CC BY
28
УДК 579.088; 577.158.54
БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕЙ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ОБСЕМЕНЕННОСТИ СЫРОГО МОЛОКА
В. Г. Фрунджян, Н. Н. Угарова*
(кафедра энзимологии химического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова; Воробьевы горы, Москва 119899, Россия; факс: (095) 939-54-17; e-mail: UNN@enz.chem.msu.ru)
Модифицирована методика биолюминесцентного определения общей бактериальной обсеме-ненности сырого молока, включающая: 1) разрушение казеиновых мицелл молока и соматических клеток при инкубировании образца со смесью панкреатина и неонола-10; 2) удаление небактериального АТР фильтрованием через мембранный фильтр; 3) разрушение бактериальных клеток диметилсульфоксидом; 4) измерение концентрации АТР биолюминесцентным методом. Стадии (2)-(4) выполняют в кювете Filtravette, дном которой является бактериальный мембранный фильтр (поры 0,45 мкм), что позволяет сократить длительность анализа 1 образца до 15 мин. Предел обнаружения ОБО составляет 103 КОЕ на 1 мл молока. Коэффициенты корреляции (R) и остаточные стандартные отклонения (Sxy) предложенного метода с методом посева разведений составили 0,98 и 0,28 для образцов стерилизованного молока, искусственно контаминированного чистой культурой Escherichia coli, 0,92 и 0,30 -для сырого молока (n = 20).
Общая бактериальная обсемененность (ОБО) молока -один из основных показателей санитарного качества продукта. Длительность анализа ОБО молока прямым методом (посева разведений) составляет 72 ч, поэтому для оценки ОБО в масштабе реального времени используют различные косвенные методы [1-3], среди которых наибо-
лее перспективным является биолюминесцентная АТР -метрия [4].
Ранее нами была разработана методика биолюминесцентного определения ОБО сырого молока с пределом обнаружения бактериальных клеток 0,5.105 КОЕ/мл и продолжительностью анализа 1 образца 25-30 мин [5]. Однако
*Адресат для переписки.
она была довольно трудоемкой и включала большое количество операций. Целью настоящей работы была разработка модифицированной методики определения ОБО сырого молока, которая позволила бы сократить продолжительность анализа до 15 мин и повысить чувствительность определения ОБО молока в 50 раз.
Материалы и методы
Использованные вещества и растворы. Панкреатин медицинский (ОАО «Самсон», Россия) (акт. 178 казеиновых ед/г) суспендировали в воде или в 5%-м растворе неонола-10 (НПО «Нижнекамск», Россия) в 0,1 М Na-фосфат-цитратном буфере (pH 7,2) или в вышеуказанном буфере, получая 20%-е суспензии, которые центрифугировали (16 000 g, 20 мин) для удаления нерастворимых примесей, а затем фильтровали через стерильные мембранные фильтры (поры 0,22 мкм). Фильтраты разливали по 0,2 мл в пенициллиновые флаконы, замораживали в жидком азоте и лиофилизовали в течение 24 ч. Протеоли-тическую активность полученных ферментных препаратов определяли по скорости гидролиза этилового эфира N-ацетил-а-тирозина (АТЭЭ) («Reanal», Венгрия) потен-циометрическим титрованием на pH-стате («Radiometer», Дания).
Лиофилизованный АТР -реагент Микролюм (химический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова), содержащий растворимую люциферазу светляков, D-люциферин, соль магния и компоненты буфера [6], реконструировали деио-низованной водой, полученной на установке «Milli-Q» («Millipore», Франция). Стандартный 1 мМ раствор АТР («Sigma», США) в деионизованной воде готовили по навеске, замораживали порциями по 0,5 мл, хранили при 20°. Перед использованием отдельную порцию размораживали и разбавляли до концентрации 0,1-10 нМ свеже-перегнанным диметилсульфоксидом (ДМСО) («Реахим», Россия).
Использовали стерилизованное молоко «Пармалат» (Лианозовский молочный комбинат, Москва) и сырое молоко, отобранное из танков и хранившееся до проведения анализа на холоде. Стерилизованное молоко ком -натной температуры контаминировали трехчасовой бульонной культурой E. coli (штамм LE392), получая образцы молока с обсемененностью в интервале 10-10° кл/ мл. Титр клеток E. coli в исходной культуре определяли по светорассеянию при 590 нм (1 ед. опт. пл. соответствует 5108 кл/мл). Аликвоты сырого молока непосредственно перед анализом разбавляли в 10-1000 раз стерилизованным молоком, получая образцы молока с различной ОБО.
Определение ОБО молока методом посева разведений (КОЕ/мл). Использовали модифицированную агаровую среду для определения ОБО молока и молочных продуктов (Ставропольский ЭБТЗ, Россия). Количество колонеобразующих единиц (КОЕ) в молоке определяли согласно [7].
