CC BY
25
УДК 577.152.
ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК: ЛЮЦИФЕРАЗА
Lucióla Mingrelica-БИОТИН-СШЗЫ1ВАЮЩИЙ ДОМЕН.
ПОЛУЧЕНИЕ, СВОЙСТВА, ПРИМЕНЕНИЕ
М.И. Кокшаров, Д.В. Смирнова, С.Г. Аббасова, Н.Н. Угарова
(кафедра химической энзимологии, e-mail: [email protected])
Методами генетической инженерии сконструирована плазмида, кодирующая ген гибридного белка, который включает ген термостабильного мутанта люциферазы светляков Lucióla mingrelica (4TS) и ген, кодирующий 87 С-концевых аминокислотных остатков биотин-свя-зывающего домена E. coli (bccp87). Установлено, что при наработке гибридного белка (4TS-bccp) в клетках E. coli BL21(DE3) 60% целевого белка образуется в биотинилированной форме. Показано, что каталитические свойства, термостабильность и спектры биолюминесценции гибридного белка близки к свойствам исходной люциферазы. Показана возможность использования комплекса гибридного белка со стрептавидином в иммуноферментном анализе для определения содержания клеток Salmonella typhimurium в интервале от 104 до 5106 КОЕ/мл.
Ключевые слова: люцифераза светляков, Lucióla mingrelica, гибридный белок, биотин-связывающий домен, клетки Salmonella typhimurium, стрептавидин, биотин, моноклоналъные антитела.
Люцифераза светляков (КФ 1.13.12.7), катализирующая биолюминесцентную реакцию окисления люци-
ферина кислородом воздуха в присутствии АТФ и
2+
ионов Mg [1-3] с высоким квантовым выходом [4— 5], находит широкое применение как ген-маркер [6—7], а также в АТФ-метрии и "быстрой микробиологии" [8—9]. Идея использования люциферазы в качестве ферментной метки в иммуноферментном анализе (ИФА) привлекательна, однако в течение долгого времени сталкивалась с затруднениями из-за низкой термостабильности и инактивации фермента при попытке его химической модификации. С развитием методов генной инженерии были получены термостабильные мутантные формы люциферазы [10-11]. Широкое распространение получили гибридные белки, в которых к молекуле люциферазы методами генетического конструирования присоединен белковый фрагмент, способный связываться с различными мишенями [1216]. В настоящее время весьма популярными в ИФА являются методы с использованием высокоаффинных биотин-стрептавидиновых взаимодействий. Биотинили-рование люциферазы стало возможным при гибридизации фермента с биотинсвязывающими доменами. Биотинсвязывающие домены содержатся в таких белках, как ацетилкокарбоксилаза и пируваткарбокси-лаза, имеющих в активном центре остаток лизина, способный образовывать амидную связь с биотином при помощи биотин-лигазы [17]. Таким образом, био-
тинилирование белков, коньюгированных с биотинсвя-зывающими доменами, происходит непосредственно при синтезе гибридных белков in vivo. В литературе подобные белки описаны для люцифераз светляков Photinus pyralis [13-14] и Luciola lateralis [15-16]. Для люциферазы светляков Luciola mingrelica таких конструкций не описано.
В нашей лаборатории получен и охарактеризован высокоактивный термостабильный мутант люцифера-зы Luciola mingrelica (4TS) [18]. Активность мутанта 4TS по сравнению с ферментом дикого типа составляет 190%, после двух дней инкубации при 37°С уменьшается всего на 20% [18]. Таким образом, данный мутант люциферазы Luciola mingrelica соответствует требованиям, которые предъявляются к ферментам-меткам в ИФА.
Цель данной работы - получение и изучение свойств гибридного белка термостабильной мутант-ной люциферазы Luciola mingrelica с биотинсвязыва-ющим доменом (4TS-bccp), а также выяснение возможности его применения для определения содержания клеток Salmonella typhimurium с использованием ИФА.
