CC BY
382
Для корреспонденции
Ефимочкина Наталья Рамазановна - доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории биобезопасности и анализа нутримикробиома ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии»
Адрес: 109240, г. Москва, Устьинский проезд, д. 2/14 Телефон: (495) 698-53-83 E-mail: karlikanova@ion.ru
Ефимочкина Н.Р., Пичугина Т.В., Стеценко В.В., Быкова И.Б., Маркова Ю.М., Короткевич Ю.В., Полянина А.С., Шевелева С.А.
Оптимизация методов контроля пищевых продуктов на основе создания дифференциально-диагностических сред для выделения и культивирования бактерий рода Campylobacter
ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии», Москва Federal Research Centre of Nutrition, Biotechnology and Foоd Safety, Moscow
Проведены скрининговые исследования по выделению кампилобактерий из продуктов, полуфабрикатов и объектов внешней среды предприятий птицеперерабатывающей промышленности. Наиболее высокий уровень обнаружения возбудителей кампилобактериоза установлен для сырых птицепродуктов, включая тушки цыплят-бройлеров, индеек, перепелов и производимых из них полуфабрикатов. Выявлена общая закономерность попадания кампилобактеров в сырье и пищевые продукты при недостаточной эффективности санитарной обработки отдельных участков производства: в большинстве случаев Campylobacter spp. выделяли из образцов, обсемененных колиформными бактериями и сальмонеллами. Показано, что частота контаминации сырых птицепродуктов патогенами в значительной мере зависит от технологии охлаждения тушек. При использовании погружного способа создаются условия для перекрестной контаминации патогенами через воду в ваннах охлаждения (45% проб, зараженных Campylobacter spp.). При комбинированном использовании переохлажденной воды и гидроаэрозолей кампилобактерии также выявляли достаточно часто - в 27% проб. Контаминация патогенами была наименьшей при испарительном способе охлаждения с использованием антимикробных гидроаэрозолей (<5% положительных проб), что позволяет признать его наиболее перспективным для производства безопасной в микробиологическом отношении продукции. Проведена работа по оптимизации состава питательных сред и адаптации рекомендуемых методических схем анализа для выявления и видовой идентификации бактерий рода Campylobacter. Модифицированы рецептуры традиционно
Для цитирования: Ефимочкина Н.Р., Пичугина ТВ., Стеценко В В., Быкова И.Б., Маркова Ю.М., Короткевич Ю.В., Полянина А.С., Шевелева С.А. Оптимизация методов контроля пищевых продуктов на основе создания дифференциально-диагностических сред для выделения и культивирования бактерий рода Campylobacter // Вопр. питания. 2017. Т. 86. № 5. С. 34-41. Статья поступила в редакцию 12.06.2017. Принята в печать 08.09.2017.
For citation: Efimochkina N.R., Pichugina T.V., Stetsenko V.V., Bykova I B., Markova Yu.M., Korotkevich Yu.V., Polyanina A.S., Sheveleva S.A. Optimization of microbiological methods for food control based on the differential-diagnostic media for the isolation and cultivation of bacteria of the genus Campylobacter. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2017; 86 (5): 34-41. (in Russian) Received 12.06.2017. Accepted for publication 08.09.2017.
Optimization of microbiological methods for food control based on the differential-diagnostic media for the isolation and cultivation of bacteria of the genus Campylobacter
Efimochkina N.R., Pichugina T.V., Stetsenko V.V., Bykova I.B., Markova Yu.M., Korotkevich Yu.V., Polyanina A.S., Sheveleva S.A.
