CC BY
113
Известия Тульского государственного университета Естественные науки. 2012. Вып. 1. С. 236-245
Химия
УДК 543.55:579.222.2
Биоэлектрокаталитическое окисление формальдегида метилобактериями МеЬНуОЬасЬеттш (ИсЫогошеШатспш ВМ4 в присутствии медиатора электронного транспорта — ферроцена *
Т. А. Кузнецова, О. Н. Понаморева, А. С. Решетников, А. А. Горячева,
Т. В. Фунтикова
Аннотация. Представлены результаты исследования процессов биоэлектрокаталитического окисления формальдегида целыми клетками и ферментными фракциями метилотрофных бактерий Methylobacterium dichloromethanicum БЫ4 в присутствии ферроцена. Показано, что такие системы могут использоваться при разработке амперометрических биосенсоров для мониторинга С 1-соединений. Проведен сравнительный анализ аналитических и метрологических характеристик медиаторных биосенсоров. Показано, что биосенсор на основе мембранных фракций характеризуется лучшей селективностью по отношению к формальдегиду.
Ключевые слова: метилотрофные бактерии, биосенсор,
медиаторы электронного транспорта, ферроцен, формальдегид.
Введение
Определение содержания органических С1-соединений, которые являются токсичными природными и антропогенными загрязнителями, относится к важным практическим задачам. Для анализа содержания метана, дихлорметана, формальдегида, хлороформа, метанола, применяют в основном методы газовой и высокоэффективной жидкостной хроматографии, которые, несмотря на низкие пределы обнаружения, характеризуются сложностью применяемого оборудования, пробоподготовки, длительностью анализа, что не позволяет проводить постоянный контроль содержания этих соединений.
* Работа выполнена при финансовой поддержке ФЦП «Научные и научнопедагогические кадры инновационной России» (2009-2013г.г.) (ГК № 02.740.11.0296) и РФФИ (проект № 11-04-97544-р_центр_а).
Кроме того, метиловый спирт является одним из перспективных источников углерода для культивирования продуцентов белка высокого качества, для биотехнологических процессов производства биоразлагаемых полимерных материалов, биопротектора — эктоина и других продуктов биосинтеза метилотрофных бактерий [1—4]. В ходе биотехнологических процессов необходимо проводить мониторинг утилизации исходного соединения и образования промежуточных соединений. Формальдегид является первым и универсальным метаболитом путей окисления метанола у метилотрофных бактерий(рис.1). Формальдегид вступает в рибулозомонофосфатный и сериновый пути превращений С1-соединений и окисляется до СО2, но токсичен для живых организмов, поэтому скорость превращения его под действием ферментных систем метилобактерий должна быть высокой. Изучение способности бактерий эффективно участвовать в окислительной катаболизме формальдегида как универсального метаболита всех метилотрофов является актуальной задачей.
Рис. 1. Пути окисления Сх-соединений у аэробных метилотрофных бактерий. ММО — метанмонооксигеназа; МДГ — метанолдегидрогеназа
Для решения задач непрерывного контроля за протеканием биотехнологических процессов и эффективностью работы биокатализаторов могут стать биосенсоры. Значительный прогресс в создании амперометрических биосенсоров стал возможен благодаря использованию в них соединений, способных к переносу электронов от активных центров ферментов на электрод, — медиаторов электронного транспорта. Применение медиаторов позволяет увеличить чувствительность и снизить влияние примесей на результаты анализа. Наиболее перспективными медиаторами при разработке биосенсоров являются соединения ферроценового ряда. Пара ферроцен — катион ферроцения представляет собой высоко обратимую окислительно-восстановительную систему [5]. Ферроцены в сочетании
с биокатализаторами на основе ферментов широко используют при разработке электрохимических биосенсоров [6, 7]. Медиаторы способны взаимодействовать не только с выделенными ферментами, но и с ферментами в составе бактерий. Известно, что поверхностная локализация ферментов в мембранах бактериальных клеток облегчает их взаимодействие с медиаторами электронного транспорта [8].