Материалы и методы
Использованные вещества и растворы. В работе использовали аденозин-5'-трифосфат (АТФ), дити-отреитол (ДТТ), бычий сывороточный альбумин
(БСА) ("Sigma", США), D-люциферин (LH2) ("Люм-тек", Россия), олигонуклеотиды ("Синтол", Россия). Для проведения реакции мутагенеза и клонирования требуемых фрагментов ДНК использовали ферменты: TaqSE ДНК-полимеразу фага ("СибЭнзим", Россия), Taq ДНК-полимеразу, T4 ДНК-лигазу ("Силекс", Россия) и ряд рестриктаз фирм "Сибэнзим" (Россия), "Fermentas " (Литва) и "Boehringer Mannheim " (Германия). Для выделения плазмид из клеток E. coli и элюции фрагментов ДНК из агарозного геля использовали наборы фирмы "Qiagen" (Германия). Для определения степени биотинилирования использовали магнитные частицы Streptavidin C1("Invitrogen", США). Для проведения иммуноферментного анализа использовали клетки Salmonella typhimurium CRIFS № C1058, моноклональные антитела SB:1B10B к сальмонелле серогруппы В, полученные по методу [19], и их биотинилированные производные, стрептавидин ("Sigma", США).
Конструирование плазмиды, кодирующей гибридный белок. Для получения плазмиды, кодирующей гибридный белок, были использованы следующие фрагменты ДНК: ген термостабильного мутанта лю-циферазы 4TS, выделенный из плазмиды pETL7 [18] при помощи рестрикции по сайтам PstI, ApaI; фрагмент ДНК, кодирующий 87 С-концевых аминоксилот-ных остатков биотинсвязывающего белка (bccp) [17], выделенный из генома клеток E. coli, в который были введены сайты рестрикции Sali и ApaI при помощи ПЦР Для проведения ПЦР были использованы следующие праймеры:
прямой праймер bccp:
5'-TCGGGCCCATTGGAAGCGCCAGCAGC -3' (26 bp),
обратный праймер bccp:
5'-GTGGTCGACACCCTCGATGACGACCAGCGG-3' (30 bp).
После очистки оба фрагмента лигировали в вектор pET23b ("Novagen", США), разрезанный по сайтам PstI и XhoI, позволяющий проводить экспрессию целевого белка с помощью высокоэффективной системы pET [20] и добавляющий на C-конце фермента дополнительную шестигистидиновую последовательность для последующей очистки гибридного белка методом металло-хелатной хроматографии. Липкие концы сайтов SalI и XhoI совместимы, и после лиги-рования оба сайта исчезают. Полученная в результате лигирования плазмида была трансформирована в клетки E. coli XL 1-Blue, наработана и выделена в необходимом для дальнейших исследований количе-
стве. Фермент экспрессировали в клетках E. coli BL21(DE3) CodonPlus, выделяли и очищали по методике, описанной в работе [20]. Концентрацию люциферазы определяли по оптической плотности раствора при 280 нм (0,51 ед. опт. пл. соответствует раствору, содержащему 1 мг/мл люциферазы).
Константы Михаэлиса определяли на люмино-метре FB 12 ("Zylux", США) [20] по величине максимальной интенсивности биолюминесценции при насыщающей концентрации одного из субстратов (1 мМ АТФ или 0,3 мМ LH2), варьируя концентрацию другого субстрата в пределах, соответствующих 0,4-7 величин Km. Расчет Km проводили с помощью программы Origin 7.5 по методу нелинейной регрессии с использованием уравнения Михаэлиса-Ментен.
