БЫСТРОЕ ОБНАРУЖЕНИЕ БАКТЕРИЙ РОДА CAMPYLOBACTER В МЯСЕ И ОБРАЗЦАХ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ МЕТОДОМ ИЗОТЕРМИЧЕСКОЙ АМПЛИФИКАЦИИ (LAMP) И БИОЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ГОТОВОГО БУЛЬОНА ОБОГАЩЕНИЯ Текст научной статьи по специальности «Ветеринарные науки»

УДК 579.67

DOI: 10.21323/2071-2499-2019-4-38-41

Табл. 6. Ил. 1. Библ. 7.

БЫСТРОЕ ОБНАРУЖЕНИЕ БАКТЕРИЙ РОДА CAMPYLOBACTER В МЯСЕ И ОБРАЗЦАХ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ МЕТОДОМ ИЗОТЕРМИЧЕСКОЙ АМПЛИФИКАЦИИ (LAMP) И БИОЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ГОТОВОГО БУЛЬОНА ОБОГАЩЕНИЯ

Кристина Барнс, технический эксперт, микробиолог,

Нил Перси, специалист лаборатории,

Синтия Зук, коммерческий менеджер,

Габриела Лопес Веласко, специалист,

Радж Раджагопал, старший технический эксперт

3М пищевая безопасность, Сент-Пол, Миннесота

Ключевые слова: контроль патогенов, 3M™ Система молекулярного анализа, бактерии рода Campylobacter, кампилобактериоз

Введение

Кампилобактериоз является второй наиболее часто регистрируемой причиной пищевых заболеваний, а Campylobacter jejuni является наиболее распространённым штаммом, вызывающим болезнь. По оценкам CDC в США ежегодно регистрируется около 1,3 млн заболеваний.

Большинство заболеваний в основном происходят из-за употребления сырого или недостаточно термически обработанного мяса, а также из-за перекрёстного загрязнения других продуктов. Сырое мясо птицы, заражённое бактериями рода Salmonella и Campylobacter в процессе убоя и из-за загрязнения на ферме (бактерии на коже птицы), может быть направлено на переработку. Надлежащие санитарные операции и использование про-тивомикробных средств необходимы для сведения к минимуму загрязнения во время убоя и разделки тушек на части, и измельчения продукта [1].

Служба безопасности и инспекции продуктов питания (FSIS) Министерства сельского хозяйства США (USDA) продолжает усовершенствовать программу контроля и внесла изменения в программу по контролю за исследованиями Salmonella и Campylobacter в 2016 году. Цель программы состоит в том, чтобы путём внедрения программы обеспечить соответствие учреждений новым

стандартам эффективности и оценить эффективность практики сокращения патогенов [2, 3].

Обнаружение Campylobacter в птицеводческой промышленности часто оценивается на уровне первичного производства тушки бройлера и/или частей птицы, а также в сырых или приготовленных продуктах. Обнаружение Campylobacter в этих типах продуктов может быть сложным, так как Campylobacter spp. являются микроаэрофильными бактериями и требуют сложных сред для оптимального роста и жизнеспособности (рисунок 1). Сочетание готового к использованию бульона для обогащения и технологий быстрого обнаружения обеспечивает более лёгкое и быстрое обнаружение.

3M™ Система молекулярного анализа - новая технология, которая использует петлевую изотермическую амплификацию (LAMP) и биолюминесценцию для детекции с целью обнаружения патогенов в пищевых продуктах. Амплификация проводится с помощью Bst полимеразы, уникального энзима для выявления ДНК, которая включает непрерывную быструю изотермическую амплификацию ДНК. 3М™ Тест-набор для определения бактерий рода Campylobacter с помощью 3М™ Системы молекулярного анализа был разработан для быстро-

RAPID DETECTION OF CAMPYLOBACTER IN MEAT MATRICES AND ENVIRONMENTAL SAMPLES UTILIZING A READY-TO-USE (RTU) ENRICHMENT BROTH AND LOOP MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION (LAMP)-BIOLUMINESCENT DETECTION

3M Food Safety, St. Paul, MN:

Christina Barnes, senior R&D, microbiologist

Neil Percy, Cynthia Zook,

Gabriela Lopez Velasco, Raj Rajagopal

Key words: pathogen detection, 3M™ Molecular detection system, Campylobacter

го и специфического обнаружения Campylobacter в пищевых матрицах и образцах первичной продукции после обогащения в 3M бульоне для обогащения Campylobacter. Уникальность обогащения состоит в том, что накопительный бульон легко готовится путём простого добавления стерильной воды к сухому бульону (рисунок 1). Кроме того, инкубация обогатительного бульона проводится в аэробных условиях. 3M™ Система молекулярного анализа - это быстрое обогащение и обнаружение по сравнению с традиционными методами.