Определение концентрации бактериального АТР в молоке биолюминесцентным методом. Анализировали по три аликвоты каждого образца молока, проводя все эксперименты в ламинаре GS («Babcock», Германия). Алик-
воту (1 мл) тщательно перемешанного молока вносили во флакон с лиофилизованным панкреатином и инкубировали в водяной бане (45°, 10 мин). Через фильтр кюветы Filtravette («New Horizons Diagnostics Corp.», США) [8], помещенной на стерильную фильтровальную бумагу, последовательно фильтровали 100 мкл прогретого (45°) физиологического раствора, содержащего 1% неонола-10 (промывочный раствор), 100 мкл инкубированного молока и вновь 200 мкл промывочного раствора. После каждого фильтрования кювету при помощи пинцета перемещали на сухой участок фильтровальной бумаги. Избыточное давление над кюветой создавали при помощи шприца. Кювету помещали в кюветное отделение люминомет-ра «3550i» («New Horizons Diagnostics Corp.», США) и дозатором последовательно вносили 10 мкл ДМСО и 90 мкл АТР-реагента Микролюм, быстро перемешивали, дважды прокачивая содержимое кюветы через наконечник дозатора, и измеряли интенсивность биолюминесценции (/макс).
Для каждой партии АТР-реагента Микролюм получали градуировочную зависимость между концентрацией АТР и интенсивностью биолюминесценции (1), которую использовали для определения концентрации бактериального АТР в молоке. Для этого к 10 мкл стандартного раствора АТР (0,1, 1 и 10 нМ) в ДМСО добавляли 90 мкл АТР -реагента Микролюм, быстро перемешивали и фиксировали интенсивность биолюминесценции (/макс):
v макс^
1В([АТР]) = а + b • lg(/MaJ.
(1)
Результаты измерений обрабатывали по методу [7] и [9], затем рассчитывали коэффициенты А, В уравнения линейной регрессии (2), коэффициент корреляции (Я) между содержанием в молоке АТР и КОЕ и остаточное стандартное отклонение (5" ) [10]:
^(КОЕ/мл молока) = = А + В• ^([АТРбакг], пмоль/мл молока).
(2)
Результаты и их обсуждение
В описанной ранее методике [5] проводили многократное пипетирование и перенос анализируемого образца и реагентов из одной емкости в другую в ходе анализа, что повышало его трудоемкость и служило источником случайных погрешностей. Реагент на основе панкреатина медицинского готовили непосредственно перед анализом. Концентрацию бактериального АТР измеряли с помощью АТР-реагента Иммолюм [6] с пределом обнаружения АТР в присутствии ДМСО на уровне 10 нМ.
В модифицированной методике для упрощения и сокращения продолжительности анализа использовали лио-филизованный стандартизированный реагент на основе панкреатина и неонола-10, а также специальные люмино-метрические кюветы РИ1гауеие.
Для повышения чувствительности определения ОБО молока измерение концентрации АТР проводили при помощи АТР-реагента Микролюм с пределом обнаружения АТР в присутствии ДМСО на уровне 0,1 нМ.
Стандартизация реагента на основе панкреатина и неонола-10. Сравнивали протеолитическую активность
105
10Ч -
103 -
АТФ, пмоль / мл молока
—I---1—
0,01 0,1
—1-1-1-1-г
1 0 1 00 1 000
106
10J -
W
о и
10Ч -
10J
АТФ, пмоль / мл молока
—I-1-1—
0,01 0,1
10
-1-1-г
100 1000
Зависимость между содержанием бактериального АТР и количеством клеток в молоке: а — стерилизованном, искусственно контаминированном клетками E. coli, б — сыром
различных лиофилизованных препаратов панкреатина по скорости гидролиза АТЭЭ. Наиболее высокая протеолити-ческая активность была у препарата, полученного после лиофилизации раствора панкреатина в 5%-м неоноле-10 с 0,1 М Na-фосфат-цитратным буфером. У такого препарата панкреатина протеолитическая активность до и после лиофилизации практически не менялась. Реконструирование лиофилизованного панкреатина целесообразно проводить молоком, так как в этом случае концентрации детергента и протеолитических ферментов панкреатина в анализируемом образце наиболее высокие. Лиофилизован-ный панкреатин стабилен при хранении на холоде в течение нескольких месяцев.
Фильтрование образцов молока. Дно люминометри-ческой кюветы Filtravette выполнено из мембранного
фильтра (диаметр диска 5 мм, поры 0,45 мкм). В такой кювете можно проводить выделение и разрушение бактериальных клеток образца, а также измерять концентрацию бактериального АТР. Через кювету Filtravette удавалось фильтровать до 300 мкл молока после инкубирования в смеси с панкреатином и неонолом-10, но воспроизводимо фильтровалось лишь 100 мкл. Фильтрование таких малых объемов не оказывает сильного стрессового воздействия на бактериальные клетки молока, при котором уровень внутриклеточного АТР резко снижается. Поэтому отпадает необходимость инкубирования с глюкозой выделенных на мембранном фильтре бактериальных клеток [5].