Аэробные метилотрофные бактерии, особенностью которых является наличие дегидрогеназ метанола, формальдегида и формиата, связанных с дыхательной цепью бактерий, способны окислять токсичные одноуглеродные соединения и могут служить основой при создании таких биоаналитических систем мониторинга Ci соединений в природных и антропогенно загрязненных экосистемах, а также в культуральной жидкости метилотрофов при биотехнологических процессах. Следует отметить, что способность метилобактерий восстанавливать ферроцены в ходе окислительного катаболизма метанола ранее не была описана.
В работе исследовали способность целых клеток и ферментных фракций метилотрофных бактерий Methylobacterium dichloromethanicum DM4 участвовать в биоэлектрокаталитическом окислении формальдегида в присутствии ферроцена как основы при разработке амперометрических биосенсоров для мониторинга Ci-соединений.
Материалы и методы
Материалы. Графитовую пудру («Fluka», Германия), парафиновое масло («Fluka», Германия), ферроцен («Aldrich», Германия), применяли для создания рабочего электрода. Остальные реагенты были марки ч.д.а. производства Dia-M (Москва, Россия).
Микроорганизмы. Объектом исследования были метилобактерии Methylobacterium dichloromethanicum DM4, которые получены из лаборатории метилотрофных бактерий УРАН Института биохимии и физиологии микроорганизмов имени Г.К. Скрябина РАН.
Methylobacterium dichloromethanicum DM4 выращивали на качалке (180 об/мин) при 29°С в колбах со средой «К», содержащей (г/л): KH2PO4 2, (NH4)2SO4 2, NaCl - 0.5, MgSO4x7H2O 0.125, FeSO4 x 7ЩО 0.002, рН 7.2. В качестве источника углерода и энергии добавляли 0.5 % метанола (по объему).
Получение ферментных фракций. Клетки в экспоненциальной фазе роста центрифугировали (11000 об/мин, 15мин), дважды отмывали 0,05 М фосфатным буфером (рН=7.0) с последующим ресуспендированием в том же буфере. Клетки разрушали на ультразвуковом генераторе УЗГ13-0,1/22 при охлаждении льдом: 12 циклов по 10 секунд с интервалом 15 секунд. Экстракт после разрушения центрифугировали при 5000 g в течение 15 мин при 4°C. Клеточные мембраны отделяли центрифугированием при 14000 g в течение
30 мин при 4°C. Для дальнейших исследований использовали бесклеточный экстракт и фракцию суммарных мембран.
Биосенсорные измерения. Электрохимические измерения проводили при помощи амперометрической биосенсорной системы (гальванопотенциос-тата) IPC-Micro (Вольта). В качестве основы для рабочего электрода использовали медиаторный электрод на основе графитовой пасты с добавлением 10 % ферроцена в качестве медиатора. Электродом сравнения служил хлорсеребряный электрод. В качестве биоматериала для формирования рабочего электрода использовали целые клетки метилобактерий, мембранные фракции и бесклеточный экстракт клеток после разрушения биомассы ультразвуком. Для измерений электроды (рабочий, содержащий иммобилизованные биопрепараты метилобактерий и хлорсеребряный электрод) погружали в электролитическую ячейку объемом 4 мл, содержащую раствор фосфатного буфера pH 7,2. Измерения выполняли при постоянном перемешивании. Зависимость силы тока микробного электрода от времени регистрировали при фиксированном потенциале (Е=250 мВ). В качестве исследуемых растворов использовали метанол и формальдегид. Измеряемыми параметрами сигнала сенсора в процессе каталитического окисления субстрата являлись тангенс угла наклона отклика биосенсора и амплитуда изменения тока. Рабочий электрод между периодами измерений хранили в калий-фосфатном буфере pH=7,2 при температуре +4°С.
Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с помощью компьютерной программы Sigma Plot 10.0 и Microsoft Office Excel.
