CC BY
83
№ 4 - 2013 г.
14.00.00 медицинские и фармацевтические науки УДК 616.98:579.849.14:615.331
ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ БАКТЕРИОФАГА S-394 ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ САЛЬМОНЕЛЛЕЗОВ ПТИЦ
12 2 А. И. Агиенко , В. Г. Пугачев , О. Д. Тотменина
1ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздрава
России (г. Новосибирск) ФБУН ГНЦ вирусологии и биотехнологии «Вектор» (п. Кольцово, г. Новосибирск)
Получены данные об эффективности бактериофага S-394 относительно штаммов Salmonella в экспериментах на цыплятах, что обуславливает возможность его применения для лечения и профилактики сальмонеллезов птиц. Выявлены различия в концентрации бактериофага, выделенного из органов цыплят через 20 часов после выпаивания фага.
Ключевые слова: бактериофаг, сальмонелла, птицеводство, фаготерапия.
Агиенко Анна Игоревна — студентка 5-го курса медико-профилактического факультета ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет», e-mail: [email protected]
Пугачев Владимир Георгиевич — заведующий сектором отдела биофизики и экологических исследований ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», рабочий телефон: 8 (383) 363-4779, e-mail: [email protected]
Тотменина Ольга Дмитриевна — научный сотрудник отдела биофизики и экологических исследований ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», рабочий телефон: 8 (383) 363-4779, e-mail: [email protected]
Введение. Развитие птицеводческой промышленности неизбежно сопровождается концентрацией поголовья птицы и увеличением заболеваемости инфекционными болезнями, в том числе и сальмонеллезом. Сальмонеллез птиц наносит значительный экономический ущерб, который слагается из снижения яйценоскости кур, количества оплодотворенных яиц, высокой летальности эмбрионов, потери привесов молодняка, значительных затрат на диагностические и лечебно-профилактические мероприятия [1]. Известно, что основными возбудителями сальмонеллеза птиц являются Salmonella enteritidis [7] и Salmonella typhimurium [3, 8]. Однако спектр возбудителей в разных хозяйствах может изменяться. Преобладание тех или иных штаммов определяется различными путями заноса инфекции, например с кормом.
В последние годы сальмонеллы приобретают лекарственную устойчивость ко многим антибиотикам [4]. Антибиотикообработки также не позволяют избавить птицу от сальмоносительства, не способны профилактировать и ликвидировать инфекцию, а предотвращают лишь массовое клиническое проявление заболевания [5]. Кроме нанесения ущерба птицеводческой отрасли, сальмонеллез имеет большую социальную значимость — увеличивается эпидемиологическая роль таких продуктов питания, как мясо кур и яйца.
Широкое распространение среди людей и животных, отсутствие тенденции к снижению заболеваемости в большинстве стран мира, увеличение инфицированности сальмонеллами различных объектов среды показывает необходимость поиска новых эффективных мер борьбы с заболеванием [2, 6]. Таким образом, изучение возможности применения бактериофагов для лечения сальмонеллеза является актуальной задачей экологии человека.
Цель исследования: оценка эффективности использования бактериофага S-394 для профилактики и лечения сальмонеллезов птиц.
Материалы и методы. Экспериментальная часть работы была выполнена в 2012-2013 годах на базе отдела биофизики и экологических исследований ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор».
В работе использовали бактериофаги, полученные из коллекции ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»: S-394, депонированный в коллекции под номером Ph-1240, бактериофаги SS-2, PS-2, DS-1, PS-465, № 1.
В работе были использованы коллекционные штаммы бактерий Salmonella typhimurium, Salmonella enteritidis, Shigella sonnei, Escherichia coli. Также был использован штамм Salmonella sp. 1, выделенный в ходе санитарных мероприятий на птицефабрике.
Органы цыплят были предоставлены С. В. Леоновым в рамках договора о творческом сотрудничестве с Институтом экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока академии сельскохозяйственных наук.