Измерение концентрации бактериального АТР в молоке. Люцифераза светляков в составе АТР-реагента Мик-ролюм в большой степени подвержена ингибирующему действию ДМСО, который используют для разрушения бактериальных клеток. Поэтому варьировали объемное соотношение образца (раствор АТР в ДМСО) и АТР -реагента Микролюм в реакционной смеси (1:9, 1:14 и 1:19), а также полный объем реакционной смеси (от 100 до 200 мкл). Предел обнаружения АТР во всех вариантах был на уровне 0,1 нМ, но для измерений наиболее удобными оказались соотношение 1:9 и величина полного объема реакционной смеси 100 мкл.
Использование вышеописанных условий позволило получить зависимости между содержанием бактерий и кон -центрацией бактериального АТР для двух типов образцов молока: I (стерилизованное, контаминированное бульонной культурой E. coli), II (сырое, разбавленное стерилизованным молоком для получения образцов в широком диапазоне обсемененности).
Для образцов молока типа I такая зависимость хорошо описывается уравнением (2). Предел обнаружения бактериальных клеток составляет 103 кл/мл, а величины R и S - 0,98 и 0,28 соответственно (таблица и рисунок, а).
При анализе образцов молока типа II была также получена зависимость (2) с высокой степенью корреляции между содержанием КОЕ и концентрацией бактериального АТР. Предел обнаружения бактериальных клеток составил 1 03 КОЕ/мл, а величины R и S - 0,92 и 0,30 соответ-
ху
ственно (таблица и рисунок, b). Однако у таких образцов молока был отмечен существенный разброс экспериментальных данных, вызванный неравномерным распределением бактериальных клеток в сыром молоке [5], которое невозможно полностью устранить даже при интенсивном
Коэффициенты А и В уравнения (2), коэффициенты корреляции (Я) между биолюминесцентным методом и методом посева разведений, остаточные стандартные отклонения (5.^)
106 -
1
1
Образец А В R Sxy
Стерилизованное молоко, контаминированное клетками E. coli Сырое молоко (расчет А и В по массивам средних ариф метических) Сырое молоко (расчет А и В по массивам медиан) 4,52±0,14 5,17±0,10 5,26±0,09 0,59±0,07 0,96±0,10 0,97±0,09 0,98 0,92 0,93 0,28 0,30 0,31
перемешивании образца. Поэтому при статистической обработке результатов эксперимента по методу [7], рассчитывая среднее арифметическое, отбрасывали отдельные «сорные» данные. В случае величин биолюминесцентных сигналов это можно было сделать достаточно просто. Однако определить, какие из величин КОЕ являются истинными, а какие «сорными», в некоторых случаях было достаточно сложно, так как согласно [7] можно учитывать все чашки с посевами последовательных десятикратных разведений, на которых выросло от 30 до 300 КОЕ. В работе [9] предложен метод расчета, позволяющий получать относительно правильные результаты, не прибегая к отбрасыванию отдельных «сорных» данных, тем более когда
отсутствует критерий, позволяющий выделять их среди результатов измерений. Согласно данному методу вместо среднего арифметического рассчитывается медиана, а вместо стандартного отклонения - медиана абсолютных отклонений от медианы.
По всем результатам измерений образцов сырого молока, в том числе «сорным», рассчитывали медианы кон -центрации бактериального АТР и медианы КОЕ и использовали полученные величины для расчета коэффициентов А и В уравнения (2). Как видно из таблицы, коэффициенты А и В практически не изменились, сходимость двух методов осталась высокой, но при этом отпала необходимость сортировки экспериментальных данных.
Работа частично финансировалась Министерством науки по подпрограмме «Новейшие методы биоинженерии» по проекту
«Биокаталитические технологии».
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Purnendu C.V. // J. Dairy Sci. 1993. 76. P. 3101.
2. Rowlands A., Barkworth H., Hosking Z., Kemphorne O. // J.
Dairy Res. 1950. 17. P. 161.
3. Petty R.D., Sutherland L.A., Hunter E.M., Cree I.A. // J. Biolum.
Chemilum. 1995. 10. P. 29.
4. Угарова Н.Н., Бровко Л.Ю., Трдатян И.А., Райнина Е.И. //
Прикл. биохим. микробиол. 1987. 23. С. 14.
5. Фрунджян В.Г., Бровко Л.Ю., Бабунова В.С., Карташова В.М.,
Угарова Н.Н. // Прикл. биохим. микробиол. 1999. 35. С. 321.
6. Brovko L.Yu., Ugarova N.N., Duhovich A.F. // Proceedings of the
6th International Symposium on Biolum. and Chemilum. «Bioluminescence and Chemiluminescence». 1990. Cambridge, 1991. P. 433.
7. ГОСТ 9225-84 с изменением № 2 от 28.09.89. Молоко и молоч-
ные продукты (Методы микробиологического анализа).
8. Cutter C.N., Dorsa W.J., Siragusa G.R. // Dairy, Food and
Environmental Sanitation. 1996. 16. P. 726.
9. Юфа Б.Я. // ЖАХ. 1989. XLIV. C. 2148.
10. International IDF Standard 128:1985. Milk. Determination and evaluation of the overall accuracy of indirect methods of milk analysis - application to calibration procedure and quality control in dairy laboratory. IDF General Secretariat. Belgium. 1985.
Поступила в редакцию 20.06.00
