CC BY
32
УДК 577.152
СИНТЕЗ И ПРИМЕНЕНИЕ КОНЪЮГАТОВ ЛЮЦИФЕРАЗЫ СВЕТЛЯКОВ С АНТИТЕЛАМИ В БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНОМ
ИММУНОАНАЛИЗЕ КЛЕТОК Salmonella
112 1 Г.Ю. Ломакина , Е.Н. Истрате , Н.В. Руденко , Н.Н. Угарова
(кафедра химической энзимологии, 2Филиал Института биоорганической химии имени М.М. Шемякина иЮ.А. Овчинникова; е-mail: [email protected])
Разработан метод синтеза стабильных и высокоактивных конъюгатов люциферазы светляков с антителами с использованием гетеробифункционального сшивающего агента N-сукцинимидил 3-(2-пиридилдитио) пропионата (SPDP) в качестве линкера NHj-групп антител со свободными SH-группами термостабильной Luciola mingrelica люциферазы (Luc). Разработана новая специфическая матрица для сорбции клеток Salmonella: монодисперсные полистирольные микрочастицы (ф 240 нм) покрывали Плюроником F108-PDS, с которым затем ковалентно связывали моноклональные антитела к клеткам Salmonella (Sal). Конъюгаты Luc-Sal применяли как детектирующие агенты в биолюминесцентном иммуноанализе клеток Salmonella. Использование новой матрицы и высокоактивных конъюгатов Luc-Sal позволило повысить чувствительность метода в ~100 раз по сравнению со стандартным «сэндвич»-методом.
Ключевые слова: люцифераза светляков, Luciola mingrelica, моноклональное антитело, конъюгация, детекция клеток, Salmonella, биолюминесцентный иммуноферментный анализ, Плюроник F10S-PDS.
Одна из важных задач биотехнологии и биоаналитической химии - развитие новых эффективных методов детекции микроорганизмов. Существует много методов селективного определения микроорганизмов: микроскопические, микробиологические [1], моле-кулярно-генетические [2, 3], иммунохимические [4]. Наиболее широко используется гетерогенный имму-ноанализ, в частности «сэндвич»-тип анализа, при котором антитела или другие биоспецифические молекулы иммобилизованы на полистирольных микроплашках. Такой анализ занимает 1-3 ч и позволяет определять минимальную концентрацию клеток ~5*105 КОЕ/мл [1, 5]. Для определения более низких концентраций требуется предварительное культивирование клеток, что значительно увеличивает длительность анализа. Сравнение разных методов детекции (микробиологический, ПЦР и иммуноферментный) для 215 образцов пищевых продуктов показало, что хотя иммуноферментный метод менее чувствителен, чем ПЦР, однако он более удобный и быстрый [6]. Таким образом, весьма важной задачей является увеличение чувствительности иммуноанализа. Основной элемент в этом анализе - детекция специфических взаимодействий между антителом и определяемым антигеном. Системы детекции должны быть доступными, стабильными и высокочувствительными. Этим требованиям вполне отвечают методы детекции с использованием люциферазы светляков, которая катализирует
окисление Б-люциферина светляков кислородом воз-
2+
духа в присутствии АТР и Mg . Реакция сопровождается эмиссией видимого света (540-620 нм) с квантовым выходом, наиболее высоким среди всех известных биолюминесцентных систем [7]. Даже очень низкие концентрации люциферазы можно детектировать с использованием относительно простых приборов [8]. Преимуществом биолюминесцентных методов является возможность проводить измерения для суспензий и мутных сред. Предложено много методов, основанных на использовании люциферазы светляков как непрямой метки [9, 10]. Впервые такой метод предложили Ванлунд и др. [11] для иммуноферментного определения пикомольных количеств метотрексата. Авторы использовали конъюгаты люцифераза-метотрексат, которые содержали по два моля метотрексата на один моль люциферазы и проявляли активность, составляющую ~60% от активности исходной люциферазы. К сожалению, активные конъюгаты были получены только для низкомолекулярных антигенов. Попытки получить конъюгаты люциферазы с антителами до сих пор были неудачны, поскольку фермент обычно терял почти всю активность при конъюгации через его КИ2-группы [12]. Гомо - и бифункциональные сшивающие агенты быстро и необратимо ингибировали активность люци-
феразы. Субстраты люциферазы (Б-люциферин, АТР
2+
и Mg ) частично защищали фермент от ингибирова-ния, что было использовано при получении конъюга-
тов Photinuspyralis люциферазы с иммуноглобулином.