Активность люциферазы в составе гибридного белка и комплекса гибридный белок-стрепта-видин измеряли, используя субстратную смесь АТФ-LH следующего состава: фосфатный буферный раствор (рН 7,8, 0,05 М КН2Р04; 0,05 М К2НР04); содержащий 2 мМ АТФ; 0,3 мМ LH2;15 мМ MgSO4; 4 мМ ЭДТА; 2% Неонол-10; 0,1 мМ Na4P2O7. При проведении измерений в люминометри-ческую микрокювету вносили 100 мкл раствора белка, добавляли 100 мкл субстратной смеси АТФ_ЬН2, быстро перемешивали и измеряли интенсивность биолюминесценции на люминометре "ЛЮМ-1" ("Люм-тек", Россия). Аналогичным способом получали зависимости интенсивности биолюминесценции от концентрации соответствующего белка в широком интервале его концентраций.
Изучение необратимой термоинактивации люциферазы. Готовили раствор фермента (0,01 мг/мл, 1,7x10 М) в охлажденном до 4°С буферном растворе TB1 (pH 7,8; 50 мМ трис-ацетат, 20 мМ MgSO4; 2 мМ ЭДТА; 0,2 мг/мл БСА), разливали по 50 мкл раствора фермента в 7-8 тонкостенных микропробирок (0,5 мл) и инкубировали в водяном термостате. Через определенные промежутки времени отбирали пробы (по 50 мкл), инкубировали в снегу не менее 15 мин и определяли активность фермента.
Спектры биолюминесценции регистрировали на люминесцентном спектрометре "LS 50B" ("Perkin-Elmer", США) в режиме "биолюминесценция" при ширине щели 10 нм в соответствии с условиями, описанными в [20].
Степень биотинилирования гибридного белка люциферазы определяли с использованием сорокакратного по отношению к концентрации гибридного белка избытка магнитных частиц, модифицированных
стрептавидином в буфере PBS (pH 7,6; 0,01 М Na-фосфат; 0,15 М NaCl). В пробирку типа эппендорф с частицами (0,1 мг) помещали раствор люциферазы (100 мкл), предварительно разбавленный в 105 раз в буфере PBS, содержащем БСА (0,1мг/мл), доводили до концентрации 6х10—5 мг/мл (или 10-9 М) и инкубировали в течение 40 мин при интенсивном перемешивании на орбитальном шейкере "Multi Bio RS-24" ("Biosan", Латвия). Затем измеряли активность лю-циферазы в контрольном образце (без частиц) и в супернатанте после отделения магнитных частиц магнитом. Для определения неспецифического связывания гибридного белка полученный осадок магнитных частиц дважды промывали 100 мкл буфера PBS, затем добавляли 100 мкл того же буфера и инкубировали 40 мин при комнатной температуре и интенсивном перемешивании. Затем собирали частицы магнитом. В супернатанте измеряли активность люцифера-зы с использованием субстратной смеси АТФ—ЬН2, как описано выше. Параллельно проводили аналогичный эксперимент с использованием исходной (небио-тинилированной) люциферазы.
Влияние стрептавидина и антител на активность гибридного белка изучали, получая зависимости интенсивности биолюминесценции от концентрации раствора гибридного белка или раствора, содержащего комплекс гибридный белок-стрептавидин (при соотношении компонентов 1:1) с использованием субстратной смеси АТФ-ЬН2, описанной выше. Эти же зависимости использовали для определения предела обнаружения люциферазы. Для изучения влияния антител на активность комплекса гибридный
белок-стрептавидин готовили растворы антител с
—10 —7
концентрацией от 10 до 10 М в буфере PBS. По 50 мкл раствора антител помещали в микрокюветы, добавляли по 50 мкл 10 М раствора комплекса гибридный белок-стрептавидин и инкубировали в течение 1 ч при 37°С и перемешивании в тер-мостатируемой качалке "ES-20" ("Biosan", Латвия), 250 об/мин. Затем в микрокюветы добавляли по 100 мкл субстратной смеси АТФ-ЬН2 и измеряли активность фермента на люминометре ЛЮМ-1.
