CC BY
23
УДК 57.083.2
СПЕЦИФИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ E. coli B ПРИ ПОМОЩИ БАКТЕРИОФАГА Т4, НАНОФИЛЬТРОВ И АТФ-МЕТРИИ O.A. Миних1' 2, Л.Ю. Бровко1, М.У. Гриффите1, Н.Н. Угарова2
(Институт по безопасности пищи Университета г. Гвелфа, Канада; 2кафедра химической этимологии химического факультета МГУ; е-mail: minikh-olga@yandex.ru)
Литичеекий бактериофаг и фильтры на оенове наноалюминиевых волокон «Disruptor 4601» иепользованы для епецифичеекого определения бактериальной обеемененноети методом АТФ-метрии. В качеетве модельной еиетемы выбрана еиетема: бактериофаг Т4-Е. coli B. Модификации метода позволяют либо количеетвенное определение E. coli B е нижним пределом, равным 1,0103 КОЕ/мл, либо детекцию Е. coli B в приеутетвии 60-кратного избытка S. typhimurium. Обе характериетики значительно улучшены по еравне-нию ео етандартным методом е применением фага Т4. Время, затраченное на анализ, уве-личиваетея незначительно.
Ключевые слова: бактериофаг Т4, бактериальная обсемененность, E. coli B, биолюминесценция, АТФ, наноалюминиевые волокна.
Своевременная детекция патогенных бактерий в пище и окружающей среде - важный шаг на пути к высоким стандартам микробиологического контроля. Стандартные микробиологические методы обычно занимают от 2 до 5 дней, чтобы определить и подтвердить наличие патогенов в исследуемых образцах. Часто это является неприемлемым, поэтому последние 20 лет интенсивно разрабатываются методы быстрой детекции. Наиболее широко используются методы на основе детекции антигенов и нуклеиновых кислот [1]. Тем не менее для иммуноанализа необ-ходмо наличие 10-105 КОЕ/мл образца [2, 3], а для успешного проведения полимеразно-цепной реакции (ПЦР) наличие как минимум 200 клеток в образце [4]. Более того, чувствительность обоих методов сильно ограничивается сложностью матрицы и неравномерным распределением клеток-мишеней в образце [1, 3]. Ранее было показано, что методы на основе бактериофагов могут успешно применяться для быстрой детекции патогенных микроорганизмов [2, 5-9]. В основе этих методов лежит принцип того, что фаг быстро и специфично атакует клетку и как следствие лизирует ее. Анализ посредством лизиса фагом клеток-мишеней с последующей АТФ-метрией позволяет достоверно определять 104 КОЕ/мл в течение 1-2 ч в присутствии неспецифической микрофлоры [7]. Увеличение чувствительности анализа может достигаться за счет концентрирования клеток в образце перед детекцией. Перспективным может
быть использование нанофильтров «Disruptor 4610» («Ahlstrom», США), состоящих из наноалюминиевык волокон с порами 2 мкм, которые обладают положительным зарядом. Эти нанофильтры показали высокую эффективность адсорбции бактерий и вирусов при фильтрации образца без избыточного давления [10]. Цель данной работы - сравнение эффективности различных способов применения данных нанофильтров для детекции E. coli путем лизиса клеток фагом Т4 и последующее измерение содержания клеток с помощью биолюминесцентной АТФ-метрии [3, 11, 12]. Мы исследовали две системы: 1) концентрированный раствор фага добавляли к клеткам, предварительно сконцентрированным на нанофильтре; 2) клетки концентрировали на фильтре, на котором предварительно сорбировали фаг. Быши рассчитаны степень удержания бактерий на фильтре и параметры детекции клеток E. coli путем лизиса фагом и последующей биолюминесцентной АТФ-метрии.
Материалы и методы Бактериофаг и бактериальные штаммы.
Штаммы клеток E. coli B и S. typhimurium, а также бактериофаг T4 быши получены из коллекции Канадского исследовательского Института по безопасности пищи*. Бактериальные клетки выращивали (37°C, 200 об/мин) в инкубаторе-шейкере «NBS Benchtop» («New Brunswick Scientific Co., Inc.», Канада) в течение 14-16 ч в Лурия-Бертрани среде/агаре (LB)
*Canadian Research Institute for Food Safety, University of Guelph 43 McGilvray St., Guelph, Ontario, N1G 2W1 Canada (mgriffit@uoguelph.ca).
