CC BY
18
УДК 577.158.54
СТАБИЛИЗАЦИЯ АТФ-РЕАГЕИТОВ, СОДЕРЖАЩИХ ЛЮЦИФЕРАЗУ СВЕТЛЯКОВ L. mingrelica, В ПРИСУТСТВИИ ПОЛИОЛОВ
И.А. Мороз, Д.Я. Гурский, И.И. Угарова
(кафедра химической энзимологии; e-mail: [email protected])
Получены АТФ-реагенты, содержащие 2-20% этиленгликоля, глицерина и ПЭГ-8000. По-лиолы ингибировали активность АТФ-реагентов на 20-40%, а добавки 0,75 мМ Тритона Х-100 предотвращали это ингибирование. Оптимальная концентрация полиолов составила 10%. Исследование кинетики термоинактивации АТФ-реагентов в растворе при 37, 20 и 4°С показало, что при всех изученных температурах полиолы повышали стабильность АТФ-реагентов в растворе в 2-5 раз. Раствор АТФ-реагентов при хранении (4°С) в течение 180 ч сохранял 100%-ю активность, а период полуинактивации составил 15 сут.
Люцифераза светляков катализирует реакцию окисления субстрата (люциферина) кислородом воздуха в присутствии аденозин-5 -трифосфата (АТФ) и ионов магния. Эта реакция сопровождается эмиссией видимого света - биолюминесценцией [1]. Интерес к данному биолюминесцентному процессу связан не только с изучением механизмов перехода энергии биохимической реакции в световую, но и с его большим практическим значением. Высокая чувствительность люциферазы светляков к АТФ, близкий к единице квантовый выход реакции и простота регистрации ферментативной активности обусловили возможность создания эффективного и быстрого метода определения ультрамалых количеств АТФ. Биолюминесцентная АТФ-метрия находит все более широкое применение в биохимии, медицине, биотехнологии и при мониторинге окружающей среды [2].
Для биоаналитического применения используются так называемые АТФ-реагенты, представляющие собой лиофилизированные многокомпонентные смеси, содержащие растворимую рекомбинантную люцифе-разу светляков, люциферин, компоненты буферного раствора, необходимые для протекания биолюминесцентной реакции, и стабилизирующие добавки [3]. Источником АТФ для данной системы является тестируемый образец. В последнее время в биотехнологии наблюдается тенденция к использованию реагентов в растворе. Это позволяет не только упростить процедуру проведения анализа, но и исключить из процесса получения АТФ-реагента дорогостоящую, энергоемкую и длительную стадию - лиофилизацию. Довольно высокое содержание гидрофобных амино-
кислотных остатков и преобладание ß-слоев во вторичной структуре люциферазы определяют ее низкую стабильность в водных растворах особенно при повышенных температурах [4]. Инактивация люциферазы происходит в основном за счет агрегации молекул фермента [5] и адсорбции на поверхности [6, 7]. Известно, что наиболее часто и успешно в качестве стабилизаторов ферментов в растворе используют олигосахариды [8], альбумин [7], неионные детергенты и полиолы [9].
Цель настоящей работы состояла в следующем: изучить возможность использования различных полиолов для увеличения длительности хранения АТФ-ре-агентов в растворе с максимальным сохранением ферментативной активности люциферазы и оптимизировать состав водорастворимой стабилизирующей композиции, содержащей полиолы.
Материалы и методы
Использованные вещества и растворы. Использовали D-люциферин ("Люмтек", Россия), аденозин-5 -трифосфат (АТФ), дитиотреитол (ДТТ), трис-(оксиме-тил)-аминометан, сульфат магния ("MP Biomedicals", США); динатриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), бычий сывороточный альбумин (БСА), полиэтиленгликоль (ПЭГ-8000) ("Sigma", США); Тритон Х-100 ("Merck", Германия); свежеперегнанные этиловый спирт, этиленгликоль, глицерин ("Химмед" Россия), деионизованную воду, полученную на установке "Milli-Q" ("Millipore", Франция).
Рекомбинантную люциферазу светляков Lucióla mingrelica выделяли из клеток Е. coli (штамм
LE392), несущих плазмиду pLR, очищали до гомогенного состояния по методу [10] и хранили при -70°С.
Получение АТФ-реагентое. Исходный концентрированный раствор люциферазы разбавляли до концентрации фермента 0,1 мг/мл 0,1 М Трис-ацетат-ным буферным раствором (рН 7,8), содержащим 20 мМ MgSO4, 2 мМ ЭДТА, 1 мМ LH2, 5 мМ ДТТ, 180 мг/мл сахарозы (контрольный АТФ-реагент) и различные полиолы - этиленгликоль, ПЭГ-8000, глицерин (2-20 об.%). Медленно перемешивали, не допуская образования пены, затем фильтровали через стерильный фильтр с диаметром пор 0,22 мкм. Полученные АТФ-реагенты выдерживали при комнатной температуре в течение 1 ч для выгорания фонового сигнала до 5-10 усл. ед. В каждой серии экспериментов использовали свежеприготовленные АТФ-реа-генты.