Получение комплекса гибридный белок-стреп-
тавидин. Готовили растворы стрептавидина с концен-
—8 —8 —8 трацией 4х10 , 2х10 , 1х10 М и раствор гибридно-
—8
го белка с концентрацией 2-10 М в 1%-м буфере PBSТ-БСА (pH 7,6; 0,01 М Na-фосфат; 0,15 М NaCl; 0,1% Tween-20; 1% БСА). Смешивали равные объемы растворов белка и стрептавидина и инкубировали от 30 до 140 мин (37°С, 250 об/мин), разбавляли в необ-
ходнмое количество раз и использовали в дальнейших экспериментах.
Взаимодействие комплекса гибридный белок-стрептавидин с иммобилизованными антителами. Для иммобилизации антител в лунки полистироль-ного 96-луночного планшета вносили по 100 мкл на лунку раствора биотинилированных антител (5 мкг/мл в 50 мМ бикарбонатном буфере, pH 9,6 ), инкубировали 2 ч (37°С, 250 об/мин), затем 4 раза лунки промывали порциями по 200 мкл буфера PBST (pH 7,6; 0,01 М Na-фосфат; 0,15 М NaCl; 0,1% Твин-20). Для блокирования центров неспецифического связывания на поверхности в лунки вносили по 200 мкл 1%-го раствора БСА, инкубировали в течение 2 ч при 37°С, затем промывали 3 раза по 200 мкл PBST. В подготовленные таким образом лунки планшета с иммобилизованными биотинилированными антителами вносили по 100 мкл раствора комплекса гибридный белок-стрептавидин, инкубировали 1 ч (37°С, 250 об/мин) и не связавшийся с антителами комплекс удаляли пятикратным промыванием планшета 200 мкл раствора PBST. После удаления остатков буфера PBST в ячейки вносили по 50 мкл буфера PBS и по 50 мкл субстратной смеси АТФ-LH^ перемешивали и измеряли биолюминесцентный сигнал.
Получение биомассы инактивированных клеток сальмонелл. Клетки Salmonella typhimurium рассевали на чашку Петри с агаризованной средой LB с помощью стерильной петли и инкубировали при 37°С в течение ночи в термостате. Далее инокулиро-вали двумя индивидуальными колониями в два матраца на 200 мл, содержащих по 60 мл питательной среды LB, и инкубировали в течение ночи (~14 ч) на термостатируемой качалке (37°С, 160-180 об/мин). Для определения количества выросших микроорганизмов отбирали 50 мкл обогащенной среды и производили последовательные разбавления в 10 , 10 , 10 , 10 раз. Аликвоты (100 мкл) образцов с разбавлением в 106, 107 раз высевали на питательную агаризо-ванную среду LB, инкубировали в течение ночи при 37°С и затем проводили подсчет выросших колоний. Содержимое матрацев переносили в стаканы для центрифугирования (250 мл) и центрифугировали (20 мин, 6000 об/мин, 4°С). Осадок ресуспендировали в 30 мл буфера PBS и переносили в пробирку на 50 мл. Для инактивации клеток пробирку с биомассой нагревали на водяной бане (1 ч, 100°С). Для проверки полноты инактивации клеток сальмонелл 200 мкл суспензии клеток наносили на чашку Петри с питательной средой LB, инкубировали в течение
ночи, после чего определяли количество выросших колоний. Полученный препарат клеток хранили при -20°С.
Гетерогенный сэндвич-анализ для количественного определения содержания клеток Salmonella typhimurium. Небиотинилированные мо-ноклональные антитела иммобилизовали на поверхности лунок полистирольного планшета, как описано выше для биотинилированных антител. Готовили серию последовательных разведений буфером PBS исходной суспензии клеток (10 КОЕ/мл в PBS) с концентрациями клеток от 107 до 103 КОЕ/мл. По 100 мкл полученных растворов вносили в лунки планшета и инкубировали в течение 2 ч (37° С, 250 об/мин). Планшеты с иммобилизованными клетками три раза промывали 200 мкл PBST. Затем в лунки с иммобилизованными клетками вносили по 100 мкл раствора биотинилированных антител (5 мкг/мл в PBST), инкубировали 1,5 ч при 37°С, 250 об/мин и не связавшиеся антитела удаляли промыванием (4 раза, по 200 мкл буфера PBST). После удаления остатков буфера в лунки планшета вносили по 100 мкл раствора комплекса
гибридный белок-стрептавидин с концентрацией
_8
10 М и инкубировали 1 ч (37°С, 250 об/мин). Не связавшийся комплекс удаляли пятикратным промыванием планшета 200 мкл PBST. После удаления остатков буфера в лунки вносили по 50 мкл буфера PBS и 50 мкл субстратной смеси АТФ-ЬИ2 и измеряли интенсивность биолюминесценции на люминометре ЛЮМ-1.