Целью данного исследования была оценка эффективности метода 3M (рисунок 1) на инклюзивность, эксклюзивность и обнаружение Campylobacter в широком диапазоне матриц по сравнению с эталонными методами ИСО и USDA.

Материалы и методы а. Инклюзивность и эксклюзивность

Инклюзивность: сто два (102) различных термотолерантных изолята Campylobacter, включая C. jejuni, C. coli и C. lari (таблица 1), культивировали в 3M Campylobacter бульоне для обогащения в течение 24 часов при температуре 41,5 °C, а затем разбавляли до уровней ~ 105 КОЕ/мл перед тестированием методом 3M.

ВСЁ О МЯСЕ № 4 | 2019

Рисунок 1.

Сравнительный анализ этапов обогащения

Campylobacter spp. c использованием 3M бульона обогащения и традиционного метода

Таблица 1

Группа штаммов Campylobacter

Инклюзивные Кол-во

штаммы п = 100 использованных

штаммов

C. Jejuni 70

C. coli 22

с. ы ю

Эксклюзивность: сто (100) различных нецелевых штаммов, включая близкородственные организмы (таблица 2), культивировались в соответствующих средах в течение 18-24 часов при соответствующей температуре, а затем разбавлялись до уровней ~ 107 КОЕ/мл перед испытанием методом 3М.

в. Сравнение методов

Исследования были проведены для оценки эффективности метода 3М по сравнению с эталонными ме-

тодами ISO 10272-1:2017 [4] и USDA FSIS MLG 41.04 [5] для обнаружения C. jejuni, coli и lari. Продукты, обычно содержащие натуральный Campylobacter и/или продукты, которые, как сообщается, являются сложными из-за их состава, например, с высоким уровнем бионагрузки, добавленными консервантами, дезинфицирующим воздействием и т.д., были включены в оценку.

Пятьсот шестьдесят три (563) искусственно и естественно контами-нированных образца (таблица 3) были оценены как несопряжённые образцы, часть которых была проанализирована 3М методом (таблица 4), часть - по методике ИСО и часть - по методу Министерства сельского хозяйства США USDA FSIS MLG 41.04, когда это применимо. Результаты были проанализированы с использованием диссонирующего анализа [6, 7].

Результаты

а. Инклюзивность и эксклюзивность

Способность метода обнаруживать изоляты кампилобактера, в том числе штаммы C. jejuni, C. coli и C. lari, составила 100 % в проанализированных 102 штаммов. Отсутствие интерференции со стороны соответствующего диапазона нецелевых штаммов составило 100 % от 100 различных изолятов, включая близкородственные организмы (таблица 5).

в. Сравнение методов

Разница между отрицательным отклонением (ND) и положительным отклонением (PD) не была значительна при сравнении 3М™ Тест-набора на определение бактерий рода Campylobacter с методом USDA FSIS MLG 41.04 во всех испытанных категориях (таблица 6). Однако между методом 3M и эталонным методом ИСО 10272-1 для отдельных категорий матриц (таблица 6) су-

Таблица 2

Панель нецелевых штаммов (N = 100)

Группа Род/вид

Bacillaceae Bacillus atrophaeus Bacillus cereus Bacillus subtilis

Bacteriodaceae Bacteroides ureolyticus

Burkholderiaceae Burkholderia cepacia Ralstonia picketti

Brucellaceae Orchrobactrum anthropi (n=2)

Arcobacter butzleri Campylobacter hominis

Arcobacter cryaerophilius Campylobacter hyointestinales

Arcobacter nitrofigilis Campylobacter larinae

Arcobacter cibarius Campylobacter mucosalis

Campylobacteracae Arcobacter defluvii Arcobacter myrtii Campylobacter rectus Campylobacter showae

Arcobacter skirrowii Campylobacter sputorum

Campylobacter concisus Campylobacter upsaliensis

Campylobacter curvus Sulfurospirillum barnesii

Campylobacter fetus (n=3)

