CC BY
13
УДК 579.088; 577.158.54
БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ МИКРОБНОЙ ЗАГРЯЗНЕННОСТИ СЫРОГО РУБЛЕНОГО МЯСА
В.Г. Фрунджян, В.С. Бабунова* , Н.Н. Угарова
(Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, химический факультет, кафедра химической энзимологии; e-mail: vgf@enz.chem.msu.ru)
Разработан биолюминесцентный метод определения микробной загрязненности (количества мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов или КМАФАнМ) сырого рубленого мяса, основанный на измерении концентрации внутриклеточного микробного ATP. Для удаления немикробного ATP образцы обрабатывали смесью детергента и протеазы, после чего фильтровали через бактериальные мембранные фильтры. Для упрощения анализа использовали специальные лю-минометрические микрокюветы фильтравет™ (дно выполнено из бактериального мембранного фильтра), позволяющие концентрировать микробные клетки, экстрагировать микробный ATP и измерять биолюминесцентный сигнал в одной и той же кювете. Применение высокочувствительного ATP-реагента на основе рекомбинант-ной люциферазы светляков, разработанного в нашей лаборатории, и фильтравет™ позволило определять микробную загрязненность в сыром рубленом мясе с пределом обнаружения 103 КОЕ/г при длительности анализа ~100 мин вместо 48 ч согласно методу ГОСТ. Коэффициент корреляции (Л) предложенного метода с методом посева предельных разведений составил 0,99.
Микробная загрязненность (количество мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов или сокращенно КМАФАнМ) является одним из основных показателей санитарного качества сырого рубленого мяса. Согласно СанПиН [1] пригодным для употребления является сырое рубленое мясо с микробной загрязненностью не более 10 колоние-образующих единиц (КОЕ) в 1 г мяса, которую определяют стандартным методом посева предельных разведений при продолжительности анализа 48 ч [2]. В настоящее время для определения микробной загрязненности пищевого сырья и продуктов его переработки все шире используют методы "быстрой микробиологии", основанные на определении какого-либо физико-химического параметра образца, абсолютная величина которого или ее изменение пропорциональны концентрации КОЕ.
Наиболее перспективным является биолюминесцентный метод, основанный на измерении концентрации микробного аденозин-5'-трифосфата (ATP) в анализируемом образце при помощи люциферин-люцифераз-ной системы светляков [3]. Данный метод при продолжительности анализа от нескольких минут до нескольких часов позволяет определять только жизнеспособные микробные клетки [4], наличие которых в продуктах питания может быть опасным для
здоровья человека. В литературе описано применение биолюминесцентного метода для определения микробной загрязненности сырого рубленого мяса [5-7]. Из-за высокого остаточного содержания немикробного АТР (суммы свободного ATP и ATP соматических клеток) в анализируемых образцах предел обнаружения микробной загрязненности был выше 5х104 КОЕ/г. Для правильного определения микробной загрязненности биолюминесцентным методом необходимо проводить предварительную подготовку образцов, в ходе которой немикробный ATP существенно разрушается или удаляется из образца.
Цель нашей работы состояла в оптимизации биолюминесцентного метода для определения микробной загрязненности сырого рубленого мяса с пределом обнаружения 103 КОЕ/г.
Материалы и методы
Использованные вещества и растворы. Использовали лиофилизированный АТР -реагент (предел обнаружения ATP составял 2х10 16 моль/кювета люминометра), содержащий люциферазу светляков, D-люциферин, соль магния, компоненты буферной системы и стабилизаторы (химический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова) [8, 9], АТР ("Pharmacia", США), BPN-реагент (химический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова) [9], нео-нол-10 (НПО "Нижнекамск", Россия), NaIO4 ("Sigma",
* Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной санитарии, гигиены и экологии; Звенигородское ш. 5, Москва 123022, Россия)
США), диметилсульфоксид (ДМСО) свежеперегнанный ("Реахим", Россия), модифицированную агаровую среду для определения ОБО молока и молочных продуктов ("Ставропольский ЭБТЗ", Россия), среду LB ("ICN", США), деионизованную воду, полученную на установке "Milli-Q" ("Millipore", Франция).
Бульонную культуру Escherichia coli (штамм LE392) выращивали на среде LB (37°, 120-1, 3 ч). Титр клеток E. coli в исходной культуре определяли по светорассеянию при 590 нм, принимая, что 1 ед. опт. пл. соответствует 5x10s кл/мл.
Приборы и оборудование Измерения концентрации ATP проводили на люминометре 3550i (New Horizons Diagnostic Corp., USA). Для фильтрования образцов использовали микрокюветы фильтравет™ (New Horizons Diagnostic Corp., USA) и модифицированные фильтрационные ячейки Swinnex, 13 мм ("Millipore", Франция).
