CC BY
31
Известия Тульского государственного университета Естественные науки. 2010. Вып. 2. С. 265-272
Химия
УДК 579.222.2+547.466
Участие иминодиацетат оксидазы в деградации этилендиаминтетраацетата у облигатного деструктора chelativorans oligotrophicus LPM-4 *
Е.Н. Капаруллина, Н.В. Доронина, Ю.А. Троценко, В.А. Алферов
Аннотация. В экстрактах клеток облигатного деструктора ЭД-ТА Chelativorans oligotrophicus LPM-4 выявлена активность иминодиацетат (ИДА) оксидазы. Секвенирована частичная последовательность соответствующего гена idaA, депонированная в GenBank под номером FJ196260. На филогенетическом дереве, построенном на основании транслированных аминокислотных последовательностей гена idaA, ИДА оксидазы штаммов LPM-4 и известного штамма BNC1 объединяются в один кластер, что свидетельствует о структурно-функциональном сходстве.
Ключевые слова: биодеградация этилендиаминтетраацетата
(ЭДТА), иминодиацетат (ИДА) оксидаза, Chelativorans olig-otrophicus.
Введение
Этилендиаминтетраацетат (ЭДТА) — хелатирующий агент группы ами-нополикарбоксильных кислот, способный образовывать стабильные водорастворимые комплексы со многими ионами металлов. В 2000 г суммарное мировое производство ЭДТА достигло 2-105 тонн, при этом 70-80% потребленного ЭДТА поступает в окружающую среду [1]. ЭДТА широко используется в моющих средствах, косметике и удобрениях, в производстве текстильных изделий и отбеливании бумаги, при снятии накипи в паровых котлах, трубопроводах и теплообменниках и, в том числе, при эксплуатации ядерных энергетических установок, в гальванических процессах. Кроме того, ЭДТА незаменим в лабораторных исследованиях [2]. Мониторинг окружающей среды показывает, что в ней происходит постоянное накопление этого пол-лютанта, на что указывают его высокие концентрации в поверхностных и
* Работа выполнена при поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы» (гос. контракт № 02.740.11.0296).
сточных водах. В результате комплексообразования с ЭДТА металлы, в том числе тяжелые и токсичные, переходят в раствор из трубопроводов, ила и донных осадков рек и водоемов, что приводит к загрязнению питьевой воды и потенциально угрожает здоровью людей. Известно несколько способов деградации ЭДТА. Первый путь — физико-химическое разложение (фотолиз, озонирование). Вторым и наиболее эффективным способом является разложение ЭДТА микроорганизмами. К настоящему времени выделено лишь несколько чистых культур, использующих ЭДТА в качестве источника углерода и энергии: Rhizobium radiobacter [3], Chelativorans multitrophicus BNC1 [4], Pseudomonas sp. LPM-410 [5] и Chelativorans multitrophicus DSM 9103 [6] — факультативные деструкторы ЭДТА, способные расти на широком спектре органических соединений, а также Chelativorans oligotrophicus LPM-4, облигатно зависящий от ЭДТА как источника углерода и энергии [7, 8]. Облигатный деструктор Chelativorans oligotrophicus LPM-4 наиболее перспективен для деградации ЭДТА при интродукции в активный ил или для детекции ЭДТА посредством биосенсоров и, следовательно, заслуживает детального исследования. Ранее было показано, что первичное разложение ЭДТА у Chelativorans oligotrophicus LPM-4 катализирует монооксигеназа, а в среде обнаружены промежуточные продукты деградации ЭДТА — глиокси-лат и ионы аммония [9]. Монооксигеназа ЭДТА охарактеризована у штаммов DSM 9103 и BNC1 [4, 10]. Показано, что у этих деструкторов ЭДТА окисляется до этилендиаминтриацетата (ЭД3А) и далее до этилендиаминдиаце-тата (ЭДДА). Штамм BNC1 разлагает также нитрилотриацетат (НТА) до иминодиацетата (ИДА) и глиоксилата. Причем разложение как ИДА, так и ЭДДА у штамма BNC1 катализирует ИДА оксидаза [11]. Установлено, что ИДА оксидаза окисляет ЭДДА с образованием этилендиамина и глиокси-лата, а ИДА — с образованием глицина и глиоксилата. Мы предположили, что в разложении ЭДТА у облигатного деструктора также может принимать участие ИДА оксидаза.