Результаты и обсуждение
Получение гибридного белка люцифераза-био-тинсвязывающий домен. Схематическая структура сконструированной нами плазмиды pETL7-bccp, кодирующей гибридный белок (люцифераза-биотинсвязы-вающий домен), показана на рис. 1.
Плазмида содержит ген термостабильного мутанта 4TS люциферазы светляков L. mingrelica, ген, кодирующий 87 С-концевых аминокислотных остатков био-тинсвязывающего домена (bccp87) E. coli, которые достаточны для биотинилирования гибридного белка in vivo, и полигистидиновую последовательность, позволяющую проводить очистку белка с использованием метода металло-хелатной хроматографии. При конструировании гибридного белка стартовый кодон метионина в начале гена bccp87 был изменен на лейцин, чтобы удалить возможную рамку считывания.
Т7 promoter
Рис. 1. Схематический рисунок плазмиды, кодирующей ген гибридного белка люцифераза-биотинсвязывающий домен
Этот остаток находится в неконсервативной подвижной петле до начала структурированной части Ьсср87, поэтому его замена не оказывает существенного влияния на свойства белка [21]. Следует отметить, что в полученной конструкции последовательность 80РЬЕЛРЛЛЛЕ180 выполняет роль подвижного линкера между структурированными частями люцифера-зы и белка Ьсср87.
Для определения степени биотинилирования гибридного белка использовали избыток магнитных частиц, модифицированных стрептавидином. При этом с частицами связалось около 60% гибридного белка, а неспецифическая сорбция составила не более 1%. Исходная люцифераза, не содержащая Ьсср-домена, как мы показали, не связывается с магнитными частицами. В итоге, если предположить, что гибридный белок удерживается магнитными частицами за счет биотин-стрептавидиновых взаимодействий, то биоти-нилирование гибридного белка составляет 60±5%. В данном случае наблюдается неполное биотинилирова-ние, поскольку выращивание клеток велось без добавления экзогенного биотина.
Влияние биотинсвязывающего домена на свойства гибридного белка. Для гибридного белка был снят спектр биолюминесценции, измерены константы Михаэлиса по каждому из субстратов, была изучена кинетика термоинактивации при 47°С. Сравнение полученных результатов с данными для мутанта 4Т8 (таблица) показывает, что биотинсвязывающий домен не оказывает влияния на структуру и окружение ак-
Физико-химические свойства мутанта 4TS люциферазы светляков Lucióla mingrelica и гибридного белка: люцифераза (4Т8)-биотинсвязывающий белок
(bccp)
Фермент Km, мкМ Максимум спектра биолюминесценции, нм Время полуинактивации при 47°, мин
lh2 АТФ pH 7.8
4TS 60 ± 5 41 ± 8 573 15 ± 2
4TS-bccp 66 ± 6 41 ± 7 569 15 ± 2
тивного центра, а также на константы Михаэлиса и термостабильность люциферазы.