Cedecea neteri Escherichia coli (n=3)

Citrobacter brakii Hafnia alvei

Citrobacter freundii Klebsiella oxytoca

Cronobacter sakazakii Klebsiella pneumoniae (n=2)

Edwardsiella tarda Morganella morganii

Enterobacteriaceae Enterobacter aerogenes Enterobacter amnigenus Proteus mirabilis (n=2) Proteus vulgaris (n=2)

Enterobacter cloacae Salmonella Typhimurium (n=2)

Enterococcus durans Salmonella Newport

Enterococcus faecalis Serratia liquefaciens

Enterococcus gallinarum Shigella flexneri

Enterococcus mundtii Shigella sonnei

Flavobacteriaceae Chryseobacterium shigense

Helicobacteracaae Helicobacter canadensis Helicobacter pylori

Lactobacillaceae Lactobacillus plantarum Lactobacillus rhamnosus Lactobacillus curvatus Lactobacillus lactis

Listeriaceae Listeria monocytogenes Listeria ivanovii

Kocuria rosea Staphylococcus aureus

Micrococcaceae Kocuria rhizophilia Staphylococcus epidermidis Staphylococcus warneri

Moraxellacae Acinetobacter baumanii (n=2) Acinetobacter lwoffi Moraxella catarrhalis Moraxella osloensis

Aeromonas hydrophila Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonadaceae Aeromonas salmonicida Aeromonas caviae Pseudomonas fluorescens Pseudomonas putida Pseudomonas spp.

Saccharomycetaceae Candida athensensis Candida albicans Sacchromyces cervisiae (n=2)

Shewanellaceae Shewanella halitosis Shewanella putrefaciens

Streptococcaceae Streptococcus bovis Streptococcus pyrogenes (n=2)

Vibrionaceae Vibrio parahaemolyticus (n=3) Vibrio vulnificus (n=2)

ВСЁ О МЯСЕ № 4 | 2019

Таблица 3

Испытанные матрицы

Категория Специфические матрицы

Смывы - Цельная курица без потрохов,

с тушек молодая курица, охлаждённая

(159) воздухом, органическая,

предварительно охлаждённая

тушка промыванием

Части - Курица: грудки, окорочка,

птицы бёдра, крылья, филе бедра,

(п=90) голень, спина, разнообразные

части

- Индейка: грудь, бёдра, крылья,

вырезка груди, спины, шеи

- Другое: утиные крылья

Тушки - Курица целиком, индейка,

птицы утка, тушёные куриные тушки

Губка

(п=60)

Сырье - Фарш: курица, индейка,

(фарш, свинина

внут-

ренние - Органы: куриные сердца,

органы) куриные желудки, куриная

(п=60) печень, желудки индейки,

печень индейки

- Курица: сосиски без кожи,

колбаса, рёбра, мясо на гриле,

Полу- куриные палочки, копчёная

фабрикаты куриная колбаса, обжаренные

(приготов- куриные полоски, жареная

ленные) в духовке курица, сосиски,

(п=74) жареная курица, куриные

наггетсы, куриное вяленое

мясо, курица конфи

- Индейка: жареное в духовке

мясо, копчёная колбаса,

сосиски, копчёное мясо,

вяленое мясо, закуски палочки

Первичная окружающая среда (бахилы/ тампоны) (п=120) - Бахилы из первичных производственных помещений и тампоны из курятника

Протоколы обогащения по методу 3M

Таблица 4

Категория

Матрица

3M Method Protocol

Sample Size

Бульон обогащения (объём)

Время обогащения M41.5oC

Сравнительный контрольный метод*

Смыв с тушки

Carcass Sponge

Смывы с тушек птицы Части птицы Тушки птицы Губка

Сырой фарш Сырое мясо Курица и свинина

Внутренние органы, Курица Приготовленное мясо курицы Готовые продукты из курицы

Бахилы/тампон

30 mL 30 mL 1 губка

25 г

25 г 25 г 1 тампон

Первичная окружающая среда Тампон из курятника/губка 1 тампон

Результаты инклюзивности и эксклюзивности

30 мл 30 мл 25 мл

225 мл

225 мл 225 мл 100мл

100мл

Таблица 5

Результаты

Анализы

102/102 Campylobacter jejuni, Campylobacter coli and Campylobacter lari 100% Инклюзивность штаммы были обнаружены