Цель работы — определение активности иминодиацетат оксидазы и секве-нирование гена idaA у нового облигатного деструктора ЭДТА Chelativorans oligotrophicus LPM-4.
Материалы и методы
Объект и условия культивирования. Chelativorans oligotrophicus LPM-4 (VKM B-2395 = DSM 19276) выращивали на среде (г/л): ^4ЭДТА — 1.0; MgSO4-7H2Ü — 1.0; KH2PO4 — 0.26; CaCh^O — 0.4; NaHPÜ4-12H2O —
0.84, рН 7.0, к которой добавляли 2 мл раствора микроэлементов [12] и 1 мл раствора витаминов [13]. Деструкторы культивировали в колбах на 750 мл со 100 мл жидкой питательной среды в течение 4 суток на качалке 150-200 об/мин при 29 °С. Штамм Escherichia coli К12 выращивали при 37°С на среде Луриа-Бертани.
Выделение ДНК. ДНК выделяли по известному методу [14].
Амплификация гена idaA. Амплификацию проводили с использованием пары праймеров (табл. 1) на термоциклере MJ Mini («BioRad», США) в режиме: 1 цикл — 96 °С, 3 мин; 30 циклов — 95°С, 30 с; 50°С, 30 с; 72°С, 30 с; последний цикл — 72°С, 4 мин. Реакционная смесь (30 мкл) содержала: буфер для Тад-полимеразы; 25 пмоль праймеров (прямой праймер (IdaA5) соответствовал позиции 9760-9783 восьмигенного кластера у C. multitrophicus BNC1 и обратный праймер (IdaA3) — позиции 10881-10900; 0,33% диметил-сульфоксида («Sigma», США); 2 мкл (10-100 нг) ДНК; 0.2 мкМ каждого дезоксинуклеотидтрифосфата (дНТФ) и 1Е Тад-ДНК-полимеразы («Fermentas», Литва). Продукты реакции анализировали электрофорезом в 1%-ном агарозном геле («BioRad», США). Визуализацию полос осуществляли в УФ после окрашивания геля бромистым этидием.
Таблица 1
Нуклеотидные последовательности праймеров, использованные для амплификации гена idaA [11]
Название Последовательность Размер *
IdaA5 5’-CAT-TGG-TCG-TGA-AAC-ATA-TGC-GTG-3’ 1117
IdaA3 5’-AGG-CTT-GGA-TCC-CCG-GCT-TC-3’
* Размер амплифицируемой области (пар оснований).
Очистка и секвенирование ПЦР-продукта. Выделение и очистку фрагментов ДНК из легкоплавкой агарозы проводили на колонках с использованием набора «Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System» («Promega», США), согласно инструкции фирмы - производителя. Секвенирование ПЦР - фрагментов проводили при помощи наборов BigDye® Terminator vl.1 и капиллярного анализатора ABI PRISM® («Applied Biosystems», США).
Филогенетический анализ. Филогенетический скрининг сходства нуклеотидной последовательности гена idaA исследуемого штамма по базе данных GenBank проводили с помощью пакета программ BLAST (http://ncbi.nlm.nih.gov). Для более точного определения филогенетического положения нуклеотидную последовательность гена idaA выравнивали вручную c последовательностями референтных штаммов из ближайших таксонов с помощью программы CLUSTAL W (http://www. genebee.msu.su/clustal) и соответствующих последовательностей, доступных в базе данных NCBI Database Project. Построение укорененного филогенетического дерева производили методом neighbor-joining (NEIGHBOR), реализованным в пакете программ TREECON [15]. Эволюционное расстояние рассчитывали как число замен на 100 нуклеотидов. Статистическую достоверность ветвления оценивали с помощью «bootstrap-анализа» 100 альтернативных деревьев, используя соответствующую функцию программы TREECON.
