности использования бактерий для разрушения тяжелых фракций нефти, остающихся в нефтематеринской породе. Смолы и асфальтены, входящие в состав тяжелой фракции, относятся к высокомолекулярным углеводородным соединениям нефти. В составе нефти они играют важную роль, определяя во многом ее физические свойства и химическую активность. По данным Петрова А.А. [6] асфальтены являются наименее подверженной бактериальному окислению частью нефти. Биодеградация асфальтенов сопровождается в основном окислением длинных парафиновых цепей [6]. Возможно, что ферменты, расщепляющие циклические соединения способны трансформировать каркас асфальтенов, состоящий из фрагментов гетероциклических и алициклических углеводородов.
Известно, что гены, кодирующие ферменты, расщепляющие циклические углеводороды (такие как толуол, камфора, салицилат, нафталин), находятся в составе бактериальных плазмид. Так, плазмида pYYYYO кодирует ферменты полного пути окисления толуола. Гены катаболизма толуола организованы в 2 оперона: верхний оперон, кодирующий ферменты расщепления толуола и ксилолов до бензоатов и толуатов, и нижний оперон, кодирующий ферменты деградации бензоатов и толуатов до интермедиатов цикла трикарбоновых кислот [7]. Архитипичная плазмида биодеградации нафталина NAH7 кодируют ферменты полного пути минерализации нафталина [8]. Ключевой фермент пути окисления камфоры (кислородосодержащее гетероатомное соединение) - камфора-5-монооксигеназа локализован на САМ плазмиде. Известно, что нафталин-1,2-диоксигеназа катализирует 76 химических реакций, в то время как толуол монооксигеназа способствует расщеплению толуола и ксилолов (4 реакции), а камфора-5-моноокигеназа окисляет помимо камфоры, еще 3 гомологичных ей субстрата [9].
Конъюгативные плазмиды биодеградации способны к горизонтальному переносу между бактериальными популяциями, что расширяет их дегра-дативный потенциал и способствует адаптации микроорганизмов к изменяющимся условиям окружающей среды [10]. Поскольку псевдомонады являются хорошими реципиентами плазмид биодеградации [11], представляется перспективным совмещение в определенных штаммах Pseudomonas способностей к биодеградации различных углеводородов. Ранее было продемонстрировано, что присутствие катаболических плазмид в штаммах-деструкторах, в том числе ризосферных, увеличивает прирост биомассы и степень деструкции нефти [12].
Целью данной работы являлось изучение степени деструкции нефти и изменения доли ее спирто-бензольной фракции в результате биодеградации бесплазмидными и плазмидосодержащими бактериями рода Pseudomonas.
Методика
Бактериальные штаммы. В работе использовали 9 микроорганизмов рода Pseudomonas из коллекции лаборатории биологии плазмид ИБФМ РАН г. Пущино. В работе использовались 3 плазмиды биодеградации нафталина pBSl 1 11. pBS216 и p()V17. плазмида биодеградации камфоры САМ и плазмида биодеградации толуола pYYYYO.
Сокращения: способность к росту: ХаЬ+ — на нафталине, То1+ — толуоле, Gnt+ — гентизиновой кислоте, Plm+ — фенантрене, Сат+ — камфаре, Sal+ — салицилате, Dsf+ — дизельном топливе, ХрЬ+ — нефти, Hde+ — гексадекане.
Питательные среды и условия культивирования. В качестве минеральной среды использовали среду Эванса [13], полноценной - агаризованная среду Лурия-Бертани (ЛБ) [14].
Агаризованные среды с диспергированной нефтью готовили, как было описано ранее [12].
Способность использовать нефть в качестве источника углерода и энергии изучали в колбах Эрленмейера со 100 мл минимальной среды Эванса с добавлением нефти до конечной концентрации 1,5 % весовых. Для этого штаммы выращивали сначала на агаризованной среде Эванса с добавлением нафталина в качестве источника углерода и энергии для плазмидосодержащих штаммов и с добавлением сукцината для бесплазмидного микроорганизма. Затем производили высев штаммов на чашки Петри с использованием дизельного топлива в качестве ростового субстрата. Инокулирование колб с нефтью проводили суспензией микроорганизмов (1 мл на 100 мл среды, посевная доза 1-5х106кл/мл). После засева колбы помещали на круговую качалку (120 об .чип) и инкубировали микроорганизмы в течение 7 суток при 21 С.
Через 7 суток роста отбирали пробы выращенных культур 0,5 мл и проводили серийные десятикратные разведения. Затем полученные суспензии высевали в трех повторах на чашки Петри с богатой питательной средой Лурия - Бертани для точного определения числа колониеобразующих единиц (КОЕ), характеризующего прирост биомассы.