В работе использовали следующие питательные среды и растворы: рыбно-пептонный плотный агар, верхний мягкий агар, висмут-сульфитный агар, LB-агар, хлороформ, физиологический раствор, раствор глюкозы 40 %, одномолярный раствор MgSO4.
Биологические свойства бактериофага изучали стандартными методами. Фаголизат получали путем заражения фагом бактериальной культуры, находящейся в логарифмической фазе роста. Определение литической активности проводили микрометодом. Антибиотикорезистентность определяли диско-диффузионным методом.
Результаты исследования и их обсуждение. В ходе санитарных мероприятий на птицефабрике был выделен штамм Salmonella sp. 1. Нами был проведен поиск бактериофага, активного в отношении данного штамма. Для этого изучали спектр литической активности коллекционных бактериофагов, лизирующих сальмонеллы. По сравнению с бактериофагами PS-2, SS-2, PS-465, № 1 и DS-1 фаг S-394 показал более широкий спектр литической активности как в отношении сальмонелл, так и в отношении штаммов E. coli и Shigella.
Среди сальмонелл бактериофаг S-394 лизировал не только штамм Salmonella sp. 1, используемый в нашей работе, но и штаммы S . typhimurium и S. enteritidis, являющиеся
основными возбудителями сальмонеллеза. Необходимо отметить, что высокий урожай бактериофага S-394 можно получать на условно патогенных штаммах Escherichia coli, что безопасно при масштабных культивированиях для создания препаратов на основе этого бактериофага для ветеринарии против Escherichia coli, Salmonella, Shigella, а также для уничтожения и предотвращения больничных инфекций. Таким образом, для нашего исследования был выбран именно бактериофаг S-394.
Для определения морфологии негативных колоний высевали исследуемый бактериофаг на чашки Петри с газоном бактериальной культуры E. coli. Было показано, что бактериофаг S-394 образует округлые с ровным краем, прозрачные, светлые, четкие негативные колонии одного типа диаметром от 0,1 до 0,2 см. Таким образом, можно сделать вывод о том, что данный бактериофаг является вирулентным и приводит к быстрой гибели зараженной клетки.
Изучение антибиотикорезистентности штамма Salmonella sp . 1 показало, что к 9-ти из 20-ти антибиотиков исследуемый штамм проявил чувствительность. Однако в отношении остальных 11 -ти антибиотиков не было отмечено ингибирования роста микроорганизма. Данный штамм оказался полирезистентным по отношению к традиционно применяемым для лечения сальмонеллеза животных и человека антибиотикам, таким как хлорамфеникол, линкомицин, энрофлоксацин и др.
Полученный фаголизат вводился трехсуточным цыплятам методом выпаивания. Каждому птенцу было введено по 1 мл препарата с концентрацией 10 фаговых частиц/мл. Первая группа цыплят получала только бактериофаг, а вторая предварительно была заражена
о
культурой Salmonella sp. 1 с титром
10° КОЕ/мл. Через определенный промежуток времени (2, 4, 6, 8, 20 часов) производился забой птицы, и у каждого цыпленка были извлечены такие внутренние органы как селезенка, печень и кишечник для дальнейшего исследования. Опыт проводился в двух повторностях.
Затем определяли присутствие бактериофага и его количественное содержание в органах всех цыплят. Для этого каждый орган помещали в пробирку с физиологическим раствором и измельчали. Полученную суспензию в каждой пробирке обрабатывали хлороформом и высевали на газоны культуры Salmonella sp. 1, инкубировали в термостате 24 часа и проводили учет результатов.