Измерение актиености люциферазы е растео-
ре. В кювету помещали 0,4 мл 0,05 М Трис-ацетатно-го буферного раствора (рН 7,8), содержащего 2 мМ ЭДТА, 10 мМ MgSO4, 0,3 мл 4 мМ раствора АТФ в том же буфере и 0,1 мл раствора люциферазы. Измеряли фоновое свечение, затем быстро с помощью инжектора вводили 0,3 мл 1 мМ раствора D-люцифе-рина в том же буфере и регистрировали на люмино-метре "Femtomaster FB 12" ("Zylux Corp.", Германия) максимальную интенсивность биолюминесценции, пропорциональную скорости ферментативной реакции. Активность люциферазы выражали в условных единицах (1 усл. ед./мл = 1 мВ = 109 квант/с).
Измерение сигнала биолюминесценции для АТФ-реагентое. Люминометрическую микрокювету объемом 0,3 мл при помощи пинцета помещали в кюветное отделение микролюминометра "3560"
("New Horizons Diagnostic Corp.", США) и вносили
—8
в нее по 50 мкл раствора АТФ-реагента и 10 М раствора АТФ в воде. Содержимое кюветы быстро и тщательно перемешивали, кюветное отделение закрывали и измеряли сигнал биолюминесценции. Измерения повторяли не менее двух раз.
Термоинактиеация АТФ-реагентое. Растворы АТФ-реагентов инкубировали при температуре 37, 20 и 4°С на термостате "Гном" (НПФ "ДНК-Технология", Россия). Через определенные промежутки времени отбирали аликвоты (100 мкл) раствора АТФ-реагента и измеряли сигнал биолюминесценции, как описано выше. Измерения сигнала биолюминесценции для АТФ-реагентов, инактивированных при 37°С, проводили после дополнительной инкубации отобранных аликвот на льду в течение 10 мин.
Результаты и их обсуждение
Влияние полиолое на активность АТФ-реаген-тое. Были получены образцы АТФ-реагентов, в состав которых наряду со стандартными компонентами буферной системы (люцифераза, Э-люциферин, сульфат магния и сахароза) входили такие полиолы, как этиленгликоль, глицерин и ПЭГ-8000. Концентрация активной люциферазы в составе изученных АТФ-реагентов составляла 0,1 мг/мл. Концентрацию полиолов варьировали от 2 до 20%. Биолюминесцентную реакцию инициировали добавлением к раствору АТФ-реа-гента 10 М раствора АТФ в воде. В присутствии полиолов активность АТФ-реагентов снижалась на 20-40% по сравнению с контрольным образцом (рис. 1). Известно [12], что активность люциферазы повышается в присутствии неионных мицелообразую-щих ПАВ за счет включения люциферазы и ее субстрата - люциферина - в мицеллы, что увеличивает эффективность их взаимодействия. Действительно, удельная активность АТФ-реагентов, содержащих в качестве дополнительного компонента 0,75 мМ Тритон Х-100, увеличивалась на 15-20 % независимо от типа используемого полиола (рис. 1). Кроме того, добавки полиолов на ~20% увеличили стабильность сигнала биолюминесценции (рис. 2), что повышает точность анализа.
Через 70 мин инкубации при 37°С самая высокая остаточная активность (более 70%) наблюдалась у АТФ-реагентов, содержащих полиолы в концентрации 10% (таблица), в то время как активность контрольного АТФ-реагента составляла всего 13%. При увеличении концентрации этиленгликоля и глицерина до 20% активность АТФ-реагентов уменьшалась в 2 раза, а 20% ПЭГ-8000 практически полностью инак-тивировал АТФ-реагент. По-видимому, при высоких концентрациях полиолов возрастает вязкость раствора, вследствие чего уменьшается доступность активного центра люциферазы для обоих субстратов. Наблюдаемое уменьшение скорости ферментативной реакции может происходить как за счет затруднения диффузии, так и за счет замедления конформационных переходов фермента, которые необходимы при образовании фермент-субстратного комплекса [13]. Таким образом, для изучения кинетики термоинактивации были выбраны АТФ-реагенты, содержащие 10% эти-ленгликоля, глицерина или ПЭГ-8000.