Тем не менее предварительная активация люциферазы
2+
с сульфо-SMCC в присутствии Mg и АТР приводила к потере 80% активности фермента, а полученный конъюгат сохранял только 13% от исходной активности люциферазы [13]. Было предложено [14] защищать фермент от инактивации путем обратимой химической модификации КН2-групп люциферазы, однако активность фермента также значительно снижалась. Предложено несколько подходов для преодоления этих трудностей. Получена биотинилированная люци-фераза как гибрид люцифераза-биотин, связывающий белок [15]. Биотинилированная люцифераза образует прочные комплексы с авидином или стрептавидином, предварительно конъюгированными с антителами [16,17]. Такие комплексы получены для рекомбинант-ной термостабильной люциферазы Luciola lateralis и использованы в биолюминесцентном «сэндвич»-иммуноанализе микроорганизмов [16-18]. Фукуда и др [16] могли детектировать присутствие в образце ~50 КОЕ/мл клеток Staphylococcus aureus уже через 7 ч, включая предварительное подращивание клеток. Авторы работы [17] разработали метод 24-часового биолюминесцентного иммуноанализа клеток Salmonella в смывах тушек цыплят, однако предел обнаружения оставался довольно высоким
этому требовалось развитие новых методов биолюминесцентной детекции для уменьшения длительности анализа и увеличения его чувствительности.
Возможность получения активных конъюгатов люциферазы с олигонуклеотидами с использованием SH-групп отстатков цистеина люциферазы Photinus pyralis была показана в [19]. Цель нашего исследования - разработка метода синтеза активных и стабильных конъюгатов люцифераза-антитело с использованием SH-групп фермента. В нашей лаборатории была выделена и изучена люцифераза (Luc) светляков Luciola mingrelica [20]. Этот фермент имеет 67% гомологии аминокислотной последовательности с Photinus pyralis люциферазой и более 80% с люциферазами из японских светляков L. cruciata и L. Lateralis [21]. 3Б-структура L. mingrelica люциферазы, полученная гомологичным моделированием [22] с использованием структур комплексов L. cruciata люциферазы с аналогами субстратов [23], показывает, что три консервативных Cys-остатка (82, 260 и 393) локализованы внутри белковой глобулы, и имеются еще пять неконсервативных Cys-остатков (62, 86, 146, 164, 284) [21]. Единичные мутации консервативных Cys-остатков на Ala [24] и неконсервативных Cys-остатков на Ser [25] не оказывают заметного влияния на активность фермента. Мы использовали для конъюгации термостабильную высокоактивную мутантную L. mingrelica лю-
циферазу с Hisg-таг на С-конце фермента, полученную методом направленной эволюции [25]. Этот фермент имел в 1,9 раза более высокую активность, более высокотемпературный оптимум активности по сравнению с WT-люциферазой и сохранял 70% активности после двух дней инкубации при 37°С. Использование высокоэффективной pET-системы экспрессии и одностадийная очистка данной мутантной люциферазы методом металло-хелатной хроматографии позволили нарабатывать высококонцентрированные растворы фермента [26]. Титрованием свободных SH-групп было показано, что термостабильный мутант содержал два доступных поверхностных Cys-остатка (62 и 164), т.е. на один остаток меньше, чем WT-люцифераза [27]. Эти остатки - наиболее вероятные точки для конъюгации, поскольку они локализованы на расстоянии 20 Â от активного центра, и их единичные замены на Ser не снижают активности и стабильности люциферазы [25, 27].
В работе были использованы два разных иммуноглобулина. При разработке метода синтеза конъюгатов Luc-антитела в качестве модельного антитела мы применили поликлональные антимышиные антитела кролика (RAM) и выяснили влияние конъюгации на лю-циферазную активность, стабильность и связывание с моноклональными антителами к клеткам Salmonella (Sal). Разработанный метод был применен для синтеза конъюгатов Luc-Sal, которые были использованы затем в биолюминесцентном иммуноанализе клеток Salmonella. Для сорбции клеток мы разработали новую матрицу на основе полистирольных микрочастиц, которые покрывали Плюроником F108, содержащим на концах молекулы пиридилдисульфидные группы, через которые ковалентно иммобилизовали антитела Sal. Конъюгаты Luc-Sal были использованы для детекции клеток, сорбированных на данной специфической матрице.
Материа и методы
Использованные вещества. Термоинактивиро-ванные клетки Salmonella paratyphi A и моноклональ-ные антитела к внешнему карбогидратному антигену (O-антиген) липополисахаридов Salmonella SA:5D12A (Sal) получены, как описано в работе [28]. Поликло-нальные антимышиные антитела кролика (RAM), бычий сывороточный альбумин (BSA), дитиотреитол (DTT), Na-ATP, дрожжевой экстракт (кат. № Y-0500), Тритон X-100 (все фирмы «Sigma Aldrich», США). Другие реагенты включали N-сукци-нимидил 3-(2-пи-ридилтио)пропионат (SPDP) («Pie-rce», США), бак-тотриптон («Becton Dickinson», США), Трис («ICN», США), Твин-20 («Ferak», Германия), D-люциферин («Люмтек», Россия). Все реагенты «х.ч.» Растворы готовили с использованием очищенной деионизирован-
ной воды на установке «WaterPro Plus» («LabConco», США). Хроматографию белков проводили, используя Sephadex G-25, на колонках PD SpinTrap G-25, а также на колонках объемом i и 5 мл Ni-IDA HisTrap HPFF («Amersham», Швеция). Полистирольные микрочастицы диаметром 240 нм («Bangs Laboratories», США) хранили в виде 10%-й суспензии в деионизированной воде. Плотность твердой фазы составляла 1,05 г/мл. i мл содержал 1,322* 1013 частиц. Площадь поверхности i г сухих микрочастиц составляла 2,381*1013 мкм2. Плю-роник F108 (молекулярный вес -14600) с введенными на концах молекул пиридилдисульфидными группами (Плюроник F108-PDS) был любезно предоставлен фирмой «Allvivo», США.