Группа цыплят, получавших только бактериофаг (контроль). До 20 часов наблюдали присутствие фага в кишечнике, причем наибольшие концентрации — в течение первых 2, 4 часов: от 10 до 10 БОЕ на 1 г ткани. Также отмечали незначительные количества фага в ткани селезенки у цыплят, забой которых происходил через 4 часа после выпаивания фага. Можно предположить, что проникновение фага в ткани цыплят уже через 2 часа обусловлено его малыми размерами (75-80 нм). Такая скорость распределения является преимуществом для применения бактериофага в терапевтических целях. В течение 20 часов наблюдалось понижение концентрации бактериофага. К 20 часам его концентрация составляла 2 х 10 БОЕ/г (см. рис.). Это можно объяснить тем, что для размножения фагу необходима чувствительная к нему бактериальная культура. Отсутствие таковой среди микрофлоры желудочно-кишечного тракта, в печени и селезенке не позволяет ему размножаться и обуславливает снижение концентрации. Так, фаговые частицы разрушаются и постепенно выводятся из организма.
Группа цыплят, зараженная культурой Salmonella sp. 1 и получавшая бактериофаг в качестве лечения. В течение первых часов в исследуемых тканях бактериофаг количественно не определялся. Незначительные количества присутствовали
в двухчасовых пробах (кишечник и печень одного цыпленка), бактериофаг выявлен после обогащения пробы. Также из четырехчасовых проб удалось накопить бактериофаг из кишечника второго цыпленка. Однако количественный анализ данных проб не показал присутствия значительных количеств фага. Через 6 часов из кишечника одного цыпленка был выделен фаг в концентрации 3,1 х 102 БОЕ на 1 г ткани, что является сравнительно небольшим количеством. Так, в шестичасовых пробах с выпаиванием бактериофага без предварительного заражения культурой концентрация фага достигала 103 БОЕ/г. Однако, к 20 часам концентрация фага во всех органах обоих цыплят увеличилась до 103-104 БОЕ на 1 г ткани (см. рис.). При этом наибольшие количества наблюдаются в печени и кишечнике. Возможно, такой характер динамики определяется тем, что в первые часы фаг находится в латентном периоде взаимодействия с бактериальной клеткой, а затем происходит лизис клеток и выход фаговых частиц.
Выделение бактериофага из проб с печенью и селезенкой цыплят через 20 часов после введения им препарата может свидетельствовать о том, что исследуемый бактериофаг сохраняет способность к размножению не только в желудочно-кишечном тракте, но и в других внутренних органах и тканях.
Концентрация бактериофага, выделенного из органов цыплят через 20 часов после
выпаивания фага
Выводы. Изучены биологические свойства бактериофага S-394 (литическая активность, спектр литического действия, морфология негативных колоний). Установлена высокая антибиотикоустойчивость культуры БаШопеПа $р. 1. Выявлено, что в органах цыплят бактериофаг распределяется преимущественно в кишечнике. При отсутствии специфичных бактериальных клеток через 20 часов бактериофаг практически полностью выводится из организма. При наличии в организме чувствительной к нему культуры БаШопеПа $р. 1 происходит активный лизис бактериальных клеток и увеличение концентрации бактериофага, что обуславливает возможность его практического применения для лечения сальмонеллеза птиц.
Список литературы
1. Борисенкова А. Н. Система контроля бактериальных болезней: научное издание / А. Н. Борисенкова // Птицеводство. — 2004. — № 8. — С. 13-16.
2. Ванханен В. В. Сальмонеллез — эпидемиология и профилактика (научно-практическое издание) / В. В. Ванханен, В. Д. Ванханен, А. Д. Усенко ; под ред. Ванханена В. Д. — Донецк, 2003. — 48 с.
3. Осидзе Д. Ф. Инфекционные болезни животных: справочник / Ю. Ф. Борисович, Л. В. Кирилов. Под ред. Д. Ф. Осидзе. — М.: Агропромиздат, 1987. — 287 с.
4. Пименов Н. В. Антибиотикорезистентность сальмонелл, выделенных у домашних голубей / Н. В. Пименов, Н. В. Данилевская // Ветеринария. — 2006. — № 9. — С. 20-24.
5. Рекомендации по диагностике, профилактике и ликвидации сальмонеллеза кур / А. Н. Куриленко [и др.]. — М. : МСХ / МГАВМиБ, 2002. — 34 с.