Кинетика термоинактиеации АТФ-реагентое при различных температурах. Кинетические кривые термоинактивации АТФ-реагентов при температу-
120
80
40
Рис. 1. Удельная активность АТФ-реагентов при 20°С в отсутствие (а) и в присутствии (б) Тритона Х-100: 1 - контрольный; 2, 3, 4 - АТФ-реагенты, содержащие этиленгликоль, глицерин
и ПЭГ-8000 соответственно
рах 37, 20 и 4°С представлены на рис. 3. Форма кинетических кривых не подчиняется первому порядку и изменяется в зависимости от температуры инкубирования. При 37°С на всех кинетических кривых наблюдаются две стадии инактивации - быстрая и медленная (рис. 3, а). В присутствии полиолов снижалась скорость инактивации на быстрой стадии, а скорость медленной стадии инактивации практически не изменялась. Наибольший стабилизирующий эф-
Рис. 2. Стабильность биолюминесцентного сигнала в процессе измерения для АТФ-реагентов различного состава: 1 -контрольный АТФ-реагент; 2, 3, 4 - АТФ-реагенты, содержащие этиленгликоль, глицерин и ПЭГ-8000 соответственно
фект проявился в присутствии этиленгликоля. Через 1 ч сохранялось 80% активности, тогда как для контрольного АТФ-реагента - всего 20%. При 20°С в течение 18 ч в присутствии ПЭГ и этиленгликоля сохранялось 90% активности по сравнению с 60% для контрольного АТФ-реагента (рис. 3, б). После индукционного периода инактивация ускорялась, тем не менее через 40 ч АТФ-реагенты, содержащие поли-олы, сохраняли 40-70% активности, а контрольный АТФ-реагент - только 25%. При 4°С период индукции со 100%-м сохранением активности АТФ-реагентов в присутствии полиолов увеличивался до 200 ч, тогда как для контрольного АТФ-реагента этот период был в 2 раза короче (рис. 3, в). Через неделю хранения исследуемые АТФ-реагенты сохраняли 40% активности, что в 5 раз превышает остаточную активность контрольного АТФ-реагента в аналогичных условиях.
Таким образом, проведенные исследования показали перспективность использования в качестве стабилизаторов рекомбинантной люциферазы светляков в растворе полиолов (этиленгликоля, глицерина и ПЭГ-8000), позволяющих повысить эффективность метода биолюминесцентной АТФ-метрии. Наиболее выгодным с экономической точки зрения является применение этиленгликоля.
Остаточная активность АТФ-реагентов после инкубирования при 37°С в
течение 70 мин
Концентрация полиола, % % от исходной активности
контроль этиленгликоль глицерин ПЭГ-8000
0 13 - - -
2 - 66 54 53
5 - 74 61 67
10 - 76 71 75
20 - 47 46 3
Рис. 3. Термоинактивация АТФ-реагентов, содержащих 10% полиолов при 37°С (а), 20°С (б) и 4°С (в): 1 - контрольный АТФ-реагент; 2, 3, 4 - АТФ-реагенты, содержащие этиленгликоль,
глицерин и ПЭГ-8000 соответственно
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Seliger H.H., McElroy W.D. // Arch. Biochem. Biophys. 1960.
88. P. 136.
2. Угарова H. H., Фрунджян В. Г. // Применение биолюми-
несценции АТФ-метрии в биоаналитических целях. М.. 2003.
3. Угарова H.H., Малошенок Л.Г., Мороз H.A., Ломакина Г.Ю. Пат. № 2268943. М., 27.01.2006.
4. Herbst R., Gast K., Seckler R. // Biochemisrty. 1998. 37.
P. 6586.
5. Shimomura O., Goto T., Johnson F.H. // Proc. Natl. Acad. Sci.
USA. 1977. 74. P. 2799.
6. Hlady V., Yeh P.-Y., Andrade J.D. // J. Fluorescence. 1991. 1.
P. 47.
7. Suelter C.H., DeLucaM. // Anal. Biochem. 1983. 135. P. 112.
8. Kaushik. J. K., BhatR. // J. Biol. Chem. 2003. 278. P. 26458.
9. Back J. F, Oakenfull D, Smith M.B. Biochemistry. 1979. 18.
N 23. P. 5191.
10. Lundovskikh I.A., Leontieva O.V., Dementieva E.I., Ugarova N.N. // Proc. of the 10th International Symposium on Bioluminescence and Chemiluminescence. "Bioluminescence and Chemiluminescence. Perspectives for the 21 Century". 1998. Chichester / Eds. A.K. Campbell, L.J. Kricka, P.I. Stanley / 1998. P. 420.
11. Бровко Л.Ю., Угарова Н.Н. // Биохимия. 1980. 45. № 5. С. 794.
12. Kricka L. G., DeLucaM. // Arch. Biochem. Biophys. 1982. 217. N 2. P. 674.
13. DeLuca M., Marsh M.// Arch. Biochem. Biophys. 1967. 121. N 1. P. 233.
Поступила в редакцию 23.11.07
STABILIZATION OF ATP-REAGENTS CONTAINING FIREFLY LUCIFERASE LUCIOLA MINGRELICA BY POLYOLS
N.A. Moroz, D.Ya. Gursky, N.N. Ugarova
(Division of Chemical Enzymology)
ATP-reagents containing 2-20 % of ethylene glycol, glycerol, or PEG-8000 were prepared. The 20-40 % decrease of the ATP-reagent's activity in the presence of polyols was demonstrated, it was prevented by adding of 0.75 mM Triton X-100. Concentration of polyols 10 % was found to be optimal. Kinetics of thermoinactivation of ATP-reagents in the presence of polyols at 37, 20 and 4eC was investigated. At all temperatures, the stability of ATP-reagents in the presence of polyols was increased 2-5 times in comparison with that of standard ATP-reagent. The solutions of the stabilized ATP-reagents may be stored at 4 eC for 180 h without loss of activity. The ATP-reagents activity half-life under these conditions was higher then two weeks.