Определение активности ИДА оксидазы. Клетки из экспоненциальной фазы роста центрифугировали (5000 g, 20 мин), отмывали 0.05 М
Трис-НС1 буфером, рН 7.4 и разрушали ультразвуком на аппарате МЯЕ (Англия) мощностью 150 Вт при 20 кГц (6x30 сек) при 4°С. В бесклеточном экстракте, полученным центрифугированием (20000g, 40 мин) гомогената, определяли активность ИДА оксидазы по восстановлению конечного акцептора электронов КзРе^^б на спектрофотометре «Shimadzu иУ-1700» (Япония) при 420 нм и 30°С [11]. Реакционная смесь содержала: 25 мМ Трис-НС1 буфер, pH 8.0; 1мМ КзРе(С^б; экстракт 50 мкл. Реакцию начинали добавлением 25 мМ ИДА. Активность ИДА оксидазы выражали как число вступивших в реакцию наномолей КзРе(С^б на 1 мг белка в мин. Белок определяли по методу Лоури.
Для статистической обработки результатов использовали стандартные методы обработки данных.
Депонирование нуклеотидной последовательности. Полученную нуклеотидную последовательность фрагмента гена idaA О. oligotrophicus ЬРМ-4 депонировали в СепБапк под номером РЛ196260.
Результаты и их обсуждение
Полярографические исследования выявили поглощение кислорода отмытыми клетками О. оИдо^орЫсиз ЬРМ-4 при внесении ИДА, что указывало на окисление данного соединения. Ферментативный анализ экстрактов клеток показал, что активность ИДА оксидазы с ИДА у О. оИдо^орЫсиз ЬРМ-4 (230±10 нмоль/мин/мг белка), а почти в два раза выше чем у О. тиШЬгор^ icuз BNC1. При этом активность ИДА оксидазы у О. оИдо^орЫсиз ЬРМ-4 с ЭДДА, в качестве субстрата, была ниже на 30% (78±3 нмоль/мин/мг белка). ИДА оксидаза у штамма О. оИдо^орЫсиз ЬРМ-4 имела оптимум активности при рН 8.0, что совпадает с данными для этого фермента у О. тиЫйгорЫсиз BNC1 [11]. Также как и у штамма О. тиЫйгорЫсиз BNC1, у О. оИдо^орЫсиз ЬРМ-4 фермент не проявлял активности с ЭДТА, НТА или этилендиамином, что указывает на его субстратную специфичность к ЭДДА и ИДА.
Проведенный нами поиск депонированных в СепБапк нуклеотидных последовательностей ИДА оксидаз у различных таксономических групп прокариот выявил только одну последовательность гена idaA у О. тиШЬгорЫ icuз BNC1. Показано, что ген idaA входит в восьмигенный кластер, ответственный за деградацию ЭДТА [11]. Кластер состоит из генов еррАБОБ (АТФ-связывающей транспортной системы), етоА (монооксигеназы ЭДТА), етоБ (гена НАДН2:ФМН зависимой оксидоредуктазы), етоЯ регуляторного гена и гена, кодирующего ИДА оксидазу (idaA).
Анализируя полученные ферментативные данные, предположили, что два исследуемых деструктора реализуют сходный механизм разложения ЭД-ДА. Используя праймеры, разработанные на ИДА оксидазу для факультативного деструктора О. тиЫйгорЫсиз BNC1 (табл. 1), получили фрагмент гена idaA для нового облигатного деструктора О. оИдо^орЫсиз ЬРМ-4. В качестве позитивного контроля служила ДНК О. тиЫйгорЫсиз BNC1, а
негативного контроля — ДНК Escherichia coli K12. Для проверки того, что полученный ампликон действительно является фрагментом гена idaA, его секвенировали. Транслирование этого участка в аминокислотную последовательность позволило построить филогенетическое дерево, на котором ИДА оксидазы облигатного и факультативного деструкторов ЭДТА объединены в один кластер (рис. 1). Наряду с последовательностью гена idaA у C. multitrophicus BNC1 в GenBank выявлены несколько последовательностей оксидаз семейства Rossmann NAD(P)+-связываюш,их белков, осуществляющих расщепление С-N связи. Однако показано, что только idaA штамма C. multitrophicus BNC1 имеет 99.7% сходства с C. oligotrophicus LPM-4 по данному белку. В нуклеотидной последовательности фрагмента гена idaA у C. oligotrophicus LPM-4 обнаружена замена одного нуклеотида, приводящая к замене аспарагина на аспартат.