Определение степени деструкции нефти. Деградацию нефти исследуемыми штаммами оценивали по суммарному показателю убыли нефти в жидкой среде, определяемому весовым методом (гравиметрия) [15].
Таблица 1
Штаммы и плазмиды, использованные в работе
Штамм Плазмида Характеристика штамма Источник получения
Р. chloro- raphis PCL1391 Продуцент феназин-1-карбоксамида Phn-Nah-Sal- Nph+ I)sf+ Hde+ Ризосферный штамм, Б. Люхтен-берг, Нидерланды
Р. chloro- raphis PCL1391 pBS216, IncP-9á Продуцент феназин-1-карбоксамида Phn+Nah+ Sal+ Nph+ Dsf+Hde+ Коллекция лаборатории биологии плазмид
Р. chloro- raphis PCL1391 pOV17, IncP-9á Продуцент феназин-1-карбоксамида Phn+Nah+ Sal+ Nph+ Dsf+Hde+ Коллекция лаборатории биологии плазмид
P. putida BS3701 pBS1141, IncP-9/? pBS1142 Sal+ Nah+Gnt+Phn+ Tol+ Nph+ Dsf+Hde+ Коллекция лаборатории биологии плазмид
P. putida BS3701E pBS1142 Sal+ Nah- Gnt-Phn-Tol- Nph+ Dsf+Hde+ Настоящая работа
P. putida BS237 САМ Cam+ Nph+ Dsf+Hde+ Коллекция лаборатории биологии плазмид
P. putida BS237E Cam- Nph+ Dsf+Hde+ Настоящая работа
P. putida mt-2E Tol-Nph+ Dsf+Hde+ Настоящая работа
P. putida mt-2 pWWO, IncP-9 Tol+ Nph+ Dsf+Hde+ Коллекция лаборатории биологии плазмид
Определение фракционного состава нефти. Оценку фракционного состава остаточной нефти проводили с помощью жидкостно- адсорбционной хроматографии [15].
Результаты и их обсуждение
В данной работе были исследованы микроорганизмы, содержащие следующие плазмиды биодеградации - р\У\У() (толуола), САМ (камфоры) и рВ81111. рВ8210. рОУ17 (нафталина). Следует отметить, что перечисленные выше плазмиды биодеградации нафталина структурно аналогичны известной плазмиде р1)Т01 [16], и относятся к группе несовместимости Р-9 [17]. Плазмида биодеградации толуола р\У\\Х) также относится к Р-9 группе несовместимости, в то время как плазмида биодеградации камфоры относится к группе несовместимости Р-2.
Бесплазмидные штаммы В8237К и т!-2К были получены в результате спонтанной элиминации плазмид САМ и р\У\\Х) при длительном культивировании в жидкой среде ЛБ. Штамм В83701К является элиминантом, содержащем только криптическую плазмиду рВ811 12. не несущую генов биодеградации.
Для сравнительного изучения влияния различных плазмид в клетках бактерий на степень деструкции нефти исследуемые штаммы выращивали на минеральной среде, содержащей нефть в качестве единственного источника углерода в течение 7 суток при 24 °С. Деградацию нефти оценивали по суммарному показателю её убыли в жидкой среде, определяемому гравиметрическим методом. Данные, представленные на рис. 1 показывают, что присутствие плазмиды в клетках микроорганизмов приводило к увеличению степени деструкции нефти по сравнению с бесплазмидными штаммами. Как видно из полученных результатов (рис.1) наибольший вклад в деструкцию нефти вносят бактерии, содержащие нафталиновые плазмиды. Из всех исследуемых бактерий максимальную степень деструкции (48%) демонстрировал штамм Р. МогогарЫз РОЛ391 с плазмидой рВ8210. Известно, что первый фермент деградации нафталина - нафталин-1,2-диоксигеназа обладает широкой субстратной специфичностью. Этот фермент катализирует 76 реакций, представляющих 5 основных групп (реакции диоксигенирования, монооксигенирования, дегидратации, О- и ]М- деалкилирования и сульфо-окисления).
Рис.1. Степень деструкции нефти штаммами рода Pseudomonas
через 7 суток роста при 24 °С.
Для изучения степени микробной трансформации тяжелой фракции нефти определяли убыль ее спирто-бензольной фракции методом жидкостноадсорбционной хроматографии. Данный аналитический метод применяется для группового разделения углеводородов на алкано - циклоалкановую и ареновую части, а также для разделения аренов по степени цикличности. Изменение процентного содержания каждой фракции отражает не абсолютную величину, а изменение доли фракций в остаточном содержании нефти относительно контроля. Как видно из данных рис.2, большая убыль спирто-бензольной фракции нефти наблюдается в случае плазмидосодержащих штаммов по сравнению с бесплазмидными бактериями. Максимальная убыль спирто-бензольной фракции 26 % наблюдалась для штамма РСЫ391 с плазмидой рВ821б, в то время как убыль этой фракции для бесплазмид-ного штамма РСЫ391 составляла 9 %, что демонстрирует эффект наличия данной катаболической плазмиды. Наибольший вклад в убыль спиртобензольной фракции нефти (8 - 17 %) вносят плазмиды биодеградации нафталина. Несмотря на то, что исследуемые плазмиды биодеградации нафталина были структурно аналогичными, вклад, вносимый в деградацию спирто-бензольной фракции, был различным. Это возможно обусловлено различиями в экспрессии плазмидных генов.
