CC BY
41
МЕТОДЫ И СРЕДСТВА КОНТРОЛЯ
Быстрые методы контроля микробиологической чистоты
в пищевой промышленности
В.Г. Фрунджян, Н.Н. Угарова
Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова
Для производства качественных продуктов питания необходимо контролировать микробную обсемененность исходного пищевого сырья и продуктов его переработки на разных стадиях технологической цепочки. Существующие классические микробиологические методы не позволяют осуществлять такой контроль в режиме реального времени (длительность анализа - от 24-48 ч до нескольких суток). Кроме того, эти методы трудоемки, для их применения требуются специализированные помещения и подготовленный персонал, в результате анализа образуется большое количество потенциально опасных биологических отходов. Поэтому в настоящее время большое значение приобретают косвенные методы контроля микробной обсеменен-ности пищевого сырья - так называемые методы быстрой микробиологии. Эти методы основаны на измерении в анализируемом образце какого-либо физико-химического параметра, абсолютное значение которого или его изменение пропорциональны содержанию микробных клеток. Один из наиболее перспективных - биолюминесцентный метод, согласно которому в анализируемом образце измеряют концентрацию аденозин-5'-трифосфа-та (АТФ) из микробных клеток, которая пропорциональна титру жизнеспособных клеток. Концентрацию АТФ определяют с помощью фермента люци-феразы светляков, катализирующего окисление органического вещества Р-люциферина согласно схеме:
Р-люциферин + АТФ + Мд2+ +
+ О люцифераза светляков
оксилюциферин + АМФ + ФФ1 + СО2 + Н/,
где ФФ1 - пирофосфат; Ну - испускаемый в ходе реакции квант света.
Интенсивность свечения строго пропорциональна концентрации АТФ в реакционной смеси - чем больше АТФ в образце, тем интенсивнее свечение. Для регистрации свечения используют портативные недорогие приборы - лю-минометры. В настоящее время проце-
дура измерения ультрамалых (до фем-томолярных) концентраций АТФ хорошо разработана и занимает не более 12 мин. Многие компании производят коммерчески доступные реагенты для измерения концентрации АТФ (АТФ-реагенты) и люминометры. К сожалению, в пищевой промышленности для контроля микробиологической чистоты биолюминесцентный метод еще не нашел широкого применения. Любое пищевое сырье содержит немикробный АТФ, концентрация которого может намного превышать концентрацию микробного АТФ. Поэтому для правильной оценки микробиологической чистоты пищевого сырья биолюминесцентным методом необходимо проводить предварительную подготовку образца, назначение которой - удаление и/или разрушение в образце немикробного АТФ. При этом микробные клетки в образце должны оставаться интактными.
Сырое сборное молоко является сырьем для получения различных молочных и молочно-кислых продуктов. Количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ) - один из основных санитарных показателей качества сырого сборного молока, который учитывают при выборе путей дальнейшей переработки молока и формирования закупочной цены. В зависимости от сорта в сыром сборном молоке допускается КМАФАнМ - 100 - 20000 тыс. КОЕ/см3. Длительность определения КМАФАнМ сырого сборного молока стандартным микробиологическим методом посева разведений составляет 72 ч. Нами был разработан ускоренный биолюминесцентный метод. В сыром молоке очень высока концентрация немикробного АТФ - суммы АТФ из соматических клеток молока и свободного АТФ, что не позволяет определять микробный АТФ в молоке без предварительной подготовки образца. Для удаления немикробного АТФ молоко фильтровали через бактериальный мембранный фильтр с порами 0,45 мкм. Для разрушения в молоке белковых мицелл и жира, которые затрудняют фильтрование, разработали специ-
альный реагент - комплекс протеаз и детергента, инкубирование с которым анализируемого образца (45 'С, 10 мин) приводит к разрушению казеиновых мицелл и соматических клеток молока, плавлению и солюбилизации молочного жира. После такой обработки молоко легко фильтруется, при этом немикробный АТФ удаляется с фильтратом, а интактные микробные клетки концентрируются на мембранном фильтре. Для фильтрования были использованы специализированные лю-минометрические микрокюветы -фильтраветы, дно которых выполнено из бактериального мембранного фильтра с порами 0,45 мкм (рис. 1).
Фильтраветы позволяют совместить выполнение несколько стадий анализа молока - удаление немикробного АТФ фильтрованием, концентрирование микробных клеток, их разрушение для высвобождения микробного АТФ и измерение концентрации микробного АТФ. Применение фильтравета существенно упростило анализ, повысило точность и снизило предел обнаружения микробных клеток в молоке до 50 тыс. КОЕ/см3 при длительности анализа 20-25 мин/образец. Коэффициент корреляции биолюминесцентного метода со стандартным микробиологическим - 0,92. Биолюминесцентный метод в данной модификации прошел успешную апробацию на ряде молочных предприятий и в 2005 г. был введен в национальный стандарт - ГОСТ Р 52415-2005 «Молоко натуральное коровье - сырье. Люминесцентный метод определения количества мезо-фильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов».
Биолюминесцентный метод был также адаптирован нами для определения КМАФАнМ кускового мяса и мясного фарша. Для удаления немикробного АТФ из смыва с анализируемого образца также использовали фильтрование через фильтраветы. Для предобработки смыва (разрушение мышечных волокон и клеток крови) был разработан специальный реагент на основе
(■'.:■ 10 мм ■«-►
Мембранный фильтр с порами 0,45 мкм
Рис. 1. Кювета для фильтрования образца, концентрирования микробных клеток на фильтре и измерения концентрации АТФ с помощью люминометра
METHODS AND MEANS OF CONTROL
Рис. 2. Набор для определения КМАФАнМ сырого молока
крабовой коллагеназы и детергента. Длительность анализа мясного фарша биолюминесцентным методом составляет 35 мин/образец, вместо 48 ч при использовании стандартного микробиологического метода, предел обнаружения - 10 тыс. КОЕ/г. Коэффициент корреляции биолюминесцентного ме-
тода со стандартным микробиологическим - 0,96.
Биолюминесцентный метод также был адаптирован для оценки санитарной чистоты поверхностей технологического оборудования. В смывах, полученных с поверхностей с обсемененно-стью свыше 1000 КОЕ/см2, концентрацию микробного АТФ можно определять без предварительного инкубирования смыва в питательной среде. В смывах с чистых поверхностей, с обсе-мененностью ниже 1000 КОЕ/см2, концентрацию микробного АТФ можно определять после предварительного инкубирования в питательной среде в течение 3-5 ч.
Для анализа КМАФАнМ сырого сборного молока, кускового мяса и мясного фарша, контроля санитарной чистоты поверхностей на основании наших разработок ООО «Люмтек» наладило выпуск наборов лиофилизиро-ванных и стерильно расфасованных реагентов длительного хранения (рис. 2), которые позволяют проводить анализ не только в специализированной микробиологической лаборатории, но и непосредственно на ферме, в полевых условиях. Для регистрации светового сигнала совместно с ООО «Люмтек» был разработан высокочувстви-
Рис. 3. Люминометр ЛЮМ-1
тельный портативный люминометр ЛЮМ-1, работающий в режиме счетчика фотонов (рис. 3).
Люминометр ЛЮМ-1 превосходит по своей чувствительности многие зарубежные аналоги, имеет удобный интерфейс для подсоединения к компьютеру, программное обеспечение, может работать от стационарного источника питания и от батареи. В 2006 г. люминометр ЛЮМ-1 был сертифицирован и внесен в реестр РФ измерительных приборов под номером 28874.