используемых питательных сред и подобран сбалансированный состав ростовых и селективных компонентов в соответствии с требованиями действующих стандартов. Учитывая актуальность повышения эффективности методов контроля бактерий рода Campylobacter и отсутствие в Российской Федерации необходимого набора отечественных аналогов питательных сред, разработан оптимизированный способ производства сухих питательных сред для выявления, идентификации и хранения кампилобактерий, выделенных из пищевой продукции и клинического материала. Проведенные исследования позволили разработать Технические условия 21.20.23-006-01897222-2016 «Питательные среды сухие для детекции бактерий рода Campylobacter» и «Инструкцию по применению питательных сред». В зависимости от назначения среды вырабатывают в следующих вариантах: жидкая селективная среда для накопления кампилобактерий; дифференциально-диагностический агар для выделения и количественного учета Campylobacterspp.; полужидкий питательный агар для криохранения культур Campylobacter spp. В перечень критериев оценки качества серийно выпускаемых партий сухих сред включены растворимость, рН, прочность агарового геля, содержание амин-ного азота, специфичность, селективность, ростовые и ингибирующие свойства. Практическое применение этих сред в условиях отечественных лабораторий позволит существенно упростить использование действующих ГОСТов, разработанных на основе международных стандартов ISO, но не адаптированных к основному ассортименту коммерческих сред и реактивов, применяемых при рутинном контроле пищевых продуктов на наличие кампилобактерий. Ключевые слова: бактерии рода Campylobacter, питательные среды, пищевая продукция, методы контроля, хранение штаммов
А screening study on the detection of campylobacteria in raw food products, semi-finished products and objects in the external environment in the poultry processing industry was conducted. The highest level of detection of campylobacteria is set for raw poultry products, including carcasses of broilers, turkeys and quail. A general accordance of getting Campylobacter in raw materials and food products with inadequate sanitary treatment of separate areas of production has been established: in most cases Campylobacter spp. was extracted from the samples, contaminated with coliform bacteria and Salmonella. It is shown that the frequency of contamination of raw poultry with pathogens is largely dependent on the cooling of the carcasses. When using the immersion method, the conditions for cross contamination with pathogens through water bath cooling are present (45% of samples infected with Campylobacter spp). Under combined use of super-cooled water and aerosols Campylobacter were also detected quite often in 27% of samples. Contamination by pathogens was the lowest in evaporative cooling method with the use of antimicrobial hydrospray (less than 5% positive samples), allowing to recognize this method as the most promising for the production of microbiological safe products. The work on optimization of nutrient medium composition and adaptation recommended methodological scheme of analysis for detection and species identification of bacteria of the genus Campylobacter was carried out. Formulation of traditionally used growth media was modified, and balanced composition of growth and selective components was matched in accordance with the requirements of existing standards. Given the urgency of increasing the effectiveness of the methods of control of campylobacteria in foods and the lack of domestic analogues of the culture media in the Russian Federation, an optimized method for the production of dry nutrient media for the detection, identification and storage of campylobacteria isolated from food products and clinical material was developed. The conducted study allowed to develop Technical conditions 21.20.23-006-01897222-2016 «Dry culture medium for detection of bacteria of the genus Campylobacter» and «Instruction for use of culture media». Depending on the purpose of the medium produced in the following versions: the selective broth for enrichment of campylobacteria; differential selective agar for isolating and quantifying of Campylobacter spp.; semi-solid nutrient agar for cryostorage of Campylobacter strains. The list of criteria for assessing the quality of commercially available lots of dry media included: solubility, pH, gel strength of agar, the content of amine nitrogen, specificity, selectivity, growth and inhibitory properties. The practical application of these media in terms of the national laboratories will significantly simplify the use of existing standards developed based on international ISO standards, but not adapted to the main range of commercial media and reagents used in routine food control for the presence of campylobacteria.
Keywords: bacteria of the genus Campylobacter, culture media, food products, methods of control, storage of strains
Обеспечение микробиологической безопасности пищевых продуктов должно базироваться на постоянном совершенствовании требований к проведению контроля и на повышении надежности используемых методов лабораторного анализа, в том числе на основе создания и внедрения высокочувствительных и эффективных питательных сред для выявления и идентификации наиболее значимых групп микроорганизмов. Внедрение в практику новых методов, основанных на современных научных технологиях, даст возможность осуществлять мониторинг загрязненности пищевых продуктов возбудителями пищевых инфекций и интенсифицировать применение методологии оценки микробиологического риска.
Бактерии рода Campylobacter, занимающие в настоящее время одно из ведущих мест в этиологии ин-
фекционных заболеваний с пищевым путем передачи [1], относятся к числу наиболее трудно культивируемых микроорганизмов, а потому их детекция требует использования комплексного анализа фено- и генотипических признаков, определяющих ключевые таксономические и патогенетические свойства этих патогенов.
Независимо от применяемых схем выделения и идентификации Campylobacter spp., используемые методы должны включать эффективные и достоверные способы отбора и подготовки проб для анализа, что представляется весьма важным в плане интерпретации полученных результатов. Эти способы включают выбор контрольных критических точек, поскольку убиквитарность, термотолерантность и вариабельность штаммов кампило-бактеров исключительно благоприятны для сохранения микробных популяций в процессе изготовления и хра-
нения продуктов пищевой индустрии. Принципиально важен для выделения этих патогенов выбор адекватных схем обогащения исследуемых образцов, обеспечивающих накопление возбудителя до уровня достоверной детекции.