Оборудование. Интенсивность биолюминесценции измеряли на люминометрах «FB i2» («Zylux», США) или «ЛЮМ-1» («Люмтек», Россия), используя ячейки разделяемых полистирольных микропланшет (со средней адсорбционной способностью), и выражали в относительных световых единицах (RLU/с). Спектро-фотометрические измерения проводили на спектрофотометре «UV-1202» («Shimadzu», Япония). Величины рН измеряли на рН-метре GLP-21 («Crison», Испания) с точностью 0,01 единиц pH. Электрофорез белков выполняли на приборе «Mini-Protean II Cell» («BioRad», Австрия). Растворы в микропробирках перемешивали на мультиротаторе Bio RS-24 («BioSan», Латвия), центрифугировали на центрифугах «5415C» и «MiniSpin» («Eppendorf», Германия). Размер микрочастиц определяли на анализаторе частиц «Zetasizer Nano ZS» (<{Malvern Instruments», Великобритания).
Получение фермента. Термостабильная мутант-ная люцифераза (Luc) была получена, как описано ранее [26]. Экспрессию белка проводили по методу автоиндукции с лактозой [29] в клетках E. coli BL21(DE3), несущих плазмиду pETL7 с геном термостабильной люциферазы. Получаемый белок содержал Hisg-таг, поэтому его очищали методом аффинной хроматографии на Ni-сефарозе, получая раствор люциферазы с концентрацией 25-30 мг/мл в 20 мМ Na-фосфатном буфере (pH 7,5), содержащем 0,5 М NaCl и 0,3 М ими-дазола. В полученный раствор фермента добавляли раствор ЭДТА (pH 8,0) до концентрации 2 мМ.
Люциферазную активность люциферазы и ее конъюгатов с антителами определяли, используя субстратную смесь, которая включала 0,1 М Tрис-ацетат (рН 7,8) содержащий 60 мМ MgSO4, 2 мМ ЭДТА, 10% глицерин, 0,1 мМ Na4P2O7, 4 мМ АТР, 0,3 мМ люциферин. Для определения активности 50 мкл фермента или конъюгата и 50 мкл субстратной смеси вносили в ячейку, быстро перемешивали, измеряли интенсивность биолюминесценции в трех повторах и рассчитывали среднее значение. Ошибка измерения не превышала 5% от средней величины.
Концентрацию люциферазы определяли по поглощению при 280 нм, используя коэффициент экс-тинкции, равный A1 см = 0,75 для раствора люциферазы с концентрацией 1 мг/мл [30]. Молекулярный вес и чистоту белков определяли методом SDS-электрофореза в полиакриламидном геле по методу Леммли [31], используя 4%-й концентрирующий и 12%-й (для фермента) или 7%-й (для конъюгатов люциферазы) разделяющий гели.
Получение конъюгатов люциферазы с антителами. 5 мг RAM в 1 мл 20 мМ Na-фосфатного буферного раствора (pH 7,4), содержащего 0,15 М NaCl и 1 мМ ЭДТА (PBS-ЭДТА) смешивали с 25 мкл раствора SPDP (20 мМ в ДМСО) и инкубировали 1 ч при 22°C (схема 1). Затем смесь хроматографировали на колонке объемом 10 мл с сефадексом G-25, уравновешенным тем же буфером. Собирали фракции по 0,5 мл, содержащие больше 2,5 мг/мл белка. Концентрацию активированных RAM определяли по поглощению при 280 нм, используя A1 см = 1,4 для раствора RAM с концентрацией
1 мг/мл [32]. Для определения среднего числа остатков SPDP, связавшихся с RAM, порцию активированных RAM восстанавливали с помощью DTT и определяли концентрацию продукта реакции (пиридин-2-тиона) по поглощению при 343 нм, используя коэффициент экстинкции 8080 М-1см-1 [33]. Затем 10 мкл раствора люциферазы (6 мг/мл) в 20 мМ Na-фосфатном буфере (pH 7,5), содержащем 0,5 М NaCl, 0,3 М имидазол и
2 мМ ЭДТА добавляли к 50, 100 или 150 мкл раствора активированных RAM (3 мг/мл), чтобы получить реакционные смеси с разным молярным соотношением Luc/RAM (1:1, 1:2, 1:3). Растворы инкубировали от 1 до 15 ч при 4 или 22°C, отделяли конъюгаты Luc-RAM методом аффинной хроматографии на Ni-сефарозе (колонка 1 мл) при 4°C. Собирали фракции с люци-феразной активностью и хранили при 0°C до использования.