Использование гибридного белка в качестве метки в ИФА для детекции клеток Salmonella typhimurium. В работе мы использовали схему ИФА, показанную на рис. 2. Как следует из рис. 2, интенсивность биолюминесценции измеряется для сложного комплекса, фиксированного на поверхности лунок планшета. Важно было выяснить, какое влияние оказывают компоненты детектируемого комплекса на активность люциферазы. Для изучения влияния стреп-тавидина на биолюминесцентную активность гибридного белка были получены зависимости интенсивности биолюминесценции от концентрации гибридного белка в интервале от 0,1 до 10 пМ в отсутствие (рис. 3, 1) и в присутствии стрептавидина (рис. 3, 2) при соотношении компонентов 1:1. Эти зависимости
являются линейными, практически совпадают и описываются уравнениями:
А = (25±18) + (515±9) с, А = (30±26) + (521±13) с,
где А - интенсивность биолюминесценции (усл.ед.), с - концентрация белка (пМ).
Из этих уравнений следует, что предел обнаружения гибридного белка и его комплекса со стрептави-дином (смин), рассчитанный по формуле смин = 3 где - стандартное отклонение фонового сигнала, 5 - тангенс угла наклона градуировочной прямой, составляет 0,1 пМ. Было также показано, что присутствие антител в концентрации от 10 до 10 М не влияет на активность гибридного белка и его комплекса со стрептавидином.
Далее были оптимизированы условия проведения ИФА. Показано, что оптимальное соотношение ком-
о
~^ + л
-< о
-
-О*- -F©
-О1-
Иммобилизованные Определяемый Иммобилизо-антитела антиген ванные
иммунокомп-лексы
Биотинили-
рованные
антитела
Иммобилизованные иммунокомп-лексы
Комплекс гибридный белок-стрептавидин
Иммобилизованные
детектируемые
иммунокомплексы
Рис. 2. Схема образования детектируемого комплекса
А , ед.
3000
Концентрация, пМ
Рис. 3. Зависимость интенсивности биолюминесценции от концентрации гибридного белка (1) и комплекса гибридного белка со стрептавидином (2). Условия измерения описаны в экспериментальной части
Рис. 4. Зависимость интенсивности биолюминесценции от логарифма концентрации клеток Salmonella typhimurium, сорбированных на планшет, активированный моноклональными небиотинилированными антителами
понентов при образовании комплекса гибридного белка со стрептавидином составляет 1:1. При увеличении относительной концентрации стрептавидина возрастает конкуренция последнего с комплексом стрепта-видин-люцифераза за биотин, находящийся на поверхности антител, что может привести к уменьшению биолюминесцентного сигнала за счет образования недетектируемого комплекса антитело-биотин-стрептавидин. Установлено, что оптимальная концентрация комплекса для проведения ИФА составляет 10 нМ. Было показано, что минимальная неспецифическая сорбция наблюдается при использовании буфера PBST для инкубации антител с использованием 1%-го раствора БСА в качестве блокирующего агента. Для оптимизации длительности проведения реакции между гибридным белком и стрептавидином была изучена кинетика комплексообразования. При различных соотношениях гибридного белка и стрептавидина варьировали длительность инкубации. При соотношении 1:1 интенсивность биолюминесценции выходит на плато через 60 мин, в то время как при двукратном избытке стрептавидина наблюдается небольшой рост интенсивности и после 2 ч инкубации. Для комплекса состава 1:1 оптимальное время инкубации составляет 90 мин, кроме того, для него наблюдалась и наилучшая воспроизводимость. Комплекс состава 1:1 и был использован в последующих экспериментах. В предварительно оптимизированных условиях был проведен гетерогенный сэндвич-анализ для определения клеток сальмонелл Salmonella typhimurium. Иммобилизацию препарата инактивированных клеток проводили на активированный моноклональными небиотинилированными антителами полистирольный планшет, при этом динамический диапазон составляет от КОЕ/мл (рис. 4).
Авторы выражают благодарность Л.Г. Стояновой за содействие в получении биомассы нативных
клеток Salmonella typhimurium.
Работа выполнена при поддержке РФФИ (проект № 11-04-00698-а).