В лабораторной диагностике кампилобактериоза наиболее трудной задачей является выделение возбудителя из пищевых продуктов в связи с массивной контаминацией их сопутствующей микрофлорой. На общем микробном фоне исследуемого субстрата количество патогенов, как правило, незначительно, поэтому их прямое культивирование невозможно, в связи с чем возникает необходимость применения специальных селективных методов обогащения для выделения и идентификации возбудителя. С этой целью используется целая гамма разнообразных избирательных питательных сред, селективных агентов и аналитических средств, учитывающих основные культурально-морфологические и биологические свойства выделяемого микроорганизма [2]. Способность кампилобактерий переходить под влиянием стрессовых воздействий в некультивируемые формы создает особенно трудные методические проблемы для получения объективной оценки степени контаминации продукции и адекватного прогнозирования пригодности используемых схем контроля.
В сравнении с другими пищевыми патогенами, такими как энтерогеморрагические E. coli или сальмонеллы, C. jejuni более чувствительны к неблагоприятным условиям внешней среды. Для роста им необходим определенный набор нутриентов, обеспечивающий заданный окислительно-восстановительный потенциал среды, и специальные микроаэрофильные условия с оптимальной температурой культивирования возбудителя не ниже 30 оС. Такие избирательные свойства теоретически не должны позволять C. jejuni выживать вне организма хозяина в природных аэробных условиях или в пищевой цепи. Однако в реальных условиях эти микроорганизмы активно персистируют во внешней среде и обнаруживаются в продуктах, воде или других объектах [3-5]. Механизм такого выживания и последующей перекрестной контаминации C. jejuni изучен недостаточно и требует проведения детальных исследований с целью снижения риска возникновения пищевых заболеваний, связанных с употреблением зараженных продуктов, особенно куриного мяса, поскольку его удельный вес в структуре питания населения очень велик.
В связи с изложенным целями исследования были:
- изучение контаминации возбудителями кампило-бактериоза пищевых продуктов, полученных на птицеперерабатывающих предприятиях при различных технологиях обработки сырья;
- оптимизация рекомендуемых методических схем выявления и видовой идентификации бактерий рода Campylobacter;
- повышение чувствительности и специфичности анализов с целью стандартизации их по отношению к официально утвержденным нормативным и методическим документам.
Материал и методы
Всего исследовано свыше 300 проб мяса птицы и полуфабрикатов (от цыплят-бройлеров, индеек и перепелов). На наличие Campylobacter spp. также исследовали смывы с оборудования предприятий.
Исследования птицепродуктов и смывов с поверхностей оборудования проводили в условиях трех отечественных птицеперерабатывающих предприятий, применяющих охлаждение тушек погружением в переохлажденную воду, а также комбинированным водно-испарительным и гидроаэрозольным способами. Для антимикробной обработки при всех вариантах использовали технологические вспомогательные средства на основе надуксусной кислоты.
В работе использовали как общепринятые куль-туральные методы посевов пищевых продуктов, так и вновь разрабатываемые или модифицированные способы выделения и количественного учета возбудителей кампилобактериоза.
Статистическую обработку результатов проводили с помощью критерия Стьюдента и непараметрического рангового критерия Манна-Уитни. Различия признавали достоверными при уровне значимости р<0,05. Расчеты проводили с помощью пакетов программ Excel и SPSS 18.0.
Результаты и обсуждение
С целью накопления статистических материалов по загрязнению Campylobacter spp. различных видов сырья, готовых продуктов и полуфабрикатов, проведены комплексные исследования, позволяющие судить о характере контаминации и распространении кампилобакте-ров на отдельных этапах производства птицепродуктов
Бактерии рода Campylobacter обнаруживали преимущественно в сырых птицепродуктах и смывах с поверхностей оборудования птицеперерабатывающих предприятий (свыше 30% положительных проб). В большинстве случаев кампилобактеры выделяли из образцов, обсемененных колиформными бактериями (свыше 60% проб) и сальмонеллами (17% проб).
Полученные данные показали, что частота контаминации сырых птицепродуктов сальмонеллами и кампило-бактериями значимо зависит от технологии охлаждения тушек (табл. 1). При использовании погружного способа создаются условия для перекрестной контаминации патогенами через воду в ваннах охлаждения (45% проб, зараженных Campylobacter spp.). При комбинированном использовании переохлажденной воды и гидроаэрозолей кампилобактерии также выявляли достаточно часто -в 27% проб. Наименьшее загрязнение патогенами было выявлено при испарительном способе охлаждения с использованием антимикробных гидроаэрозолей (менее 5% положительных проб), что позволяет признать его наиболее перспективным для производства безопасной в микробиологическом отношении продукции.
