CC BY
21
ОКИСЛЕНИЕ МЕТИЛАМИНА ИММОБИЛИЗОВАННЫМИ МЕТИЛОБАКТЕРИЯМИ
METHYLOPILA MUSALIS ВКМ B-2646
Кувичкина Татьяна Николаевна
к.б.н., н.с.,
Капаруллина Елена Николаевна
к.б.н., н.с.,
Решетилов Анатолий Николаевич
д.х.н., зав. Лабораторией, ФАНО ФГБУНИнститут биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина
РАН Пущино, Московская область
АННОТАЦИЯ
Рассмотрено ферментативное окисление метиламина, осуществляемое иммобилизованнными клетками культуры Methylopila musalis ВКМ B-2646. Для этого был применён биосенсорный метод, обеспечивающий возможность регистрации потребления кислорода используемыми клетками. ABSTRACT
Enzymatic oxidation of methylamine has been investigated using immobilized cells of culture Methylopila musalis VКМ B-2646. In this connection biosensor method which provides the possibility to register oxygen consumption by cells has been employed.
Ключевые слова: метиламин, бактерии Methylopila, иммобилизация, амперометрический биосенсор
Keywords: methylamine, bacteria Methylopila, immobilization, amperometric biosensor
Метилированные амины как общие предшественники в органическом синтезе применяются в производстве инсектицидов, ускорителей вулканизации резиновых изделий, лекарственных средств, растворителей. Так, метиламин (СЮМЫН2) используется в производстве фунгицидов, дубильных веществ, красителей, ракетных топлив. Промышленное производство метиламина составляет 1.0 х106 т/год. Известно, что накопление метилированных аминов в грунтовых водах приводит к ухудшению качества питьевой воды. Предельно допустимая концентрация (ПДК) метиламина в воде составляет 1 мг/л (33 мкМ). Метилированные амины являются важными интермедиатами метаболизма растений, образующих кофеин, теанин и теобромин, а также служат центральными компонентами синтеза и распада таких осмолитов, как глицин/бетаин, пролин/бетаин и МЫ-окись триметиламина у галофильных водорослей и прокариот (аэробных метилобактерий). К аэробным метилобактериям относят уникальные микроорганизмы, способные использовать в качестве источников углерода и энергии производные метана. По типу питания различают три группы метилобактерий. Обли-гатные метилотрофы используют только С1 -соединения. Ограниченно-факультативные могут расти только на одном или нескольких полиуглеродных субстратах. Факультативные метилотрофы используют наряду с С1 - соединениями, различные полиуглеродные субстраты[1, 3].
Взаимодействие метиламина с аэробными метило-бактериями приводит к изменению их дыхательной активности, обусловленной, в том числе, окислением метиламина оксидоредуктазами микроорганизма с потреблением молекулярного кислорода. Это свойство бактерий может быть использовано в аналитических целях. Известен хроматографический метод определения алифатических аминов в газовой фазе [2]. Разработан ампе-рометрический медиаторный ферментный биосенсор на основе фермента метиламиндегидрогеназы для определения в водной среде гетероциклического соединения гиста-мина (4-(2-аминоэтил)-имидазола) [5]. Методы требуют сложного оборудования и реактивов.
Штамм МеШу1орПа тша^ представляет собой аэробные факультативные метилобактерии, выделенные из банана. Он назван МеШу1орПа тша^ sp. nov. (типовой штамм ВКМ B-2646T=DSM 24966T=CCUG 61696Г) [4]. Ранее показано, что у факультативного метилотрофа
штамма M. musalis ВКМ B-2646 в большей степени осуществляется прямое окисление метиламина в формальдегид с помощью фермента метиламиндегидрогеназы, хотя одновременно обнаружена и активность ферментов N-ме-тилглутаматного пути. Высокая скорость роста штамма M. musalis ВКМ B-2646 на среде с метиламином в качестве источника углерода и энергии, позволила отобрать этот штамм в качестве биорецептора сенсора для определения метиламина.
Целью работы являлось исследование влияния метиламина на дыхательную активность иммобилизованных клеток метилобактерий Methylopila musalis ВКМ B-2646.
МЕТОДИКА
Материалы и реактивы. В качестве источника углерода, азота и энергии и использовали метиламин. Соли для приготовления питательной среды были аналитической чистоты («Реахим», Россия). Агаризованные среды готовили с бакто-агаром Type USA («Difco», США). Для определения субстратной специфичности использовали реактивы производства фирмы «Sigma» (США).
Объект исследования. В работе использовали штамм аэробных метилобактерий Methylopila musalis ВКМ B-2646, хранящийся во Всероссийской коллекции микроорганиизмов (ВКМ).
Среда и условия культивирования. Метилобакте-рии выращивали на среде «К», которая содержала (г/л): КН2РО4 - 2.0; MgSO47H2O - 0125; NaCl - 0.5; FeSO47H2O - 0.002; вода дистиллированная 1 л, значение рН 7.2 устанавливали 3М NaOH. Для приготовления всех растворов и буферов использовали дистиллированную или деионизованную воды.