(«Difco», США). Ночную культуру центрифугировали (10 мин, 4000g) в центрифуге «Beckman J2-MC» («Beckman Instruments Inc.», США) и ресуспендиро-вали в соответствующей среде. Подсчет клеток (КОЕ/мл) проводили путем высева на чашки с LB-агаром по 0,1 мл серийных разбавлений.
Наращивание и подсчет бактериофага проводили с использованием полутвердого агара [13]. Полученный препарат фага центрифугировали (10 мин, 6000 g). Су-пернатант фильтровали через стерильный фильтр (поры 0,2 мкм) «VacuCap 60 PF» («Pall Corp.», Канада), затем диализовали с использованием диализных кассет 10 000 MW («Slide-A-Lyzer», «Pierce», США), чтобы сменить среду на SM-буфер (50 мМ Трис-HCl, pH 7,5 («Fisher Scientic», США), 100 мМ NaCl, 8 мМ MgSO4, 0,01% желатин («Sigma-Aldrich», США)) и хранили при 4°C.
Детекция бактерий E. coli B с использованием бактериофага Т4 и биолюминесцентной АТФ-метрии. Для построения калибровочной кривой 0,1 мл клеточной суспензии (концентрация от 12 до 1-108 КОЕ/мл) в минимальной среде Дэвис («Difco», США), содержащей 1% декстрозы (Minimal Davis Media 1% Dextrose, MDD) и 0,077 мл 1,3-Ю11 БОЕ/мл фага Т4 были смешаны со средой MDD так, чтобы достичь конечного объема 1 мл. Образцы инкубировали в инкубаторе-шейкере «NBS Benchtop» («New Brunswick Scientific Co., Inc.», Канада) в течение 1 ч (37°C, 200 об/мин), затем измеряли концентрацию внеклеточной АТФ. Для этого в кювету люминометра модели "P1" («GEM Biomedical», США) вносили 0,05 мл суспензии бактерий или смеси бактерий с фагом, добавляли 0,10 мл люциферин-люциферазного биолюминесцентного реагента (BLR) «Aqua Trace» («Biotrace», Великобритания) и измеряли интенсивность сигнала за 10 с, которую выражали в относительных световых единицах (RLU). Фоновый сигнал измеряли перед началом эксперимента. Для полученных значений интенсивности (RLU) находили значение десятичного логарифма, (lg(RLU)), и строили зависимость следующего вида:
lg(RLU) = a + «-^(КОЕ/мл).
Иммобилизация бактериофага Т4 путем физической сорбции на нанофильтрах «Disruptor 4610» («Ahlstrom», США). В работе использовали фильтры «Disruptor 4610» из наноалюминиевых во-
локон (далее нанофильтры), любезно предоставленные корпорацией «Ahlstrom» (США). Нанофильтры - положительно-заряженные фильтры с толщиной 0,8 мм и порами 2 мкм. Раствор бактериофага Т4 объемом 0,05 мл (1,7-109 БОЕ/мл) наносили на поверхность фильтра (диаметр 1 см) и выдерживали 15-30 мин при комнатной температуре (RT). Затем через фильтр пропускали 10 мл фосфатного буфера («Pierce», США). Подсчитывали число бактериофа-гобразующих единиц в исходном растворе и фильтрате и по разнице определяли количество иммобилизованного фага.
Фильтрация суспензии клеток E. coli B через нанофильтры. Нанофильтр помещали в держатель (диаметр 1 см, «Millipore», США) и фильтровали через него 10 мл бактериальной суспензии (10-1-10 КОЕ/мл). Среднее время контакта образца с фильтром составляло ~2 мин. Подсчет бактерий в фильтрате проводили путем высева на чашку с LB-агаром. Степень эффективности удержания бактерий рассчитывали как отношение количества бактерий, удержанных на фильтре, к общему количеству бактерий в образце.
Детекция клеток E. coli с использованием на-нофильтров и АТФ-метрии. В работе использовали два метода детекции клеток E. coli.
