CC BY
43
УДК 577.12.543.862.2
МИКРООРГАНИЗМЫ С ФЕНОЛДЕГРАДИРУЮЩИМИ СВОЙСТВАМИ ИЗ ОЧИСТНЫХ СООРУЖЕНИЙ
В.Е. Носулич, А.Г. Быков, Т.Н. Кувичкина, А.А. Макаренко,
А.Н. Решетилов
Из очистных сооружений путем высева на селективную среду, содержащую фенол в качестве единственного источника углерода, был выделен изолят, единичные колонии которого были визуально однородны. Микроскопия показала наличие двух основных видов микроорганизмов. Изолят был использован в качестве основы биорецептора амперометрического сенсора. Показано проявление фенолдеградирующих свойств.
Ключевые слова: фенолдеградирующие микроорганизмы, биорецептор, ампе-рометрический биосенсор, кислородный электрод.
Введение
Проблема очистки окружающей среды от загрязнения различными промышленными отходами крайне актуальна. Фенол и его производные могут быть обнаружены в сточных водах нефтеперерабатывающих производств, газо- и угледобывающей промышленности. Мировое производство фенольных соединений составляет около 50000 т/год. По характеру действия фенол относится к токсическим соединениям. Предельно допустимая концентрация (ПДК) фенола в воде 0,001 мг/л (1 х 10-2 мкМ) [1].
Наиболее перспективным методом утилизации фенола является его биодеградация с помощью микроорганизмов. Использование микроорганизмов, выделенных с мест загрязнения, обеспечит очистку среды без внесения в нее других химических соединений и чужеродной биоты. Это обуславливает необходимость поиска микроорганизмов, обладающих фенолдеградирующими свойствами. В Индии из почвы выделены фенолдеградирующие дрожжи [2]. Из почв различных лесорастительных зон Средней Сибири и Республики Тыва были отобраны штаммы различных видов грибов рода Trichoderma биодеструкторов фенола [3]. Такой подход был использован при поиске фенолдеградирующих микроорганизмов из почв месторождений Западной Сибири [4]. Из загрязненных нефтью почв в районе г. Самара выделен штамм Rhodococcus opacus 1G, способный использовать в качестве единственного источника углерода и энергии фенол [5].
С целью поиска микроорганизмов, способных утилизировать фенол, были отобраны две пробы: почвы из промзоны г. Самара и высушенный активный ил с очистных сооружений предприятия
«Нижнекамскнефтехим» г. Нижнекамск. Целью работы являлось выделение микроорганизмов, обладающих фенолдеградирующими свойствами.
Материалы и методы
Материалы и реактивы. В качестве источника углерода и энергии использовали фенол (ООО Реактив, Россия). Соли для приготовления питательной среды были аналитической чистоты («Реахим», Россия). Агаризованные среды готовили с бакто-агаром Type USA(«Difco», США).
Объект исследования. В работе использовали две пробы: почвы из промзоны г. Самара и высушенный активный ил с очистных сооружений предприятия «Нижнекамскнефтехим» г. Нижнекамск.
Среды и условия культивирования. В работе использовали агаризованную селективную синтетичесскую среду Е следующего состава, г/л: KH2PO4 - 8,7; NH4CI - 0,535; CaCb - 1.11; (NHOM07O24 х 4H2O -0,0618; MgCl2 х 6H2O - 0,1197; Na2SO4 - 0,142; агар (Bacto-agar «DIFCO» USA) - 5,0; фенол - 0,25. Среду стерилизовали автоклавированием в режиме 0,5 атм в течение 30 минут. Пробы в количестве 1 г были разведены в 10 мл физраствора. Пробы высевали на чашки Петри, выдерживали в термостатируемом помещении при 28°С до появления колоний. Полученные колонии пересевали микробиологической петлей на свежую селективную среду Е с целью получения единичных колоний. Смыв со свежей культуры в количестве 1-2 мл переносили в пробирку Эппендорфа.