CnHCOK HHTEPATyPW
1. DeLucaM. // Adv. Enzymol. 1976. 44. P. 37.
2. UgarovaN. N. // J. Biolum. Chemilum. 1989. 4. P. 406.
3. FragaH. // Photoch. Photobiol. Sci. 2008. 7. P. 146.
4. Seliger H.H., McElroy W.D. // Arch. Biochem. Biophys. 1960. 88. P. 136.
5. Ando Y. N. K., Yamada N., Enomoto T., Irie T., Kubota H., Ohmiya Y., AkiyamaH. // Nature Photon. 2008. 2. P. 44.
6. Viviani V. R., Ohmiya Y. // Photoproteins in Bioanalysis / Eds. S. Daunert, S.K. Deo. Weinheim, 2006. P. 49.
7. GreerL. F., SzalayA. A. // Luminescence. 2002. 17. P. 43.
8. LundinA. // Methods Enzymol. 2000. 305. P. 346.
9. Dawn H. M., Lim D. V. // Journal of Food Protection. 2010. 73. P. 739.
10. White P. J., Squirrell D. J., ArnaudP., Lowe C. R., Murray J. A. // Biochem J. 1996. 319. P. 343.
11. Law G. H., Gandelman O. A., Tisi L. C., Lowe C. R., Murray J. A. // Biochem J. 2006. 397. P. 307.
12. Eiry K., TamotsuI., Yoshihito I., Masuo A. // Anal. Biochem. 1993. 208. P. 300.
13. KarpM., Oker-Blom C. // Biomol. Eng. 1999. 16. P. 101.
14. Wang C.-Y., Sam Hitz, Andrade J. D., Stewart R. J. // Anal. Biochem. 1997. 246. P. 133.
15. Ohkuma H., Abeb K., Kosaka Y., Maeda M. // Anal. Chim. Acta. 1999. 395. P. 265.
16. Tatsumi H., Fukuda S., Kikuchi M., Koyama Y. // Anal. Biochem. 1996. 243. P. 176.
17. Chapman-Smith A., Cronan J. E. // J. Nutr. 1999. 129. P. 477.
18. Кокшаров М. И., Угарова H. H. // Вести. Моск. ун-та 2009. 50. С. 23.
19. Merkulova T. I., Abbasova S. G., Moshnikova A. B. // Hybridoma 1995. 14. P. 557.
20. Кокшаров M.И., Угарова H.H. // Биохимия. 2008. 73. С. 1071.
21. Cronan J. E. // J. Biol. Chem. 2002. 277. P. 22520
Поступила в редакцию 20.10.10
FUSION PROTEIN OF LUCIFERASE Lucióla mingrelica-BIOTIN CARBOXYL CARRIER PROTEIN: PRODUCTION, PROPERTIES, APPLICATION
M.I. Koksharov, D.V. Smirnova, S.G. Abbasova, N.N. Ugarova
(Division of Chemical Enzymology)
A plasmid was constructed by genetic engeneering methods that codes a fusion protein (4TS-bccp87) including the thermostable mutant of Lucióla mingrelica firefly luciferase (4TS) and the carboxyl-terminal 87 residues of E. coli biotin carrier protein (bccp87). It was shown that about 60% of the fusion protein was biotinilated after the expression in E. coli BL21(DE3). Catalytic properties, thermostability and bioluminescence spectra of the fusion protein were shown to be similar to that of the initial luciferase. It was demonstrated that streptavidin-biotinylated luciferase complex can be used in ELISA for the assay of Salmonella typhimurium cells in the interval from 104 to 5106 CFU/ml.
Key words: firefly luciferase, Luciola mingrelica, fusion protein, bccp, Salmonella typhimurium, streptavidin, biotin.
Сведения об авторах: Кокшаров Михаил Иванович - науч. сотр. кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ, канд. хим. наук, ([email protected]); Смирнова Дарья Васильевна - аспирант химического факультета МГУ ([email protected]); Аббасова Светлана Георгиевна - ст. науч. сотр. Института биоорганической химии имени М.М. Шемякина и Ю.А.Овчинникова, докт. биол. наук; Угарова Наталья Николаевна - глав. науч. сотр. кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ, докт. хим. наук, профессор ([email protected]).