Культивирование проводили в колбах объёмом 750 мл, содержащих 200 мл среды. После стерилизации (1 атм.; 30 мин) в среду добавляли 1 мл 30% (об/об) метиламина и 20 мл жидкой посевной культуры или засевали смывом стерильной средой с агаризованной скошенной культуры. Метилобактерии инкубировали на качалке (140 об/мин) при температуре 29оС до начала стационарной фазы роста (2-5 сут.). Штамм поддерживали пересевом на агаризованной (2% агара) среде «К» с метанолом.
Биомассу (конец экспоненциальной фазы роста) отделяли центрифугированием при 5000 g в течение 30 мин, +4°С. Клеточную суспензию хранили в холодильнике при +4°С.
Иммобилизация клеток. Для иммобилизации алик-воту клеточной суспензии центрифугировали при 10 000 g в течение 3 мин при комнатной температуре. Клетки отмывали дважды 50 мМ К-фосфатным буфером, рН 7.5. Иммобилизацию клеток M. musalis ВКМ B-2646 осуществляли методом физической адсорбции. Для этого клеточную суспензию, содержащую 10 мкл 50 мМ К-фос-фатного буфера (рН 7.5) с 1 мг сырой биомассы, наносили на полоску носителя, формируя пятно диаметром 5 мм. Пятно подсушивали при комнатной температуре в течение 20 мин. Биорецептор фиксировали на измерительной поверхности кислородного электрода типа Кларка («Кро-нас», Россия) с помощью нейлоновой сетки.
Носители для биорецептора. Были испытаны следующие носители: хроматографическая стеклобумага «Whatman GF/A» (Великобритания), мембраны "Влади-пор": регенерированная целлюлоза на полипропилене (размер пор 50 нм), полисульфонамид на лавсане (размер пор 100 нм), полиэфирсульфон на лавсане (размер пор 220 нм), ацетат целлюлоза на тканевом лавсане (размер100 нм) (ЗАО НТЦ "Владипор", г. Владимир). Условия измерений. Измерения проводили в открытой кювете объёмом 2 мл в 50 мМ К-фосфатным буфере (рН 7.5), насыщенном кислородом, при комнатной температуре. Регистрируемым параметром при фиксированном потенциале (-700мВ) являлась максимальная скорость изменения выходного сигнала dI/dt (нА/с), связанная пропорциональной зависимостью со скоростью изменения концентрации потреблённого кислорода (ответ сенсора). После установления постоянного уровня тока в кювету микропипеткой вводили 100 мкл пробы.
Построение зависимостей ответа сенсора от значений рН. Для измерения рН-зависимости использовали 50 мМ К-фосфатный буфер со значениями рН 6.0, 6.5; 7.0, 7.5, 8.0. В качестве субстрата использовали 0.12 мМ метиламина. Все исследования проверялись в трёх повторно-стях.
Построение зависимостей ответа сенсора от концентрации №С1. Для исследования зависимости ответа сенсора от ионной силы буферного раствора использовали концентрации растворов №С1 в диапазоне 50 - 500 мМ. Значение рН полученных растворов доводили до значения 7.5. В качестве субстрата использовали 0.12 мМ метиламина.
Субстратная специфичность. Оценку субстратной специфичности биорецептора проводили по 8 субстратам: метиламин, его промежуточный продукт деградации формальдегид, диметиламин, триметиламин, формиат натрия, первичные алифатические спирты: метанол, этанол. Кроме того использовали С6 сахара: глюкозу и фруктозу. Содержание субстратов в кювете составляло 0.1 мМ.
Операционная стабильность биосенсора. Для определения операционной стабильности проводили 20 последовательных измерений величин ответа сенсора на введение в кювету 100 мкл пробы. Содержание в кювете составляло 0.12 мМ метиламина.
Долговременная стабильность определялась путём ежедневного измерения величины ответа сенсора на одну и ту же концентрацию метиламина (0.12 мМ) в течение 5 дней.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В таблице 1 приведены данные об ответе сенсора на основе клеток М. тшаШ ВКМ В-2646, иммобилизованных на различные носители, при введении в кювету раствора метиламина.
Сравнение носителей для биорецептора на основе ИмК M. musalis ВКМ B-2646
Таблица 1
№ п/п Название носителя, фирма Ответ биосенсора,%
1. Хроматографическая бумага «Whatman GF/A» (Великобритания) 100.0
2. Мембраны "Владипор" регенерированная целлюлоза на полипропилене (размер пор 50 нм) (Россия, Владимир) 27.4
3. Мембраны "Владипор" полисульфонамид на лавсане (размер пор 100 нм) (Россия, Владимир) 65.5
4. Мембраны "Владипор" полиэфирсульфон на лавсане (размер пор 220 нм) (Россия, Владимир) 74.5
5. Мембраны "Владипор" ацетат целлюлоза на тканевом лавсане (размер100 нм) (Россия, Владимир) 97.4
Самая большая величина ответа получена при использовании в качестве носителя хроматографической бумаги «Whatman GF/A» (Великобритания). Этот носитель и был использован в дальнейших исследованиях.