При синтезе конъюгатов Luc-Sal 0,9 мг Sal в 0,2 мл буфера PBS-ЭДТА смешивали с 7 мкл раствора SPDP (20 мМ в ДМСО), инкубировали 1 ч при 22°C, наносили на колонку PD SpinTrap G-25, уравновешенную тем же буфером, для отделения избытка реагентов. Очищенный раствор активированных Sal (4 мг/мл) элюи-ровали центрифугированием (3500 об/мин в течение 2 мин). Затем 10 мкл раствора люциферазы (6 мг/мл) в буфере, указанном выше, добавляли к 0,1 мл раствора активированных Sal, инкубировали 15 ч при 4°C. Конъюгаты Luc-Sal очищали хроматографией на Ni-сефарозе, как описано выше, и хранили при 0°C до использования.
Связывание Luc-RAM с моноклональными антителами, Sal. Сначала определяди оптимальную концентрацию Luc-RAM конъюгата для связывания с Sal. По 50 мкл раствора Sal (10 мкг/мл) в 10 мМ Na-
С х е м а 1
RAM SPDP
Luc-RAM пиридин-2-тион
Схема получения конъюгатов люцифераза-антитела
карбонатном буфере (pH 9,6) вносили в ячейки микропланшета, инкубировали при 40C в течение ночи, промывали 4 раза PBST-буфером (PBS-буфер, содержащий 0,05% Твин-20), блокировали 200 мкл буфера PBS-BSA (1% BSA в PBS буфере, 1 ч, 370Q и снова промывали. В каждую из подготовленных ячеек вносили по 50 мкл раствора Luc-RAM (0,5-25 мкг/мл) в буфере PBS, инкубировали 1 ч при 370C и снова промывали. Затем по 50 мкл субстратной смеси вводили в каждую ячейку и измеряли интенсивность биолюминесценции. Чтобы оценить способность конъюгата Luc-RAM связывать Sal, по 50 мкл раствора Sal (1,2580 мкг/мл) в 10 мМ Na-карбонатном буфере (pH 9,6) вводили в ячейки планшета, инкубировали при 40C в течение ночи и промывали, как описано выше. Затем по 50 мкл раствора Luc-RAM конъюгата (12,5 мкг/ мл) добавляли в каждую ячейку, инкубировали 1 ч при 370C, промывали, добавляли по 50 мкл субстратной смеси и измеряли интенсивность биолюминесценции.
Гетерогенный биолюминесцентный иммуноана-лиз клеток Salmonella с использованием PS-F108-PDS микрочастиц, ковалентно связанных с антителами Sal. 10 мг Плюроника F108-PDS растворяли в 0,8 мл деионизированной воды, добавляли 0,2 мл
суспензии, содержащей 10% полистирольных микро-12
частиц (PS) (2,6x10 частиц) и инкубировали при комнатной температуре в течение ночи. Модифицированные микрочастицы (PS-F108-PDS) отделяли от избытка ПАВ центрифугированием (13400 об/мин, 20 мин). Супернатант удаляли, а PS-F108-PDS ресус-пендировали в PBS-буфере. Эту процедуру повторяли три раза. Антитела Sal активировали с помощью SPDP, как описано выше. В Плюронике F108-PDS восстанав-
ливали S-S-связи, используя смесь 0,5 мл 0,15 M раствора DTTи 0,5 мл суспензии PS-F108-PDS (~1,3х1012 частиц) в буфере PBS, которую инкубировали 30 мин при 24°C с осторожным перемешиванием. Избыток DTT удаляли центрифугированием и промыванием. Затем к суспензии PS-F108-PDS немедленно прибавляли 0,5 мл раствора активированных Sal (4 мг/мл) в 20 мМ Na-фосфатном буфере (pH 7,4), содержащем 0,15 М NaCl и 1 мМ ЭДТА, инкубировали 2 ч при 24°C. Несвязавшиеся антитела удаляли центрифугированием (13400 об/мин, 20 мин), осадок ре суспендировали в буфере PBS. Процедуру повторяли три раза. Меченые микрочастицы (PS-F108-Sal) ресуспендировали в буфере PBS и хранили при 0°C.
Для определения размера микрочастиц 1 мл суспензии разбавляли деионизированной водой до концентрации ~10 частиц/мл и анализировали на анализаторе «Zetasizer Nano ZS». Для определения содержания клеток Salmonella 50 мкл суспензии тер-моинактивированных клеток (103-106 КОЕ/мл) в буфере PBS добавляли к 30 мкл суспензии PS-F108-Sal (~7х1010 частиц) в буфере PBS, инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре при перемешивании и промывали буфером PBS, как описано выше. Затем объем суспензии доводили до 100 мкл, добавляли 100 мкл раствора Luc-Sal конъюгата (10 мкг/мл) в буфере PBS, инкубировали 30 мин при комнатной температуре при перемешивании и промывали суспензию, как описано выше. После чего микрочастицы ресуспендировали в 50 мкл буфера PBS, переносили в кювету люминометра, добавляли 50 мкл субстратной смеси и измеряли интенсивность биолюминесценции.