Подготовка образцов рубленого мяса для измерения концентрации микробного ATP. К 10 г рубленого мяса, искусственно контаминированного клетками E. coli (103-105 КОЕ/г), добавляли 20 мл среды 0,5xLB и гомогенизировали. Полученный гомогенат фильтровали через 4 слоя стерильной марли; 5 мл профильтрованного гомогената вносили во флакон с BPN-реаген-том и инкубировали в водяной бане при 45° в течение 60 мин. Фильтравет™ помещали в фильтрационную ячейку и при помощи шприца последовательно прокачивали 1 мл инкубированного гомогената и 5 мл промывочного раствора - физиологического раствора, содержащего 1% неонола-10 и 1-5 мМ NaIO4, который готовили непосредственно перед использованием. Фильтравет™ вынимали из фильтрационной ячейки, вносили 0,02 мл ДМСО и через 1-45 мин инкубирования при комнатной температуре проводили измерение концентрации ATP, как описано ниже.
Измерение концентрации микробного ATP (пмоль/мл) Для каждой партии ATP-реагента предварительно получали градуировочную зависимость (1) между концентрацией стандартных растворов ATP в ДМСО и максимумом интенсивности биолюминесцентного сигнала (I ). Для этого раствор ATP 10- М в деионизованной воде разбавляли ДМСО, получая растворы ATP с концентрацией 0,1, 1 и 10 пмоль/мл. Фильтравет™ помещали в кюветное отделение люми-нометра, вносили 0,18 мл ATP-реагента и 0,02 мл стандартного раствора ATP, быстро перемешивали,
1 TM
прокачивая содержимое фильтравет через наконечник дозатора, и регистрировали биолюминесцентный сигнал (I ). Полученные результаты представляли в виде градуировочной зависимости (1), которую далее использовали для определения концентрации микробного ATP в анализируемых образцах:
ВДАТР, пмоль/мл]) = а + вх^^). (1)
Для измерения концентрации ATP в анализируемых образцах в фильтравет™, содержащую микробный ATP в 0,02 мл ДМСО, вносили 0,18 мл ATP-реагента, перемешивали ее содержимое и регистрировали величину 1макс. Чтобы получить концентрацию микробного ATP в исходном образце (пмоль/г мяса), концентрацию микробного ATP, рассчитанную по зависимости (1), умножали на 0,04 для поправки на разбавление / концентрирование образца в ходе анализа. Каждый образец анализировали по 3 раза.
Определение микробной загрязненности сырого рубленого мяса методом посева предельных разведений (КОЕ/г) проводили по методу [2], посевы инкубировали 48 ч при 30°.
По экспериментальным данным, полученным биолюминесцентным методом и методом посева предельных разведений, рассчитывали коэффициенты А, В уравнения линейной регрессии (2) и коэффициент корреляции (R):
ВДАТР, пмоль/г мяса]) = А + ВхВДКОЕ/г мяса]). (2)
Результаты и их обсуждение
Микробные клетки в рубленом мясе, в отличие от крупнокускового, находятся не только на поверхности образца, но и в толще мышечных волокон, поэтому микробную загрязненность определяли в мясном гомо-генате. Нами показано, что в мясном гомогенате концентрация немикробного ATP находится на уровне —10 11 моль/мл. Поскольку для определения микробной загрязненности на уровне 103 КОЕ/г концентрация немикробного ATP в мясном гомогенате не должна превышать 10- моль/мл, ее необходимо было уменьшить в —10 раз. Для разрушения соматических клеток, высвобождения соматического ATP и его гидролиза мясной гомогенат инкубировали с BPN-реа-гентом при 45°, как описано в [9]. Время инкубирования, необходимое для разрушения соматических клеток и снижения концентрации немикробного до —10-моль/мл, составило 60 мин. Нами показано, что микробные клетки в ходе такого инкубирования не разрушаются, но и не делятся. Далее инкубированный го-могенат фильтровали через специальные люминомет-
л. TM
рические микрокюветы фильтравет , дно которых выполнено из бактериального мембранного фильтра с порами 0,45 мкм (рис. 1). Такая конструкция микрокювет позволяет не только удалять немикробный ATP из образца и концентрировать микробные клетки, но и проводить экстракцию микробного ATP, а также измерять биолюминесцентный сигнал в одной и той же кювете, что упрощает процедуру подготовки образца, повышает точность и чувствительность биолюминесцентного метода. Ранее нами было показано, что использование фильтравет™ при биолюминесцентном
Рис. 2. Разрушение остаточного соматического и микробного АТР на мембранном фильтре при помощи NaIO4: 1 - остаточный соматический АТР; 2 - микробный АТР, 104 клеток Е. coli на мембранном фильтре