Таблица 1. Частота обнаружения патогенов в мясе птицы при разных способах охлаждения тушек
Способ охлаждения Кампилобактерии Сальмонеллы
число проб из них положительных число проб из них положительных
абс. % абс. %
Погружение в переохлажденную воду 51 23 45 42 11 26
Комбинированный (водно-воздушный, водоиспарительный) 22 6 27,2 20 1 5
Испарительный (гидроаэрозольный) 21 1 4,8 20 0 0
Получение таких данных необходимо для обоснования отраслевых критериев оценки эффективности технологий производства птицепродуктов и разработки санитарно-гигиенических мероприятий по предупреждению контаминации мяса птицы патогенами в процессе убоя и первичной переработки [6]. Эти критерии вместе с мерами, направленными на ликвидацию патогенов в птицеводческом секторе, нужны для повышения гарантии безопасности сырых мясо- и птицепродуктов, направляемых предприятиями в реализацию.
Традиционные микробиологические методы обнаружения Campylobacter в пищевых продуктах основаны на применении селективных питательных сред и специальных условий культивирования бактерий. Основные принципы этих методов регламентированы международными стандартами ISO 10272-1:2006, ISO/TS 102722:2006 и Руководством по бактериологическим методам анализа FDA (США). В Российской Федерации для контроля пищевых продуктов и расследования вспышек инфекций кампилобактериозной этиологии применяют ГОСТ ISO 10272-1-2013, ГОСТ ISO/TS 10272-2-2013, а также Методические указания 4.2.2321-08 «Методы определения бактерий рода Campylobacter в пищевых продуктах».
Процедура выделения Campylobacter из образцов пищевых продуктов включает:
• предобогащение в селективном бульоне при 37 °С в течение 4 ч в микроаэрофильных условиях (5% кислорода, 10% углекислого газа, 85% азота);
• обогащение в селективном бульоне в микроаэрофильных условиях при 42 °С в течение 18 ч;
• пересев на агаровые среды для выделения изолированных колоний, инкубирование в микроаэрофильных условиях при 42 °С в течение 24-72 ч.
Для повышения селективных свойств жидких и плотных питательных сред применяют антибиотики цефопе-разон, тейкопланин, ванкомицин, триметоприм лактат, циклогексимид, нистатин и др. в различных комбинациях. Для обеспечения ростовых свойств, нейтрализации токсического действия кислорода и света в состав большинства сред вводят стерильную дефибриниро-ванную баранью или лошадиную кровь. Поскольку использование крови в лабораториях, контролирующих пищевые продукты, вызывает затруднения, в настоящее время взамен этого компонента рекомендуют применять добавки на основе активированного угля, гематина, а также комбинации из сульфата железа, метабисульфита натрия и пирувата натрия. Для созда-
ния микроаэрофильных условий используют различные микроаэробно-генерирующие системы: газ-пакеты, СО2-инкубаторы.
Выросшие типичные или подозрительные колонии исследуют по основным морфологическим и биохимическим признакам, в том числе: окраска по Граму, подвижность, оксидазный и каталазный тесты, нитрат/ нитрит-редукция, гидролиз гиппурата, ферментация углеводов, чувствительность к антибиотикам, температура роста и др.
Применение регламентированных схем и методов детекции при проведении экспериментальных исследований по обнаружению возбудителей кампилобактериоза в пищевой продукции в 2015-2017 гг. позволило накопить и систематизировать данные о частоте выделения, характере контаминации и свойствах Campylobacter spp. [7]. Однако при выполнении запланированных работ были выявлены следующие методические проблемы:
• отсутствие отечественных аналогов зарубежных сред, селективных агентов и специальных компонентов, рекомендуемых для культивирования Campylobacter spp., что обусловливает необходимость конструирования питательных сред, подбора и оценки качества серийно выпускаемых сырьевых ингредиентов, химических реагентов, буферных систем и др.;
• недостаточная эффективность используемых ростовых веществ, ферментных систем и ингибиторных добавок, подавляющих рост сопутствующей микрофлоры, в первую очередь грамотрицательных бактерий рода Proteus;
• технические трудности обеспечения микроаэрофильных условий культивирования кампилобактеров при рутинном контроле сырья и пищевой продукции;
• отсутствие практических рекомендаций по поддержанию жизнеспособности выделенных культур Campylobacter spp. в процессе их изучения и при создании лабораторных коллекций (криобанков) этих микроорганизмов;
• дефицит отечественных аналитических средств и тест-систем для фенотипической и генетической идентификации выделяемых штаммов.
Вышеназванные недостатки лабораторной детекции Campylobacter spp. определили направления экспериментальных исследований и необходимость разработки новых подходов к отдельным этапам их практической реализации.