Результаты и обсуждение
В клетках метилотрофных бактерий в реакциях окисления метанола принимают участие мембранлокализованные дегидрогеназы, связанные с дыхательной цепью бактерий. Метанол окисляется до формальдегида под действием фермента метанолдегидрогеназы (МДГ, КФ 1.1.99.8), кофактором которого является пирролохинолинхинон (PQQ) [3]. Активные центры ферментов способны взаимодействовать с ферроцений-ионом (Fc+), восстанавливая его до ферроцена (Fc). При наложенном на рабочий электрод потенциале ферроцен окисляется до ферроцений иона (рис.2).
Сила тока, протекающего в системе, зависит от эффективности взаимодействия биокатализаторов с метанолом и медиатором [9]. Нами было высказано предположение, что использование разрушенных клеток бактерий в качестве биокатализаторов увеличит доступность ферментных систем, в том числе МДГ, для медиатора — ферроцена. Целые клетки бактерий, выращенные до экспоненциальной фазы роста разрушали ультразвуком и подвергали дифференциальному центрифугированию. Учитывая тот факт, что дегидрогеназы метилобактерий имеют цитоплазматическую (формальдегиддегидрогеназа) и мембранную локализацию (МДГ), для
Рис. 2. Схема функционирования амперометрических медиаторных
электродов
дальнейших исследований использовали бесклеточный экстракт и фракцию суммарных мембран в качестве биокатализаторов наряду с целыми клетками. Отклики медиаторных биосенсоров получали в виде зависимости силы тока I от времени I при соответствующем рабочем потенциале.
Специфичность биорецепторов оценивали по величине откликов сенсора на одну и ту же концентрацию субстрата. В качестве субстратов использовали спирты различного строения, амины, галометаны, глюкозу, так как есть сведения о способности метилотрофных бактерий окислять данные субстраты, а также нитросоединения, амиды карбоновых кислот, сложные эфиры [10, 11] (рис. 3).
<] 2000 Он 1800
ё
я 1400
600
400
200
0
т ■ целые клетки И бесклеточный экстракт □ мембранные фракции
1
ТТ х | 71 л'
НЕ ч.И 1а. ь, 1 . != . 1 ■1а,- _ в —,
Рис. 3. Субстратная специфичность рецепторных элементов на основе целых клеток, бесклеточного экстракта и мембранных фракций метилотрофных бактерий МвШу1оЪас1вгтт (ИсЫототвШатсит БМ4
Целые клетки метилотрофных бактерий характеризуются практически одинаковой окислительной активностью по отношению к метанолу и его гомологам. Сенсоры с биорецепторами на основе бесклеточного экстракта
и мембранных фракций М. (ИсЫоготвШатсит имеют практически одинаковые по величине ответы на формальдегид — 1500±140 нА и 1600±200 нА, соответственно. Сенсор на основе мембранной фракции позволяет проводить селективное определение формальдегида в присутствии других соединений.
Наилучшей операционной стабильностью обладают биосенсоры на основе целых клеток (относительное стандартное отклонение для 15 последовательных измерений составило 7,5%). В то же время, после 8 суток хранения отклик биосенсора на основе целых клеток уменьшился на 95 %, а на основе бесклеточного экстракта только на 33,3 %.
Зависимости силы тока (отклика биосенсора) от концентрации формальдегида для всех трех типов биосенсоров носят гиперболический характер, что обусловлено биокаталитической природой анализируемого сигнала (рис.4).
Рис. 4. Зависимости откликов медиаторных сенсоров на основе биопрепаратов метилобактерий М. (ИсЫогошвШатсиш в присутствии медиатора электронного транспорта ферроцена от концентрации
формальдегида
Полученные калибровочные зависимости аппроксимировали уравнением, подобным уравнению ферментативной кинетики Михаэлис-Ментен [12].
Коэффициент чувствительности рассчитывался как тангенс угла наклона линейного участка калибровочной зависимости, а предел обнаружения рассчитывался по формуле: Стпр = 3йо /Б, где $ — коэффициент
чувствительности; ¿о — стандартное отклонение аналитического сигнала фона [13].