Результаты и обсуждение
Синтез и свойства конъюгатов Luc-RAM. Возможность получения стабильных и активных конъюга-тов люциферазы светляков с антителами имеет важное значение для развития биолюминесцентного имму-ноанализа. Согласно литературным данным [12-14], конъюгирование люциферазы с антителами обычно приводит к сильному падению активности фермента. Ранее мы показали, что замена поверхностных SH-групп у Lucióla mingrelica люциферазы не уменьшает активности фермента [25, 27]. Именно поэтому мы использовали свободные SH-группы фермента для конъюгации с антителами. В качестве модельного антитела мы применяли поликлональные антимышиные антитела кролика (RAM), чтобы разработать метод синтеза конъюгатов Luc-антитела. Антитела RAM были модифицированы бифункциональным сшивающим агентом SPDP, в то время как люцифераза была использована в немодифицированной форме. Пиридилдисульфид-ные группы были введены в молекулы RAM по мето-
ду Карлсона и др. [33], несколько модифицированному нами. Одна молекула активированного RAM, как было показано, содержала в среднем по три пири-дилдисульфидные группы. Реакция активированных RAM с люциферазой протекала в 20 мМ Na-фосфате (pH 7,4), содержащем 0,15 М NaCl. Для измерения активности люциферазы и ее конъюгатов с антителами мы разработали субстратную смесь, использование которой позволило регистрировать высокий и постоянный сигнал биолюминесценции. Линейная зависимость интенсивности биолюминесценции от концентрации люциферазы наблюдалась в интервале от 1014 до 10-7 М люциферазы. Состав продуктов реакции был определен методом SDS-электрофореза в полиакриламидном геле.
Если реакцию конъюгации проводили при комнатной температуре, фермент терял 90% активности после 3 ч инкубации. Поэтому мы выполняли синтез при 4°C, а длительность инкубации увеличили до 15 ч. При выбранных условиях инкубации (15 ч, 4°C) активность и состав конъюгатов, как мы показали, сильно зависят от молярного соотношения Luc:RAM в реакционной смеси (таблица). При молярном соотношении 1:1 около 10% люциферазы остается в неизмененной форме. При соотношении Luc:RAM = 1:2 весь фермент включается в конъюгаты, а люциферазная активность составляет 80% от исходной. При соотношении Luc:RAM = 1:3 значительно возрастает содержание побочных олигомерных продуктов, а люцифераз-ная активность конъюгатов снижается до 61%. Таким образом, оптимальное соотношение Luc:RAM = 1:2. Согласно данным электрофореза, молекулярный вес конъюгата Luc-RAM составляет ~210 кДа, что соответствует конъюгатам состава 1:1. Можно предположить, что полученный продукт содержит смесь конъ-югатов Luc-RAM, в которых ковалентная связь образована через SH-группы остатка Cys62 или Cys164.
Поскольку молекула люциферазы содержит His6-таг, то конъюгаты легко отделяли от избытка антител с помощью металло-хелатной хроматографии. Известно [34], что Fc-фрагмент иммуноглобулинов может связываться с ионами металлов при металло-хелатной хроматографии. Мы проверили эту возможность для RAM и показали, что в использованных нами условиях антитела не связываются с носителем. Полученные растворы конъюгатов хранили при 0°C в 20 мМ Na-фосфате (pH 7,5), содержащем 0,5 М NaCl, 0,3 М имидазол и 2 мМ ЭДТА. После двух месяцев хранения конъюгаты имели 90% активности люциферазы. При инкубации в течение двух часов при 37°C уменьшение люциферазной активности конъюгатов не превышало 5%. Следовательно, конъюгаты Luc-RAM имеют высокую люциферазную активность и стабильность и мо-
гут быть использованы как при комнатной, так и при повышенной температуре. Разработанный нами метод получения конъюгатов люциферазы с антителами не требует предварительной модификации фермента в отличие от методов, описанных ранее [13, 14].
Мы оценили связывающую активность конъюгатов Luc-RAM по отношению к моноклональным антителам Sal. Сначала мы определили концентрацию конъюга-тов Luc-RAM, оптимальную для детекции Sal, которые были взяты в постоянной концентрации (10 мкг/мл) и сорбированы на поверхности ячеек микропланшет. Высокую интенсивность биолюминесценции (более 6х105 RLU/с) регистрировали при концентрации LucRAM выше 10 мкг/мл (рис. 1, а). Для дальнейших экспериментов была выбрана оптимальная концентрация Luc-RAM, равная 12,5 мкг/мл, при этом неспецифическое связывание конъюгатов Luc-RAM составляло всего 3-4%. Далее моноклональные антитела Sal в разной концентрации (1,25-80 мкг/мл) сорбировали на поверхность ячеек и детектировали их, используя постоянную концентрацию Luc-RAM (12,5 мкг/мл). Зависимость интенсивности биолюминесценции от концентрации иммобилизованных Sal описывается типичной кривой с насыщением (рис. 1, б). Максимальная интенсивность биолюминесценции составила 1,2 *106 RLU/с, что должно обеспечить достаточную чувствительность детекции. Следовательно, конъюгаты Luc-RAM обладали высокой связывающей способностью по отношению к моноклональным антителам Sal.