100
98
94
100
88
100
Chelativorans multitrophicus BNC1 (AF176664) Chelativorans oligotrophicus LPM-4 (FJ196260)
— Bacillus clausii KSM-K16 (YP 174033)
-------Streptococcus suis 89/1591 (ZP_00875689)
Listeria monocytogenes 4b F2365 (YP 014532)
------------------------Porcine kidney (P00371)
----------Agrobacterium tumefaciens (CAA82962)
Bacillus subtilis MT-2 (031616)
--------Pseudomonas Jluorescens CHAO (AAC38596)
Рис. 1. Филогенетическое дерево, построенное на основе сравнительного анализа фрагментов IdaA штаммов Chelativorans oligotrophicus LPM-4 и С. oligotrophicus BNC1 и фрагментов оксидаз и оксидоредуктаз ряда бактерий. Корень определен включением последовательности цианид синтазы HcnC Pseudomonas fluorescens CHA0 (AAC38596) в качестве внешней группы. Масштаб соответствует 10 аминокислотным заменам на каждые 100 аминокислот (эволюционным расстоянием). Статистическую достоверность ветвления оценивали с помощью «bootstrap-анализа» 100 альтернативных деревьев
Кроме того, довольно высокие уровни сходства ИДА оксидазы у штамма LPM-4 наблюдали с глициноксидазой Bacillus clausii KSM-K16 (47.9%) и флавинадениндинуклеотид (ФАД) — зависимыми оксидоредуктазами Streptococcus suis 89/1591 и Listeria monocytogenes 4b F2365 (34.0 и 32.0%, соответ-
ственно). С ферментами, расположенными в нижней части дерева, уровень сходства ИДА оксидазы штамма LPM-4 не превышал 20%.
Заключение
Таким образом, факт наличия гена idaA у C. oligotrophicus LPM-4 и активности фермента в экстрактах клеток указывают на участие ИДА оксидазы в окислении ЭДТА до глиоксилата и этилендиамина у исследуемого штамма. Однако пока неясно, каким путем аэробные деструкторы ЭДТА метабо-лизируют этилендиамин, чтобы получить необходимый азот. Как известно, этилендиамин [NH2 — (CH2)2 —NH2] является структурным аналогом путрес-цина [NH2 — (CH2)4—NH2] — биологического амина бактериальных мембран, который метаболизируется оксидазой (НФ 1.4.3.10), катализирующей реакцию: NH2 — (CH2)4—NH2+O2 + H2O=NH2—(CH2)3—COH+NH3+H2O2. Этот фермент принадлежит к семейству оксидоредуктаз, также как ИДА окси-даза, участвует в цикле мочевины и метаболизме аминогрупп, используя ФАД в качестве кофактора. Аналогичным образом действует и моноаминок-сидаза (НФ 1.4.3.4): RCH2NH2+H2O+O2=RCH=O+NH3+H2O2. Возможно, дальнейшее превращение этилендиамина происходит посредством дезаминирования с образованием сначала аминоацетальдегида NH2CH=O, а затем и ацетата. Для экспериментальной проверки этого предположения необходимы дальнейшие исследования.
Список литературы
1. Nowack B, Van Briesen J.M. Chelating agents in the environment // In Biogeochemistry of Chelating Agents (ACS Symposium Series 910). Oxford University Press for the American Chemical Society. Washington DC, 2005. P.1-18.
2. Oviedo C, Rodriguez J. EDTA: The chelating agent under environmental scrutiny // Quim. Nova. 2003. V.26, №6. P.901-905.
3. A revision of Rhizobium with an emended description of the genus, and the inclusion of all species of Agrobacterium and Allorhizobium undicola as new combinations: Rhizobium radiobacter, R. rhizogenes, R. rubi, R. undicola and R.vitus / J.M. Young [et al.] // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2001. V.51. P.89-103.