В результате сравнительного анализа аналитических и метрологических характеристик биосенсоров на основе трех биорецепторов метилобактерий были выявлены наиболее перспективные для определения формальдегида биокатализаторы. Полученные аналитические и метрологические характеристики, а также параметры градуировочных зависимостей биосенсоров приведены в таблице.
Аналитические и метрологические характеристики биосенсоров кюветного и проточно-инжекционного типов для определения содержания метанола
Характеристика биосенсора биопрепарат
целые клетки бесклеточны: экстракт мембранные фракции
Предел обнаружения, мМ 0,33 0,064 0,049
Верхняя граница линейного диапазона определяемых концентраций, мМ 8±3 7,9±0,4 7,0±0,5
Коэффициент чувствительности, нА/мМ 5,4± ±0,4 42±2 25±3
Время отклика, концентрация субстрата равна 1мМ, с 70-100 140-190 150-200
Время единичного анализа, с 200 300 300
Повторяемость, отклонение от среднего значения за 15 измерений, % 3,5 6,6 7,3
Биорецептор на основе бесклеточного экстракта бактерий М. (ИсЫототвЬНатсит характеризуется наилучшим показателем коэффициента чувствительности, что может быть связано с тем, что в бесклеточном экстракте доступность фермента больше, и с высокой активностью формальдегиддегидрогеназы, имеющей цитоплазматическую локализацию. Коэффициент чувствительности для сенсора на основе мембранной фракции почти в 2 раза ниже по сравнению с коэффициентом чувствительности для бесклеточного экстракта. Этот факт объясняется тем, что фермент МДГ, имееющий мембранную локализацию, обладает относительной субстратной специфичностью и помимо природного субстрата метанола окисляет первичные спирты и формальдегид [14, 15].
Изучение операционной стабильности биорецепторов показало, что биорецепторы на основе бесклеточного экстракта и мембранных фракций бактерий М. (ИМоготеЛНатсит уступают по этому показателю
биорецептору на основе целых клеток, что может быть связано с быстрой потерей ферментативной активности в разрушенных клетках.
Временные затраты метода, то есть показатель его экспрессности, определяются в первую очередь длительностью единичного измерения. Время отклика составляет 70-200 с в зависимости от концентрации субстрата и типа биокатализатора; время восстановления активности биорецептора после измерения составляет около 100 с. Установлено, что время единичного определения при использовании целых клеток в качестве биорецепторов существенно ниже, чем при использовании мембранных фракций и бесклеточного экстракта.
Заключение
Таким образом, биорецептор на основе целых клеток обладает хорошей операционной стабильностью и пригоден для большего числа измерений. В свою очередь, биорецепторы на основе мембранных фракций и бесклеточных экстрактов селективны и чувствительны по отношению к формальдегиду.
Полученные в ходе работы результаты показывают, что амперометрические медиаторные биосенсоры на основе биопрепаратов метилотрофных бактерий могут применяться для мониторинга формальдегида на предприятиях, в объектах окружающей среды, в биотехнологическах производствах.
Список литературы
1. Троценко Ю.А., Доронина Н.В., Торгонская М.Л. Аэробные метилобактерии. Пущино: ОНТИ ПНЦ РАН, 2010. 325 с.
2. Anthony C. Quinoprotein-catalysed reactions // U.K. Biochem. J. 1996. V. 320. P. 697-711.
3. Zheng Y.J., Bruice T.C. Conformation of coenzyme pyrroloquinoline quinone and role of Ca2+ in the catalytic mechanism of quinoprotein methanol dehydrogenase // Biochemistry. 1997. V.94. P.11881-11886.
4. Oubrie A., Dijkstra B.W. Structural requirements of pyrroloquinoline quinine dependent enzymatic reactions // Protein Science. 2000. №9. P.1265-1273.
5. Перевалова Э.Г., Решетова М.Д., Гранберг К.И. Методы элементоорганической химии. Ферроцен. М.: Наука, 1983. 557 с.