Иммобилизация клеток. Для иммобилизации аликвоту клеточной суспензии центрифугировали при 10 000 g в течение 3 мин при комнатной температуре. Клетки отмывали дважды 30 мМ калий-фосфатным буфером, рН 7,4. Иммобилизацию клеток изолята осуществляли методом физической адсорбции. Для этого клеточную суспензию, содержащую 10 мкл калий-фосфатного буферного раствора (30 мМ, рН 7,4) с 1 мг сырой биомассы, наносили на полоску хроматографической стеклобумаги («Whatman GF/A», Великобритания), формируя пятно диаметром 3 мм. Пятно подсушивали при комнатной температуре в течение 20 мин. Подготовленный биорецептор на основе иммобилизованных клеток изолята фиксировали на измерительной поверхности кислородного электрода типа Кларка («Кронас», Россия) с помощью нейлоновой сетки.
Условия измерений. Измерения проводили в калий-фосфатном буферном растворе (30 мМ, рН 7,4), насыщенном кислородом, при комнатной температуре в открытой кювете объёмом 2 мл с помощью потенциостата IPC-Micro («Кронас», Россия). Регистрируемым параметром являлась максимальная скорость изменения выходного сигнала dI/dt (нА/с), связанная пропорциональной зависимостью со скоростью
изменения концентрации потреблённого кислорода (ответ биосенсора). Объем пробы субстрата составлял 100 мкл.
При микроскопии изолята использовали микроскоп AXIO Imager A1 (ZEISS), цифровая фотокамера AxioCam (ZEISS) и программу для обработки изображения AxioVision AC.
Результаты и обсуждение
Из проб почвы промзоны г. Самара и высушенного активного ила с очистных сооружений предприятия «Нижнекамскнефтехим» г. Нижнекамска после трех пассажей на плотной агаризованной селективной среде Е с фенолом в качестве единственного источника углерода и энергии были получены изоляты САВ-1 и НКВ-2 соответственно. Единичные колонии полученных изолятов были визуально однородны. Смывы данных колоний использовали при приготовлении биорецептора амперометрического биосенсора для определения фенола.
В условиях эксперимента были использованы нерастущие клетки, для которых следует ожидать стабильные стехиометрические соотношения между количеством потреблённого кислорода и фенола.
Кинетические константы скорости потребления кислорода и окисления фенола пропорциональны. Изолят НКВ-2 в качестве основы биорецептора не показал ответа на введение фенола в систему. Однако, при использовании изолята САВ-1 в качестве основы рецепторного элемента, при введении фенола зарегистрирован ответ биосенсора.
Для изучения влияния концентраций фенола на потребление кислорода иммобилизованными клетками изолята САВ-1 концентрации субстрата варьировали от 9 до 112 мкМ. На рис. 1 представлена градуировочная зависимость ответа биосенсора от концентрации фенола.
х 15 -х
:> <
х 10 -
5 -0 -
0 50 100 150 200 250 300 350
Фенол, мкМ
Рис. 1. Градуировочная зависимость ответов биосенсора на основе иммобилизованных клеток изолята САВ-1 от концентрации фенола
Для всех изученных концентраций скорость деградации росла по мере повышения концентрации фенола. Нижние пределы определения для микробных биосенсоров, описанных в литературе, составляли 2 мкМ для сенсора на основе Trichpsporon cutaneum [6], 4 мкМ для сенсора на основе Rhodococcus [7], 5 мкМ на основе штамма, выделенного из почвы Западной Сибири [3]. Это составляет один порядок с нижним пределом определения биосенсора на основе изолята САВ-1.
Оценку субстратной специфичности биорецептора на основе изолята САВ-1 провели по трём субстратам: фенол, этанол и глюкоза в концентрации 0,5 мМ. Результаты представлены на рис. 2.
0,6 -
0,5 -
0,4 -
I 0,3 -и
0,2 -0,1 -0,0 -
Рис. 2. Субстратная специфичность иммобилизованных клеток изолята САВ-1:1)- фенол, 2)- этанол, 3)- глюкоза
Для предварительной идентификации микроорганизмов изолята САВ-1 проведена его микроскопия. Результаты представлены на рис. 3.
При микроскопии препарата, приготовленного из изолята САВ-1 (объектив иммерсионный, 100-кратное увеличение) было обнаружено два основных микроорганизма. Один из них палочкоподобный микроорганизм, другой дрожжеподобный.
В дальнейшем представляет интерес выяснить, за счет чего наблюдается значительный ответ при введении фенола.