Синтез конъюгатов Luc-Sal и их использование в биолюминесцентном иммуноанализе клеток Salmonella. Конъюгация люциферазы с Sal-антителами была выполнена по методике, описанной выше для конъюгатов Luc-RAM. Полученные конъюгаты Luc-Sal демонстрировали 71±3% от исходной активности люциферазы. Согласно данным SDS- электрофореза, молекулярный вес конъюгатов Luc-Sal составил ~230 кДа, что соответствует конъюгату состава 1:1. Конъюгаты Luc-Sal имели более 90% люциферазной активности после двух месяцев хранения при 0°C. Их операционная стабильность при 37°С не отличалась от таковой для контьюгатов Luc-RAM. Конъюгаты Luc-Sal были использованы для биолюминесцентной детекции клеток Salmonella.
По данным литературы [18] предел обнаружения клеток Salmonella «сэндвич»-методом биолюминесцентного иммуноанализа составляет если не проводить предварительного подращивания клеток. Для улучшения аналитических характеристик биолюминесцентной детекции клеток мы использовали в качестве матрицы для специфической сорбции клеток монодисперсные полистирольные микрочастицы (PS) (ф 240 нм), рабочая поверхность которых
Синтез и характеристики конъюгатов Luc-RAM
Условия синтеза Характеристики продуктов реакции
температура, время, молярное относительная состав по данным SDS-электрофореза
°С ч соотношение, люциферазная доля доля олигомерных
Luc:RAM активность, % немодифицированной продуктов, %
люциферазы,%
22 1 1 1 95±3% ~90 -
3 1 1 10±2% 0 -
4 15 1 1 96±2% 10 -
1 2 79±3% 0 17±2
1 3 61±2% 0 38±2
была выше примерно в 100 раз, чем поверхность по-листирольных ячеек микропланшетов. Антитела Sal эффективно сорбировались на поверхности PS. При этом радиус микрочастиц увеличился на ~17±1 нм после инкубации в растворе антител Sal, что соответствует размеру молекул антител (10-20 нм) [35]. Следовательно, микрочастицы были покрыты монослоем антител. Однако при этом наблюдалась очень высо-
кая неспецифическая сорбция конъюгатов Luc-Sal на поверхности микрочастиц (результаты не показаны), так что их использование в анализе оказалось невозможным. Для снижения неспецифической сорбции за счет гидрофобных взаимодействий между молекулой люциферазы и полистирольной поверхностью использовали Плюроник F108-PDS, который представляет собой тройной блок-сополимер с двумя концевыми относительно гидрофильными полиоксиэтиленовы-ми блоками и гидрофобным полиоксипропиленовым блоком (схема 2). Преимущество данного Плюрони-ка заключается в том, что при его сорбции на микрочастицах центральный гидрофобный блок покрывает собой гидрофобную поверхность микрочастиц, на которой формируется щеткоподобная структура. При этом предотвращается неспецифическая сорбция белков, а также их денатурация и инактивация, что наблюдается при прямой собрции молекул белков на гидрофобной поверхности микрочастиц [36-38]. Боковые цепи Плюроника F108-PDS содержат пиридилди-сульфидные группы, к которым могут быть ковалентно присоединены тиол-содержащие молекулы. Более того, наличие длинных боковых цепей, включающих до 265 полиоксиэтиленовых единиц, сохраняло подвижность в пространстве для молекул, ковалентно связанных с концевыми группами Плюроника. Радиус микрочастиц, покрытых Плюроником F108-PDS (PS-F108-PDS), увеличился до 272±1 нм, что согласуется с результатами, полученными ранее [38]. Для иммобилизации антител Sal на поверхности PS-F108-PDS КН^группы антител
С х е м а 2
Рис. 1. Связывающая активность конъюгата люциферазы с поликлональными антимышиными антителами (Luc-RAM) по отношению к моноклональным антителам к клеткам Salmonella (Sal). Интенсивность биолюминесценции как функция: а - концентрации Luc-RAM при постоянной концентрации Sal (10 мкг/мл), сорбированных на поверхности полистирольных ячеек; б - концентрации Sal, сорбированных на поверхности полистирольных ячеек, при постоянной концентрации детектирующих Luc-RAM (12,5 мкг/мл).
Каждое измерение повторяли по три раза
Схематическое изображение Плюроника F108-PDS
активировали с помощью SPDP по методу, описанному выше, а пиридилдисульфидные группы на PS-F108-PDS восстанавливали до SH-групп. При взаимодействии восстановленных SH-групп на поверхности с активированными антителами Sal были получены микрочастицы с иммобилизованными на них антителами Sal (PS-F108-Sal). Диаметр частиц PS-F108-Sal возрос до 294±7 нм в соответствии с размерами конъюгированных молекул. Следует подчеркнуть, что после месяца хранения при 4°C размер частиц не изменился, а это свидетельствует о том, что десорбции Плюроника с поверхности микрочастиц не происходит.