6. Влияние электронных эффектов заместителей в молекулах ферроценов на их медиаторные свойства в биосенсоных системах на основе бактерий Gluconobacter oxydans/ Е.Ю. Чигринова [и др.] // Изв. ТулГУ. Естественные науки. 2008. Вып.2. С.238-245.
7. Микробные сенсоры на основе производных ферроцена и бензохинона, применяемых в качестве медиаторов / Е.Ю. Чигринова [и др.] // Сенсорные системы. 2007. Т.21. №3. С.263-269.
8. Smolander M., Buchert J., Viikari L. Large-scale applicable purification and characterization of a membrane - bound PQQ-dependent dehydrogenase // Biotech. J. 1993. №29. P.287-297.
9. Habermuller K., Mosbash M, Schuhmann W. Electron-transfer mechanisms in amperometric biosensors // Fresenius J. Anal. Chem. 2000. V.366. P.560-568.
10. Anthony C. The biochemistry of methylotrophs. London: Academic Press, 1982. P.251.
11. Mountfort D.O. Oxidation of Aromatic Alcohols by Purified Methanol Dehydrogenase from Methylosinus trichosporium // Bacteriology J. 1990. V.172. №7. P.3690-3694.
12. Criterion for Hill equation validity for description of biosensor calibration curves / B.I. Kurganov [et al.] // Analitica Chimica Acta. 2011. №427. P.11-19.
13. Основы аналитической химии. Задачи и вопросы: учебное пособие для вузов / В.И. Фадеева [и др.]. М.: Высшая школа, 2002. 412 с.
14. Anthony C, Williams P. The structure and mechanism of methanol dehydrogenase // Biochim. Biophys. Acta. 2003. V. 1647. P. 18-23.
15. Anthony C. Bacterial oxidation of methane and methanol // Adv. Microb. Physiol. 1986. V. 27. P. 113-210.
Кузнецова Татьяна Александровна (tatulyakuz@mail.ru), кафедра химии, Тульский государственный университет.
Понаморева Ольга Николаевна (olga@tsu.tula.ru), к.х.н., доцент, кафедра химии, Тульский государственный университет.
Решетников Александр Сергеевич (reshetnikovas@rambler.ru), к.б.н., старший научный сотрудник, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино.
Горячева Анастасия Анатольевна (goryachevanastya@rambler.ru), к.х.н., доцент, кафедра химии, Тульский государственный университет.
Фунтикова Татьяна Вячеславовна, студент, кафедра химии, Тульский государственный университет.
Bioelectrocatalytic oxidation of formaldehyde by methylobacteria Methylobacterium dichloromethanicum DM4 in
the presence of ferrocene
T. A. Kuznetsova, O.N. Ponamoreva, A. S. Reshetnikov, A. A. Goryacheva,
T. V. Funtikova
Abstract. The results of the bioelectrocatalytic processes investigation of formaldehyde oxidation by the whole cells and membrane fractions of methylobacteria Methylobacterium dichloromethanicum DM4 in the presence of ferrocene are presented. It was shown that such systems can be useful for development of amperometric biosensors for monitoring one-carbon compounds. The comparative analysis of analytical and metrological characteristics of mediator biosensor
has been carried out. It was shown, that the biosensor on a basis of membrane fractions is characterized by the best selectivity for formaldehyde.
Keywords: methylobacteria, biosensor, mediator, ferrocene, formaldehyde.
Kuznetsova Tatiana (tatulyakuz@mail.ru), department of chemistry, Tula State University.
Ponamoreva Olga (olga@tsu.tula.ru), candidate of chemical sciences, associate professor, department of chemistry, Tula State University.
Reshetnikov Alexander (reshetnikovas@rambler.ru), candidate of biological sciences, senior researcher, Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms of RAS , Pushchino.
Goryacheva Anastasia (goryachevanastya@rambler.ru), candidate of chemical sciences, associate professor, department of chemistry, Tula State University.
Funtikova Tatiana, student, department of chemistry, Tula State University.
Поступила 17.01.2012