4. Nortemann B. Total degradation of EDTA by mixed cultures and a bacterial isolate // Appl. Environ. Microbiol. 1992. V.58. P.671-676.
5. A novel EDTA-degrading Pseudomonas sp. / T.I. Chistyakova [et al.] // World J. Microbiol. Biotechnol. 2003. V.19. P.977-980.
6. Isolation and growth characteristics of an EDTA-degrading member of the a-subclass of Proteobacteria / H-U. Weilenmann [et al.] // Biodegradation. 2004. V.15. P.289-301.
7. EDTA-dependent bacterial strain / T.I. Chistyakova [et al.] // Proc. Biochem. 2005. V.40, №2. P.601-605.
8. Штамм бактерий, характеризующийся потребностью в ЭДТА / А.Д. Сатрутди-нов [и др.] // Прикл. биохимия и микробиология. 2005. Т.41, №5. C.535-540.
9. Особенности метаболизма облигатного деструктора этилендиаминтетраацетата / Н.В. Доронина [и др.] // Микробиология. 2006. T.75, №3. C.420-423.
10. Cloning, sequencing, and characterization of a gene cluster involved in EDTA degradation from the bacterium BNC1 / J. Bohuslavek [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. 2001. V.67, №2. P.688-695.
11. Identification, purification, and characterization of iminodiacetate oxidase from the EDTA-degrading bacterium BNC1 / Y. Liu [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. 2001. V.67, №2. P.696-701.
12. Pfennig N, Widdel F., Trueper H.G. The dissimilatory sulfate-reducing bacteria. In The Prokaryotes. Berlin: Springer Verlag, 1981. V.1. P.931.
13. Gram-negative, aerobic, nitrilo-triacetate-utilizing bacteria from wastewater and soil / T. Egli [et al.] // Syst. Appl. Microbiol. 1988. V.10. P.297-305.
14. Wilson K. Preparation of genomic DNA from bacteria // Current Protocols in Molecular Biology. N.Y: Wiley, 1997. 2.4.1-2.4.5.
15. Van de Peer Y., De Wachter R. TREECON for Windows: a software package for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows environment // Comput. Appl. Biosci. 1994. V.10. P.569-570.
Капаруллина Елена Николаевна, аспирант, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино.
Доронина Нина Васильевна (doronina@ibpm.pushchino.ru), д.б.н., ведущий научный сотрудник, Учреждение Российской академии наук Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино.
Троценко Юрии Александрович (trotsenko@ibpm.pushchino.ru), д.б.н., зав. лабораторией, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино.
Алферов Валерий Анатольевич (chem@tsu.tula.ru), к.х.н., зав. кафедрой, кафедра химии, Тульский государственный университет.
Participation of iminodiacetate oxidase in degradation of ethylendiaminetetraacetate in obligate destructor Chelativorans oligotrophicus LPM-4
E.N. Kaparullina, N.V. Doronina, Yu.A. Trotsenko, V.A. Alferov
Abstract. Activity of iminodiacetate (IDA) oxidase was detected in cell-free extracts of obligate destructor of EDTA Chelativorans oligotrophicus LPM-4. The partial sequence of the gene idaA has been deposited in GenBank under number FJ196260. In the phylogenetic tree constructed on the basis of the translated
amino acid sequences of the genes idaA, IDA oxidases of strain LPM-4 and extant strain BNC1 were clustered thus implying structure-functional similarity.
Keywords : ethylendiaminetetraacetate (EDTA) biodegradation, iminodiacetate (IDA) oxidase, Chelativorans oligotrophicus.
Kaparullina Elena, postgraduate student, Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms of RAS, Pushchino.
Doronina Nina (doronina@ibpm.pushchino.ru), doctor of biological sciences, senior staff research scientist, Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms of RAS, Pushchino.
Trotsenko Yuriy (trotsenko@ibpm.pushchino.ru), doctor of biological sciences, chief of laboratory, Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms of RAS, Pushchino.
Alferov Valeriy (chem@tsu.tula.ru), candidate of chemical sciences, head of department, department of chemistry, Tula State University.
Поступила 10.04.2010