Мы использовали микрочастицы PS-F108-Sal как «улавливающий» агент, а конъюгаты Luc-Sal как детектирующий агент в биолюминесцентном иммуноанали-зе клеток Salmonella. Зависимость интенсивности биолюминесценции от концентрации клеток Salmonella показана на рис. 2 (кривая 1). Предел обнаружения составил
2,7*10 КОЕ/мл, что в ~100 раз ниже предела обнаружения клеток Salmonella биолюминесцентным методом с использованием полистирольных микро-
КОЕ/мл
Рис. 2. Интенсивность биолюминесценции как функция концентрации клеток Salmonella (1) и E. coli (2). Клетки сорбировали на полистирольных частицах, обработанных Плюроником F108-PDS, к которому затем ковалент-но были присоединены антитела Sal. Связавшиеся клетки детектировали, используя конъюгаты Luc-Sal. Каждое измерение повторяли по три раза
Работа выполнена при финансовой поддержке
планшет [18]. Существенное снижение предела обнаружения объясняется не только увеличением площади поверхности для связывания клеток. Антитела Sal связаны с полистирольной поверхностью через длинный спейсер, который позволяет им сохранять подвижность в пространстве и делает антитела более доступными для взаимодействия с микробными клетками. На это указывает и тот факт, что быстрое и эффективное связывание клеток Salmonella с микрочастицами PS-F108-Sal наблюдается после 1 ч инкубации при комнатной температуре, в то время как при использовании микропланшет для подобного связывания необходима инкубация при 37°C. Кроме того, подвижные полиок-сиэтиленовые цепи Плюроника закрывают гидрофобную поверхность микрочастиц и предотвращают взаимодействие с ней белков. Именно этим объясняется очень низкая неспецифическая сорбция конъюгатов Luc-Sal на PS-F108-Sal (менее 0,5%). Важно подчеркнуть, что интенсивность биолюминесценции линейно зависит от концентрации клеток в широком интервале (от 103 до 106 КОЕ/мл). Для проверки специфичности метода мы использовали клетки E. coli (штамм K12). Клетки Salmonella и E. coli имеют сходную структуру клеточной стенки. Однако при использовании клеток E. coli в данной системе биолюминесцентный сигнал близок к фоновому значению во всем интервале концентрации клеток (рис. 2, кривая 2). Это подтверждает высокую специфичность использованных монокло-нальных антител Sal.
Таким образом, мы разработали простой и эффективный метод получения конъюгатов люциферазы светляков с антителами с использованием поверхностных SН-групп фермента, который впервые позволил получить стабильные конъюгаты, сохраняющие высокую люциферазую активность (70-90%) и высокую способность к связыванию антигена (микробных клеток). Для специфической сорбции детектируемых клеток Salmonella была синтезирована новая матрица на основе полистирольных микрочастиц. Поверхность микрочастиц была обработана Плюроником F108-PDS, с которым затем были ковалентно связаны антитела к клеткам Salmonella. Использование данной матрицы позволило снизить предел обнаружения клеток в ~100 раз без предварительного концентрирования или подращивания образца. ФИ (проекты № 08-04-00624 и № 11-04-00698).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Mandal P.K., BiswasA.K., Choi K., Pal U.K. // Amer. J. Food Technol. 2011. 6. P. 87.
2. Ferretti R., Mannazzu I., Cocolin L., Comi G., Clementi F. // Appl. Environ. Microbiol. 2001. 67. P. 977.
3. Sibley C.D., Peirano G., Church D.L. // Infect. Gen. Evol. 2012.12. P. 505.
4. Uyttendaele M., Vanwildemeersch K., Debevere J. // Lett. Appl. Microbiol. 2003. 37. P. 386.
5. Jasson V., JacxsensL., LuningP., Rajkovic A., UyttendaeleM. // Food Microbiol. 2010. 27. P. 710.
6. Kumar R., Surendran P.K., Thampuran N. // Lett. Appl .Microbiol. 2008.46. P. 221.
7. Fraga H. // Photochem. Photobiol. Sc. 2008.7. P. 146.
8. Lundin A. // Methods Enzymol. 2000. 305. P. 346.
9. Murakami S., Nakjima M., Ito S., Kamada S., MaedaM., Tsuji A. // In Bioluminescence and Chemiluminescence: Status report/ Eds. A.A. Szalay, L.J. Kricka, P.E. Stanley. Chichester, 1993. P. 296.
10. FromellK., Hulting G., Ilichev A., Larsson A., Caldwell K. // Anal. Chem. 2007. 79. P. 8601.
11. Wannlund J., Azari J., Levine L., DeLuca M. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1980. 96. P. 440.
12. Kricka L.J. // Clin. Chem. 1991. 37. P. 1472.
13. MurphyM.J., SquirrellD.J. //In Bioluminescence and Chemiluminescence: Fundamental and applied aspects/ Eds. A.K. Campbell, L.J. Kricka, P.E. Stanley. Chichester, 1994. P. 301.