Значение рН среды является одним из факторов, влияющих на активность клеточных ферментов биорецептора. Для измерения рН-зависимости использовали 50 мМ калий-фосфатный буфер в диапазоне значений рН 6.0 -8.0. Максимальный ответ сенсора на основе иммобилизованных клеток M. musalis ВКМ B-2646 наблюдался при рН 7.5. Калий-фосфатный буфер со значением рН 7,5 использовали в дальнейших исследованиях. Следует отметить, что значения рН 7.5-8.5 были оптимальными и для работы амперометрического биосенсора с биорецептором на основе фермента метиламиндегидрогеназы для определения гистамина [6].
Изучена зависимость ответов сенсора от ионной силы в диапазоне от 50 до 500 мМ концентрации №С1. Максимальные отклики наблюдались в области 200 мМ раствора №С1. Однако при 50 мМ ответ был немногим меньше. Следует отметить, что даже при концентрации 500 мМ №С1 наблюдались большие ответы сенсора, то есть иммобилизованные клетки М. тша^ ВКМ В-2646 выдерживают высокие концентрации соли.
Градуировочная зависимость ответа от концентрации субстрата является важной метрологической характеристикой. На рисунке 1 представлена градуировочная кривая зависимости ответа сенсора от концентрации метиламина.
Следует отметить, что градуировочный график включает в себя концентрацию, равную ПДК для метиламина в воде (ПДКМА=1 мг/л или 33 мкМ).
Оценку субстратной специфичности биорецептора на основе иммобилизованных клеток М. тша^ ВКМ В-2646 провели по следующим восьми субстратам: метиламин, промежуточный продукт его деградации формальдегид, диметиламин, триметиламин, первичные алифатические спирты метанол, этанол. Кроме того, использовали С6 сахара: глюкозу и фруктозу. Иммобилизованные клетки М. тша^ ВКМ В-2646 давали отклики на все исследуемые субстраты. Однако самые большие величины ответов наблюдали при введении в кювету растворов формальдегида и метиламина. Полученные данные подтверждают, что штамм М. тша^ ВКМ В-2646 относится к факультативным метилотрофам, которые наряду с одноуглеродными соединениями могут использовать полиуглеродные соединения (С6 сахара глюкозу и фруктозу).
Важной характеристикой любого метода является его экспрессность, то есть быстрота проведения анализа.
В данном случае при введении метиламина в кювету время отклика составляло менее 1 минуты. Со временем отклика тесно связана другая характеристика сенсора -время регенерации. Для сенсора на основе штамма М. тша^ ВКМ В-2646 время восстановления составляло 58 минут. Длительность одного измерения, включающая время отклика и время регенерации, составила 6-10 минут. Долговременная стабильность штамма М. тша^ ВКМ В-2646 составила 5 дней при хранении электрода с рецептором в условиях низких температур (+4° С) в 50 мМ калий-фосфатном буферном растворе рН 7.5.
Таким образом, исследовано влияние метиламина на дыхательную активность иммобилизованных клеток метилобактерий МеШу1орПа тша^ ВКМ В-2646. Полученные данные могут быть полезны для оценки содержания метиламина в водной среде.
Рисунок 1. Градуировочная кривая ответа сенсора на основе иммобилизованных клеток М. тша^ ВКМ В-2646
от концентрации метиламина
Список литературы 4.
1. Троценко Ю.А., Доронина Н.В., Торгонская М. Л. Аэробные метилобактерии // Пущино: ОНТИ ПНЦ 5. РАН. 2010. 325 с.
2. Anthoni U.,Christophersen C., Gramm L., Nielsen N., Nielsen P. 1. // Toxicon. 1991. V. 29. P. 12051212. 6.
3. Anthony C. The biochemistry of methylotrophs. // Academic Press, London. 1982.
Doronina N.V, Kaparulina E.N., Bykova T.V., Trotsenko Yu.A. 2013. V.63. P.1847-1852. Erupe, M.E., Liberman-Martin, A., Silva, P.J., Malloy, Q.G., Yonis, Y., Cocker, Iii, D.R., Purvis-Roberts, K. // Journal of Chromatography. 2010. V. 1217. №13. P. 2070-2073.
Zeng K., Tachikawa H., Zhu Z., and Davidson V. L. // Anal. Chem. 2000. V. 72. P. 2211-2215.
УРОВЕНЬ АЗОТА В ОРГАНИЗМЕ И ФЕРМЕНТОВ СОКРАТИТЕЛЬНОГО ЦИКЛА В МЫШЦАХ ПЧЕЛ ПРИ ПОДКОРМКЕ С ГРЕЧИШНЫМ МЕДОМ В КОМПЛЕКСЕ
С ПРЕПАРАТОМ МИКРОВИТАМ
Мамонтова Юлия Алексеевна
Магистрант 1 курса РГАУ-МСХА им.КА.Тимирязева, г. Москва
АННОТАЦИЯ
Цель работы - установить влияние стимулирующих подкормок с медовой сытой с добавлением комплексного аминокислотного витаминного микроэлементного препарата «Микровитам» на уровень азота в организме и ферментов сократительного цикла в мышечной ткани рабочих пчел.