6. Рожнова С. Ш. Сальмонеллезы : проблемы и решения / С. Ш. Рожнова // Эпидемиология и инфекц. болезни. — 1999. — № 2. — С. 39-41.
7. Chung Y. H. Prevalence and antibiotic susceptibility of Salmonella isolated from foods in Korea from 1993 to 2001 / Y. H. Chung, S. Y. Kim, Y. H. Chang // Journal of Food Protection. — 2003. — Vol. 66, N 7. — P. 1154-1157.
8. Flensburg J. Programs to control or eradicate Salmonella in animal production in Denmark / J. Flensburg // Acta Veterinaria Scandinavia. — 1999. — N 91. — P. 5158.
PERSPECTIVE OF USAGE OF S-394 BACTERIOPHAGE FOR PROPHYLAXIS AND TREATMENT
OF SALMONELLOSES AT BIRDS
12 2 A. I. Agienko , V. G. Pugachev , О. D. Totmenina
JSBEIHPE «Novosibirsk State Medical University of Ministry of Health» (Novosibirsk c.) 2FBSE SRC of Virology & bioengineering « Vector» (Koltsovo, Novosibirsk region)
Data on efficiency of S-394 bacteriophage concerning Salmonella strains in experiments on chickens that causes possibility of its application for treatment and prophylaxis of salmonelloses at birds are obtained. Differences in concentration of bacteriophage marked from organs of chickens in 20 hours after desoldering of phage are revealed.
Keywords: bacteriophage, salmonella, poultry farming, phagotherapy.
About authors:
Agiyenko Anna Igorevna — student of the 5th course of medical preventive faculty at SBEI HPE «Novosibirsk State Medical University of Ministry of Health», e-mail: [email protected]
Pugachev Vladimir Georgiyevich — head of sector of biophysics and ecological researches department at FBSE SRC VB «Vector», office phone: 8 (383) 363-47-79, e-mail: [email protected]
Totmenina Olga Dmitriyevna — research associate of sector of biophysics and ecological researches department at FBSE SRC VB «Vector», office phone: 8 (383) 363-47-79, e-mail: [email protected]
List of the Literature:
1. Borisenkova A. N. Monitoring system of bacterial illnesses: scientific edition / A. N. Borisenkova // Poultry farming. — 2004. — № 8. — P. 13-16.
2. Vankhanen V. V. Salmonellosis — epidemiology and prophylaxis (scientific and practical edition) / V. V. Vankhanen, V. D. Vankhanen, A. D. Usenko; under the editorship of Vankhanen of EL — Donetsk, 2003. — 48 P.
3. Osidze D F. Infectious diseases of animals: directory / Yu. F. Borisovich, L. V. Kirillov. Under the editorship of D. F. Osidze. — M: Agropromizdat, 1987. — 287 P.
4. Pimenov N. V. Antibioticresistance of salmonellas allocated at house pigeons / N. V. Pimenov, N. V. Danilevskaya // Veterinary medicine. — 2006. — № 9. — P. 20-24.
5. References on diagnostics, prophylaxis and elimination of a salmonellosis of hens / A.N. Kurilenko [etc.]. — M: MA / MSAVM&B, 2002. — 34 P.
6. Rozhnova S. Sh. Salmonelloses: problems and decision / S. Sh. Rozhnova // Epidemiology and infect. illnesses. — 1999. — № 2. — P. 39-41.
7. Chung Y. H. Prevalence and antibiotic susceptibility of Salmonella isolated from foods in Korea from 1993 to 2001 / Y. H. Chung, S. Y. Kim, Y. H. Chang // Journal of Food Protection. — 2003. — Vol. 66, N 7. — P. 1154-1157.
8. Flensburg J. Programs to control or eradicate Salmonella in animal production in Denmark / J. Flensburg // Acta Veterinaria Scandinavia. — 1999. — N 91. — P. 5158.