14. Alagic A., Zhelev P., Gawad Y.A. // US Patent application 2010.0003701 A.
15. Tatsumi H., Fukuda S., Kikuchi M., Koyama Y. // Anal. Biochem. 1996. 243. P. 176.
16. Fukuda S., Tatsumi H., Igarashi H., Igimi S. // Lett. Appl. Microbiol. 2000.31.P. 134.
17. Valdivieso-Garcia A., Desruisseau A., Riche E., Fukuda S., Tatsumi H. // J. Food Prot. 2003. 66. P. 1996.
18. Fukuda S., Tatsumi H., Igimi S., Yamamoto S. //Lett. Appl. Microbiol. 2005. 41. P. 379.
19. Nagatsugi F., Nakahara R., Inoue K., Sasaki S. // Archiv. Pharmazie. 2008. 341. P. 562.
20. Ugarova N.N. // J. Biolum. Chemilum. 1989. 4. P. 406.
21. Devine J.H., Kutuzova G.D., Green V.A., Ugarova N.N., Baldwin T.O. // Biochim. Biophys. Acta. 1993. 1173. P. 121.
22. Кокшаров М.И., Угарова Н.Н. // Биохимия. 2008. 73. C. 1071.
23. Nakatsu T., Ichiyama S., Hiratake J., Saldanha A., Kobashi N., Sakata K., Kato H. // Nature. 2006. 440. P. 372.
24. Дементьева Е.И., Железнова Е. Е., Кутузова Г.Д., Лундовских И.А., Угарова Н.Н. // Биохимия. 1996. 62. С. 152.
25. Модестова Ю.А., Ломакина Г.Ю., Угарова Н.Н. // Биохимия. 2011. 76. С. 1407.
26. Koksharov M.I., Ugarova N.N. // Protein Eng. Des. Sel. 2011. 24. P. 835.
27. Ломакина Г. Ю., Модестова Ю.А., Угарова Н.Н. // Вестн. МГУ. Сер. 2. Химия. 2008. 49. С. 81.
28. Merkulova T.I., Abbasova S.G., Moshnikova A.B. // Hybridoma. 1995. 14. P. 557.
29. Studier F.W. // Protein Expres. Purif. 2000. 41. P. 207.
30. Green A.A., McElroy W.D. // Biochim. Biophys. Acta. 1956. 20. P. 170.
31. Laemmli U.K. // Nature. 1970. 227. 680.
32. Hay F.C., Westwood O.M.R. // Practical Immunology. 4rth ed., Blackwell Science. 2002.
33. Carlsson J., Drevin H., Axen R. // Biochem. J. 1978. 173. P. 723.
34. Sorensen K., Roscoe I. //US Patent 5,266,686. 1993.
35. Hermanson G.T. //In Bioconjugate Techniques/ Ed. G.T. Her-manson. 2nd ed. N.Y., 2008. P. 961.
36. FromellK., AndersonM., Elihn K., CaldwellK.D. // Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 2005. 46. P. 84.
37. Basinska T., Caldwell K.D. // In Chromatography of Polymers. Ed. T. Provder. American Chemical Society. 1999. P. 162.
38. Fry A.K., Schilke K.F., McGuire J., BirdK.E.. // J. Biomed. Mater. Research. Part B: Appl. Biomater. 2010. 94B. P. 187.
Поступила в редакцию 11.11.13
SYNTHESIS AND ASSESSMENT OF FIREFLY LUCIFERASE-ANTIBODY CONJUGATES FOR BIOLUMINESCENT ENZYME IMMUNOASSAY OF SALMONELLA CELLS
G.Yu. Lomakina, E.N. Istrate, N.V. Rudenko, N.N. Ugarova*
(Department of Chemical Enzymology, Faculty of Chemistry, Lomonosov Moscow State University, Moscow, 119991, Russia; Branch of Shemyakin and Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences, 142290, Pushchino, Moscow Region, Russia)
A method was developed for synthesis of stable and highly active firefly luciferase-antibody conjugates using heterobifunctional agent - N-succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) propionate (SPDP) - as a linker between NH2-groups of antibodies and free SH-groups of a thermostable Luciola mingrelica firefly luciferase (Luc). A new specific matrix to capture Salmonella cells was developed: monodisperse polystyrene microparticles were coated with Pluronic F108-PDS which was then covalently labeled with monoclonal anti-Salmonella antibodies (Sal). Luc-Sal conjugates were used as detection agents in bioluminescent immunoassay of Salmonella cells. The use of this matrix and highly active Luc-Sal conjugates permitted to extend the method sensitivity by ~100 times as compared to the standard «sandwich»-type immunoassay of Salmonella.
Key words: firefly luciferase; Luciola mingrelica; monoclonal antibody to Salmonella; conjugation; bioluminescent enzyme immunoassay for Salmonella; polystyrene microparticles; Pluronic F108-PDS.
Сведения об авторах: Ломакина Галина Юрьевна - ст. науч. сотр. кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ, канд. хим. наук ([email protected]); Истрате Елена Николаевна - выпускница кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ ([email protected]); Руденко Наталья Васильевна - ст. науч. сотр. Филиала Института биоорганической химии имени М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, канд. биол. наук ([email protected]); Угарова Наталья Николаевна - глав. науч. сотр. кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ, докт. хим. наук ([email protected]).