Метод А. 10 мл бактериальной суспензии (101-10 КОЕ/мл) фильтровали через нанофильтр, как описано выше. Фильтр с удержанными бактериями помещали в пробирку, добавляли 0,10 мл
1-1010 БОЕ/мл T4
(в среде MDD*) и инкубировали в течение часа (37°C, 200 об/мин). Затем отбирали 0,05 мл супер-натанта, помещали в кювету люминометра, добавляли 0,05 мл BLR** и измеряли интенсивность биолюминесценции.
Метод Б. 10 мл бактериальной суспензии (101-10 КОЕ/мл) фильтровали через нанофильтр с иммобилизованным на нем фагом. Влажный фильтр вносили в кювету люминометра, инкубировали в течение 1 ч при перемешивании (37°C, 200 об/мин), затем добавляли 0,05 мл среды MDD и 0,05 мл BLR и измеряли интенсивность биолюминесценции.
Все эксперименты проводили как для чистой культуры E. coli B, так и для ее смеси с S. typhimurium. В последнем случае инкубацию проводили в фосфатном буфере, а не в среде MDD.
Статистическая обработка данных. Во всех экспериментах использовали по три образца. Для каж-
*Минимальная среда Дэвис; **реагент для измерения биолюминесценции.
дого образца находили величины lg(RLU), затем рассчитывали средние значения lg(RLU) и определяли для них стандартные отклонения (SD) с помощью программного обеспечения Excel (Microsoft Office, 2007). Статистические параметры рассчитывали, как описано ранее [14], используя следующие уравнения: предел детекции сигнала (SDL) lg(SDL) = ^(RLU^* + 3xSD; предел количественной детекции сигнала (SQL) lg(SQL) = ^(RLU^ + 10xSD; предел обнаружения (минимальный предел обнаружения, LOD) lg(LOD) = (^(RLU),^ + 3xSD-a)/m; нижний предел количественного определения (LOQ) lg(LOQ) = (lg(RLU)фон + 10xSD-a)/m, где m - наклон калибровочной прямой, SD - стандартное отклонение для фонового сигнала. Линейность калибровочной прямой оценивали с помощью корреляционного коэффициента (В2).
Специфичность - способность метода отличать ана-лит от других компонентов образца. В нашем случае специфичность (способность отличить E. coli B от S. typhimurium в их смеси) была определена как отклонение от истинного значения (чистая культура E. coli B) в процентах. Таким образом, специфичность для смешанный культур быша представлена в следующем виде: 100±отклонение, %, где допустимое значение отклонения не должно превышать 10%.
Результаты и их обсуждение Иммобилизация бактериофага на нанофильт-
рах Бактериофаг Т4 был иммобилизован на нано-фильтрах, как описано выше (1,7-109 КОЕ/фильтр). Число фагов в фильтрате составило (7-9)-108 БОЕ в 10 мл суспензии, т.е. 40-50% фаговых частиц иммобилизовалось на фильтре. Таким образом, число фагов на фильтре составляет (6,8-8,5)-10 БОЕ. Степень задержания бактериофага Т4 нанофильтрами «Disruptor 4610» немного меньше по сравнению с данными, опубликованными для энтеровирусов при их фильтрации через положительно заряженные керамические нанофильтры [10], что можно объяснить разными значениями электроотрицательности между исследованными вирусами.
Применение нанофильтров «Disruptor 4610» для концентрирования клеток Е. coli. 10 мл суспензий E. coli в диапазоне концентраций 10-
1-10 КОЕ/мл фильтровали через нанофильтры. Степень удержания бактерий фильтром составила 99,9% для суспензий с концентрацией до 1-10' КОЕ/мл включительно.
Детекция E. coli B при помощи нанофильтров и метода биолюминесцентной АТФ-метрии. Образцы E. coli (12-1-10 КОЕ/мл) мы пропускали через нанофильтры «Distuptor 4601», затем раствор Т4 (1010 БОЕ/мл) добавляли к фильтрам (метод А). Этот подход сопоставили с другим методом, когда суспензию E. coli пропускали через фильтры с уже иммобилизованным фагом (метод Б). В обоих методах лизис клеток измеряли при помощи биолюминесцентной АТФ-метрии путем добавления люциферин-люцифераз-ного реагента. Результаты представлены на рисунке и в таблице. По данным рисунка видно, что предел обнаружения (LOD) для прямого метода (T4-E. coli B) равен 104 КОЕ/мл, что согласуется с данными, полученными ранее [3, 11]. Для метода А наклон граду и-ровочной прямой значительно выше по сранению с прямым методом и LOD равен ~500 КОЕ/мл, LOD для метода Б составляет 766 КОЕ/мл. Таким образом, чувствительность методов А и Б в ~ 15-20 раз выше чувствительности прямого метода.