100/100 нецелевые штаммы не были обнаружены 100% Эксклюзивность

Таблица 6

Результаты и статистический анализ на основе ISO 16140-27 (N = 563)

Критерии приемлемости

3M Метод vs. USDA MLG FSIS 41.04

3M Метод vs. ISO 10272-1: 2017

Не определяется существенная разница между методами, когда ND-PD* < +5, В 3-х категориях

ществует существенное различие. Метод ИСО использует небольшое количество образца (10 мл для смывов или 10 г для продуктов) по сравнению с методом 3М (30 мл для смывов и 25 г для продуктов), и метод 3М показывает более высокое положительное обнаружение, что может привести в значительной разнице в ND-PD-121 (таблица 6). Все предполагаемые положительные результаты по методу 3М были подтверждены культу-ральным методом. Также отсутствовала матричная интерференция, подтверждённая достоверными результатами для всех 563 обогащённых образцов, протестированных параллельно с использованием метода молекулярного анализа 3M.

Пределы обнаружения (LOD)

Предел обнаружения 3М™ Тест-набора для определения бактерий рода Campylobacter - 103 КОЕ/мл для чистых культур, и самая низкая обнаруженная концентрация - от 1 до 5 КОЕ/ образец в обогащении.

Выводы

Эффективность нового простого в использовании обогащающего бульона и нового молекулярного метода, основанного на петлевой изотермиче-

Статистически не отличается (ND- PD = -16)

Статистически не отличается (ND- PD = -121)

22-26 22-26 22-26

24-28

24-28 24-28 22-26

22-26

USDA FSIS MLG; ИСО процедура А/В USDA FSIS MLG; ИСО процедура В USDA FSIS MLG; ИСО процедура В

ИСО процедура В

ISO процедура В ИСО процедура A ИСО процедура В USDA FSIS MLG; ИСО процедура В

Узнайте больше о решениях для пищевой безопасности 3М на www.3MRussia.ru/foodsafety

ской амплификации для обнаружения бактерий рода Campylobacter, была оценена на инклюзивность, эксклюзивность и эффективность по сравнению с методом USDA FSIS MLG 41.04 и эталонным методом ISO 10272-1 с широким спектром образцов.

□ Альтернативный готовый к использованию бульон обогащения в сочетании с молекулярным методом 3M был определён как специфичный только для обнаружения Campylobacter spp. (C. jejuni, C. coli и C. lari), исключая родственные микроорганизмы.

□ Альтернативный готовый к использованию бульон обогащения в сочетании с молекулярным методом 3M был согласован с методом USDA FSIS MLG 41.04 и эталонным методом ISO 10272-1 для широкого спектра матриц.

□ Новый бульон обогащения и молекулярный метод 3M предлагают специфический и быстрый подход для обнаружения Campylobacter spp., предлагая производителям птицы и независимым лабораториям результат на следующий день для оценки микробиологического качества и безопасности птицы и других мясных продуктов.

© КОНТАКТЫ:

Отдел пищевой безопасности 3М Россия

108811, г. Москва, п. Московский,

Киевское ш., 22-й км, домовл. 6, стр. 1

V +7(800) 250-84-74 (звонок бесплатный)

V +7(495)784-74-74

a foodsafetyrussia@mmm.com

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:

1. Министерство сельского хозяйства США, служба инспекции безопасности пищевых продуктов. Отчёт о ходе тестирования сальмонеллы в сыром мясе и птице (1998-2010).

2. Директива FSIS 10, 250.1. Программа верификации сальмонеллы и кампилобактера для сырья и продуктов птицеводства.

3. Уведомление Федерального Регистра (2012). План ХАССП переоценка для не готовых к употреблению продуктов птицеводства и связанных с ними процедур проверки. 6 декабря, Протокол № FSIS 2012-0001. Т. 77. № 235.

4. ISO 10272-1:2017 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных - горизонтальный метод обнаружения Campylobacter spp.

5. Руководство по микробиологической лаборатории USDA FSIS 41.04: выделение и идентификация Campylobacter jejuni/coli/lari из смывов птицы, губок и образцов сырья (2016).

6. ИСО 16140:2003 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных протокол валидации альтернативных методов.

7. ISO 16140-2:2016 Микробиология пищевой цепи - валидация метода - Часть 2: протокол валидации альтернативных (патентованных) методов против эталонного метода.