Заключение
В результате проведенных исследований из почвы промзоны г. Самара путем нескольких пассажей на селективную твердую минеральную среду с фенолом в качестве единственного источника углерода и энергии, удалось получить визуально однородные колонии. Из смыва колоний приготовлена основа биорецептора амперометрического биосенсора. Введение фенола в систему вызывало ответ, то есть изолят обладал фенолдеградирующими свойствами. Однако, микроскопия изолята САВ-1
т 1 т 1
1 2 3
показала наличие двух основных микроорганизмов. Один из них дрожжеподобный, другой.
Рис. 3. Микроскопия изолята САВ-: а)- алочковидные бактерии, б)- дрожеподобные микроорганизмы
1. Чернявская М. И., Козлова М. В., Титок М. А. Метаболический потенциал микроорганизмов, выделенных из загрязненных нефтью и нефтепродуктами почв. // Вестник БГУ. Сер. 2. 2014. № 3.C. 33-37.
2. Riddhi Patel and Shalini Rajkumarlsolation and characterization of phenol degrading yeast // Journal of Basic Microbiology. 2009. V. 49. P. 216219.
3. Бондарь П.Н., Любяшкин А.В. Скрининг штаммов рода Trichoderma - биодеструкторов фенола // Технические науки. 2015. № 12. C. 1091- 1094.
4 Бактерии из почв месторождений Западной Сибири / А.А. Макаренко [и др]. Прикл. Биохим. Микробиол. 2002. Том 38. №1. С. 29-34.
5 Разложение фенола штаммом Rhodococcus opacus 1G / Е.С. Шумкова [и др]. Прикл. Биохим. Микробиол. 2009. Том 45. № 1. С. 51-57.
6. Киреева Н.А. Микробиологические процессы в нефтезагрязненных почвах. Уфа. Изд. Башкирского ун-та. 1995.
7. Riedel K., Hensel J., Rothe S., Neumann B., Scheller F. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1993. Vol. 38. №4. P.556-559.
Носулич Виктория Евгеньевна, студент, victorianosnlich'a mail.ru, Россия, Самара, Самарский национальный исследовательский университет им. С.П. Королева,
Быков Александр Геннадьевич, мл. науч. сотр., agbykov@,rambler.ru, Россия, Пущино, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН,
Список литературы
Кувичкина Татьяна Николаевна, науч. сотр., kuv@ibpm.pushchino.ru, Россия, Пущино, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН,
Макаренко Александр Александрович, сотрудник, sansiinoaimail. ru, Россия, Самара, ООО Эмульсионные технологии.
Решетилов Анатолий Николаевич, д-р. хим. наук, проф., зав. лабораторией, anatol'aibpm.pushchino. ru, Россия, Пущино, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН
MICROORGANISMS WITH PHENOLDEGRADIATE PROPERTIES FROM
P URIFICA TION CONSTR UCTIONS
V.E. Nosulich, A.G. Bykov, T.N. Kuvichkina, A.A. Makarenko, A.N. Reshetilov
From the purification plants, by isolating into a selective medium containing phenol as the sole carbon source, an isolate was isolated, the individual colonies of which were visually homogeneous. Microscopy showed the presence of two main types of microorganisms. The isolate was used as the basis of the amperometric sensor bioreceptor. The demonstration of phenol-degrading properties is shown.
Key words: phenol-degrading microorganisms, bioreceptor, amperometric biosensor, oxygen electrode.
Nosulich Victoria Evgenievna, student, victorianosulich@mail. ru, Russia, Samara, S.P. Korolev Samara National Research University,
Bykov Aleksandr Gennadievich, junior research scientist, agbykov@rambler.ru, Russia, Pushchino, G.K. Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Russian Academy of Sciences,
Kuvichkina Tatiana Nikolaevna, research scientist, kuv@ibpm.pushchino. ru, Russia, Pushchino, G.K.Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Russian Academy of Sciences,
Makarenko Aleksandr Aleksandovichr research scientist, sansuno@mail.ru, Russia, Samara, Emulsion tecnology,
Reshetilov Anatoliy Nikolaevich, doctor of chemical sciences, professor, head of laboratory, anatol@ibpm.pushchino. ru, Russia, Pushchino, G.K. Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Russian Academy of Sciences