Штаммы
Рис.2. Убыль спирто-бензольной фракции нефти после ее разложения штаммами-деструкторами относительно содержания в контроле
через 7 суток роста при 24 ° С
Таким образом, бактерии рода Pseudomonas, содержащие нафталиновые плазмиды, наиболее эффективно трансформируют тяжелую фракцию нефти, что может приводить к снижению вязкости и увеличению нефтеизвлечения на микробиологическом этапе разработки нефтяных месторождений. Поскольку исследуемые плазмиды являются конъюгативными, это создает предпосылку для расширения деградативного потенциала природных микроорганизмов, участвующих в процессе нефтедобычи, за счет переноса ка-таболических генов, локализованных на плазмидах.
Авторы выражают благодарность сотруднику Центра инструментальных методов анализа ИБФМ РАН А.М. Одиноковой за проведение гравиметрического анализа и жидкостно-адсорбционной хроматографии.
Библиографический список
1. Беляев С.С. Использование микроорганизмов в биотехнологии повышения нефте-извлечения / С.С. Беляев [и др.] // Микробиология. -2004. -Т. 73. —JV® 5.
2. Розанова Е.П. Микробиологические методы повышения нефтеотдачи пластов / Е.П.Розанова [и др.]. - М.: ВНИИОЭНГ, 1987
3. Таусон В.О. К вопросу об усвоении парафина микроорганизмами/ В.О. Таусон // Журнал русского ботанического общества. -1925. -Т. 9. -С. 161-179.
4. Таусон В.О. Бактериальное окисление сырых нефтей/ В.О. Таусон // Нефтяное хозяйство. -1928. -Т. 14. —JV® 2. -С. 220-230.
5. Beckman J.W. Action of bacteria on mineral oil / J.W.Beckman // Industr. Engineer. Chem. -1926. -V. 4. -№ 21. -P. 3-7.
6. Петров А.А. Углеводороды нефти/ А.А.Петров. -М.: Наука, 1984.
7. Worsey M.J. Metabolism of toluene and xylenes by P. putida (arvilla)mt-2; evidence for a new function of the TOL plasmid/ M. J. Worsey, P. A.Williams // J. Bacteriol. -1975. - V. 124. -P. 7-13.
8. Tsuda M. Naphthalene degrading genes on plasmid NAH7 are on a defective transposon / M. Tsuda, T. lino // Mol. Gen. Genet. -1990. -V. 223. -P. 33-39.
9. http://umbbd.msi.umn.edu/
10. Кочетков В. В. Плазмиды биодеградации нафталина у бактерий рода Pseudomonas /В.В. Кочетков // Дис. канд. биол. наук. - Пущино, 1985.
11. Hill К.Е. Gene transfer in soil systems using microcosms/ K.E.Hill, E.M.Top // FEMS Microbiol. Ecol. -1998. -V. 25. -P. 319-329.
12. Ветрова А.А. Влияние катаболических плазмид на физиологические параметры бактерий рода Pseudomonas и эффективность биодеструкции нефти/ А.А.Ветрова [и др.] // Микробиология. -2007. -Т. 76. -JV® 3. -С. 310-316.
13. Evans С. The continiuous cultivation of microorganisms. 2. Construction of a Chemo-stat. / C. Evans, D. Herbert, D. Tempest // Methods in Microbiology. -1970. -V. 2. —J4» 4. -P. 277-327.
14. Sambrook J. Molecular cloning: a laboratory manual/ J. Sambrook, H. Fernley, T. Maniatis.- New York: Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989.
15. Барышникова Л.М. Биодеградация нефтепродуктов штаммами-деструкторами и их ассоциациями в жидкой среде/ Л.М. Барышникова [и др.] // Прикл. биохимия и микробиология. -2001. -Т. 37. -№ 5. -С. 542-548.
16. Dennis J. Complete sequence and genetic organization of pDTGl, the 83 kilobase naphthalene degradation plasmid from Pseudomonas putida strain NCIB 9816-4/ J. Dennis, G. Zylstra // J. Mol. Biology. -2004. -V. 341. -№ 3. -P. 753-768.
17. Воронин A.M. Биология плазмид / А.М.Воронин // Успехи микробиологии. -1983. -Вып. 18. -С.143-163.
Поступило 20.06.2008