Рис. 1. Люминометрическая микрокювета фильтравет
определении общей бактериальной обсемененности ( ОБО) сырого сборного молока позволяет снизить предел обнаружения ОБО с 5х104 [10] до 103 КОЕ/мл [9] и упростить проведение анализа. Через фильтравет™ удавалось воспроизводимо фильтровать не более 1 мл инкубированного мясного гомогената. При этом остаточная концентрация немикробного ATP на мембранном фильтре существенно возрастала, что не позволяло определять микробную загрязненность рубленого мяса с требуемой чувствительностью. Микро-скопирование мембранных фильтров показало, что некоторые мышечные волокна в ходе инкубирования с BPN-реагентом недостаточно полно разрушались и задерживались на них. Для разрушения остаточного немикробного ATP мембранный фильтр промывали промывочным раствором, содержащим NaIO4, который быстро разрушает ATP [11]. При использовании промывочного раствора с 1 мМ NaIO4 остаточная концентрация немикробного ATP уменьшалась в 2-3 раза, при этом микробные клетки не повреждались. Более высокие концентрации NaIO4 разрушали и микробные клетки (рис. 2). Полная экстракция ATP при помощи
Рис. 3. Зависимость от времени концентрации АТР, экстрагируемого ДМСО из осажденных на мембранном фильтре 105 клеток Е. coli
Рис. 4. Сотношение между содержанием микробного АТР (пмоль/мл) и микробным загрязнением (КОЕ/г) сырого рубленого мяса: К = 0,99, А = -5,21, В = 0,81
ДМСО в суспензиях микробных клеток занимает несколько секунд [11]. При экстракции ATP из микробных клеток, осажденных на мембранном фильтре, концентрация ATP в полученном экстракте увеличивалась со временем и достигала максимальной величины через 30 мин инкубирования при комнатной температуре (рис. 3).
Таким образом, для биолюминесцентного определения микробной загрязненности сырого рубленого мяса была предложена следующая методика. 10 г рубленого мяса гомогенизируют в 20 мл среды 0,5xLB, и полученный гомогенат фильтруют через 4 слоя стерильной марли. 5 мл фильтрата инкубируют с BPN-реагентом (60 мин, 45°). Через мембранный фильтр фильтравет™ фильтруют, как описано выше, 1 мл инкубированного мясного гомогената и 5 мл промывочного раствора, содержащего 1 мМ NaIO4, добавляют 0,02 мл ДМСО и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре. Добавляют 0,18 мл ATP-реа-
гента и измеряют биолюминесцентный сигнал (1макс). Рассчитывают концентрацию микробного ATP по гра-дуировочной зависимости (1), а затем по зависимости (2) определяют микробную загрязненность мяса.
С помощью данной методики нами были проанализированы образцы сырого рубленого мяса, искусственно контаминированного клетками E. coli в диапазоне 10-105 КОЕ/г. Результаты, представленные на
рис. 4, показывают высокую степень корреляции (Я = 0,99) между величинами [АТР, пмоль/г мяса] и [КОЕ/г мяса], определенными биолюминесцентным методом и методом посева предельных разведений соответственно. Предел обнаружения микробных клеток составил 103 КОЕ/г мяса при продолжительности анализа —100 мин/образец, вместо 48 ч по методу посева предельных разведений.
Данная работа выполнена при финансовой поддержке Международного контракта РМЫЪ-325785-А-02 и Госконтракта МН по проекту "Биокаталитические технологии".
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. СанПиН 2.3.2.560-96 "Гигиенические нормативы качества и бе-
зопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов (микробиологические показатели)".
2. ГОСТ 10444.15.94 "Продукты пищевые. Методы определения
КМАФАнМ".
3. Угарова Н.Н., Бровко Л.Ю., Лебедева О.В., Березин И.В. //
Вестн. Акад. мед. наук СССР. 1985. N 7. С. 88.
4. Угарова Н.Н., Бровко Л.Ю., Трдатян И.А., Райнина Е.И //
Прикл. биохим. микробиол. 1987. 23. N.1. С.14.
5. Stannard C.J., Wood J.M. // J. Appl. Bacterid 1983. 55. № 3.
P. 429.
6. Kennedy J.E., Oblinger J.I. // J. Food Prot. 1985. 48. P. 334.
7. Littel K.J., Pikelis S., Spurgash A. // J. Food Prot. 1986. 49. P. 18.
8. Патент на изобретение № 2164241 Реагент для определения
аденозин-5'-трифосфата. г. Москва, 20 марта 2001 г.
9. Фрунджян В.Г., Угарова Н.Н. // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Хи-
мия. 2000. 41. 6. С. 407.
10. Фрунджян В.Г., Бабунова В.С., Бровко Л.Ю. и др. // Прикл. биохим. микробиол.1999. 35. 3. С. 1.
11. Бровко Л.Ю., Трдатян И.А., Угарова Н.Н. // Прикл. биохим. микробиол. 1991. 27. С. 134.
Поступила в редакцию 25.10.02