Для анализа с помощью нанофильтров «Distuptor 4601» необходимо 10 мл клеточной суспензии, тогда как для прямого метода требуется 50 мкл. Таким образом, при использовании методов на основе нано-фильтров объем необходимой суспезии возрастает в 200 раз, а чувствительность увеличивается только в 20 раз. Более низкая чувствительность, чем ожидалось, может быть объяснена неполным лизисом клеток. В самом деле, толщина нанофильтров «Distuptor 4601» составляет 0,8 мм, что усложняет контакт фага (в случае метода А) с бактериями, которые проникли внутрь. Помимо этого для методов на основе нанофильтров были получены более высокие стандартные отклонения (SD), что обусловливает увеличение LOD.
Методы с использованием нанофильтров показали хорошую специфичность детекции E. coli в смеси с S. typhimurium. Метод А позволяет определять E. coli B (7-104 КОЕ/мл)
при 8-кратном присутствии S. typhimurium с отклонением от значения для чистой культуры 7%, что не превышает допустимого 10%-го отклонения. Метод Б при 60-кратном избытке (3-104 КОЕ/мл E. coli B) S. typhimurium дает 4%-е отклонение сигнала от значения для чистой культуры.
*Фоновый сигнал буфера (фон).
Зависимость интенсивности биолюминесценции от концентрации E. coli B (КОЕ/мл). Используемые методы определения: на основе Т4 с «Disruptor 4601» (метод А (кривая 1); метод Б (кривая 2)); прямой анализ T4-E. coli B (кривая 3). Условия: концентрация T4 - 1010 БОЕ/мл, инкубация при 37°C, 200 об/мин, 1 ч . Данные представлены в виде среднего значения для трех
повторов (RLU) как среднее±8Б
Аналитические параметры методов специфической детекции Е. соН В с использованием бактериофага Т4 с нанофильтрами «В1ъгир1от 4601» (методы А и Б) и без фильтров (прямой метод). Интервал концентраций клеток, использованный для определения аналитических
параметров, 300-10° КОЕ/мл Е. соИ В
Диапазон применения 300-106 КОЕ/мл E. coli B
Параметр метод A метод B прямой T4-E. coli B метод
Предел определения 495 КОЕ/мл 766 КОЕ/мл 1,03 x103 КОЕ/мл
Предел количественного определения 985 КОЕ/мл 4,86x103 КОЕ/мл 2,74x103 КОЕ/мл
Пороговый сигнал 432 RLU 676 RLU 139 RLU
Пороговый сигнал количественного определения 824 RLU 2,1 x103 RLU 249 RLU
Уравнение калибровочной кривой для log RLU 0,94xlog[E. coli] + 0,11 0,61xlog[E. coli i]+1,06 0,53xlog[E. coli]+0,54
Чувствительность 0,94 0,61 0,53
Я2 0,992 0,995 0,921
Прямой метод (T4- E. coli B) показывает более слабые результаты для смешанной культуры: при 5-кратном избытке Salmonella метод дает 8%-е отклонение, а при 10-кратном избытке отклонение превышает допустимое 10%-е отклонение от значения для чистой
культуры. Высокая специфичность методов на основе нанофильтров может быть обусловлена более высокой концентрацией бактерий в смеси с фагом по сравнению с прямым методом. В случае метода Б, добавочным фактором служит эффективный контакт клет-
ка-фаг за счет избыточного давления во время фильтрации бактериальной суспензии через фильтр с фагом, что приводит к более полному лизису клеток-мишеней вопреки наличию избытка посторонней микрофлоры.
Таким образом, методы на основе Т4-бактериофага и нанофильтров показывают хорошие результаты детекции E. coli B как в чистой, так и в смешанной культурах. Преимущество метода Б состоит в том, что фаг иммобилизуется на фильтре за счет физичес-
кой сорбции, а следовательно, отсутствует необходимость его химической или геноинжинерной модификации, которые могут приводить к ухудшению литической активности фага. Метод позволяет также определять бактерии-мишени при высоком избытке посторонней микрофлоры. Все это указывает на возможность практического применения системы на основе использования бактериофага Т4 и нанофильтров для специфического определения патогенных бактерий.
Работа выполнена при частичной финансовой поддержке «SENTINEL» - Сети по разработке биоактивной бумаги «NSERC» (National Science and Engineering Research Council, Национальный комитет no науке и технике Канады) и Министерства Онтарио по Сельскому хозяйству и пище «OMAF».
CnHCOK JMTEPATYPbl
1. Abubakar I. et al. Il Health Technology Assessment. 2007. 11. 36.
2. Squirrell D.J., Price R.L., Murphy M.J. Il Analytica Chimica Acta. 2002. 457. P. 109.
3. GraciasK.S., McKillip J.L. Il Can. J. Microbiol. 2004. 50(11): P. 883.
4. Fung D.Y.C. Il Comprehensive reviews in food scince and food safety. 2002. 1. P. 3.
5. Favrin S.J., Jassim S.A., Griffiths M. W. II Int J Food Microbiol, 2003. 85. P. 63.
6. Wu Y, Brovko L., Griffiths M. W. II Lett. Appl. Microbiol. 2001. 33. N 4. P. 311.
7. Blasco R. et al. II J. Appl. Microbiol. 1998. 84. N 4. P. 661.
8. Edgar R. et al. II Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 2006. 103. N 13. P. 4841.
9. Goodridge L., Chen J., GriffithsM. // J. Food Microbiol. 1999. 47. N 1-2. Р. 43.
10. Karim М.Я. et al. // Appl. Environ. Microbiol. 2009. 75. N 8. Р. 2393.
11. Rees C.E.D., Loessner M.J. // Bacteriophages: biology and applications / Ed. E. Kutter, A. Sulakvelidze. 2005. Р. 267.
12. Угарова Н.Н., Фрунджян В.Г. Применение биолюминесцентной АТФ-метрии в биоаналитических целях. М., 2003.
13. Sambrook J., Russell D.W. Molecular Cloning: a laboratory manual. N.Y., 2001.
14. HarrisD.C. Quantitative Chemical Analysis / Ed. D.C. Harris. N.Y, 2007. Р. 78.
Поступила в редакцию 20.01.10
SPECIFIC E. coli B DETECTION USING T4 BACTERIOPHAGE, NANO-FILTERS AND ATP-BIOLUMINESCENCE
O. A. Minikh, L.Y. Brovko, M.W. Griffiths, N.N. Ugarova
(Department of chemical enzymology; Canadian Research Institute for Food Safety, University of Guelph )
Lytic bacteriophage and filters based on nano-aluminium fibers "Disruptor 4601 " were proposed to detect specific bacteria by ATP-bioluminescence. As a model system, system of T4 bacteriophage - bacteria E. coliB was chosen. Modifications of nano-filter based method with wild type T4 bacteriophage allow either quantitative detection of E.coli B with detection limit as low as 103 CFU/mL or accurate detection E.coli B at the 60-fold excess of S. typhimurium. Thus, T4 phage coupled with nano-filter media method performs much better than T4 coupled with the standard phage-mediated ATP-bioluminescence method. Increase in testing time required is not essential.
Key words: bacteriophage T4, bacterial contamination, E. coli B, bioluminescence, ATP, nano-aluminium fibers.
Миних Ольга Александровна - сотр. кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ (minikh-olga@yandex.ru); Бровко Любовь Юлиевна - профессор Института по безопсаности пищи Университета г. Гвелфа, докт. хим. наук (lbrovko@uoguelph.ca);Tpu0umc Мансел - профессор Института по безопсаности пищи Университета г. Гвелфа, докт. хим. наук (mgriffit@uoguelph.ca); Угарова Наталья Николаевна - глав. науч. сотр. кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ, докт. хим. наук (nugarova@gmail.com).