Существующие прототипы методов выявления кампи-лобактеров основаны на применении преимущественно
зарубежных сред: на первых двух этапах предобога-щения и обогащения посевов в качестве селективных бульонов регламентированы бульон Болтона, бульон Престона или селективные среды Дойла, Мартена или Парка. В их состав в качестве питательной основы входят мясной экстракт, ферментативные гидролизаты животных белков (мяса, казеина, лактальбумина). Для обеспечения толерантности к кислороду используют дефибринированную кровь или антиоксиданты. Для пересева на агаризованные среды используются селективные агары Престона, Кармали или угольный агар, в основу которых также входят пептон, мясной экстракт и гидролизаты казеина, дефибринированная кровь, активированный древесный уголь и аэротолерантные добавки. Специальных способов хранения и транспортирования культур кампилобактеров не предлагается, тогда как общепринятые методики криохранения и лио-филизации не всегда пригодны для Campylobacter spp., требующих особых условий для сохранения жизнеспособности этих микроорганизмов.
Подбор питательных основ и отечественных компонентов в составе селективных сред и сравнительные испытания их при культивировании различных штаммов Campylobacter spp. позволили разработать рецептуры и сконструировать состав базовых сред для накопления и выделения кампилобактерий. С целью обеспечения сохранности основных фенотипических признаков и поддержания жизнеспособности выделенных штаммов разработана модифицированная среда - полужидкий питательный агар для криохранения культур Campylobacter spp. (табл. 2).
Из широкого ассортимента селективных добавок, рекомендуемых действующими стандартами, отобраны для практического применения в комплекте с базовыми средами следующие дифференциально-диагностические компоненты (табл. 3).
Использование в составе питательной основы комплекса легко усвояемых азотистых веществ, полученных в результате гидролитического расщепления белков животного, растительного и микробного происхождения
Таблица 2. Состав разработанных базовых сред (г/дм3)
Основной компонент Жидкая селективная среда для накопления кампилобактерий Дифференциально-диагностический агар для выделения и количественного учета Campylobacter spp. Полужидкий питательный агар для криохранения культур Campylobacter spp.
Пептон мясной ферментативный 12,0 15,0 11,0
Пептон соевый ферментативный - 8,0 -
Гидролизат казеина 10,0 - 10,0
Дрожжевой экстракт 2,0 - 2,0
Э-глюкоза - 5,0 -
Агар микробиологический - 15,0 1,25
Натрия хлорид 5,0 5,0 5,0
Натрий пировинограднокислый 0,25 0,25 0,25
Натрия метабисульфит 0,25 0,25 0,25
Железо (II) сернокислое 0,25 0,25 0,25
1_-цистеина гидрохлорид 0,1 - -
Натрий углекислый - 0,5 -
Натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный 8,75 - -
Калий фосфорнокислый однозамещенный 1,4 - -
Аскорбиновая кислота - 0,75 -
Всего 40,0 50,0 30,0
Таблица 3. Селективные добавки и диагностические компоненты
Компонент Жидкая селективная среда для накопления кампилобактерий Дифференциально-диагностический агар для выделения и количественного учета Campylobacter spp. Полужидкий питательный агар для криохранения культур Campylobacter spp.
Кровь стерильная дефибринированная 50 см3/дм3 базовой среды 50 см3/дм3 базовой среды -
Глицерин стерильный - - 150 см3/850 см3 базовой среды
Полимиксина В сульфат 5000 Е 5000 Е -
Рифампицин 10 мг 10 мг -
Амфотерицин В 10 мг 10 мг -
Таблица 4. Жизнеспособность тест-культур Campylobacter jejuni в процессе хранения при низких температурах
№ тест-штаммов Длительность хранения
полужидкий агар для криохранения глицериновый бульон (контроль)
1 мес 3 мес 6 мес 9 мес 12 мес 1 мес 3 мес 6 мес 9 мес 12 мес
Температура хранения (-18±1) "С
C. jejuni NCTC 11168 ++ + + + - ++ + - - -
C. jejuni 5.2 ++ ++ + - - + - - - -
C. jejuni 17п ++ + - - - ++ + - - -
C. jejuni 7-9 ++ + - - - + - - - -
C. jejuni 39 ++ ++ - - - + -- - - -
Температура хранения (-70±2) "С
C. jejuni NCTC 11168 ++ ++ ++ + + ++ ++ + - -
C. jejuni 5.2 ++ ++ ++ ++ + ++ + - - -
C. jejuni 17п ++ ++ ++ + + ++ + - - -
C. jejuni 7-9 ++ ++ ++ + + ++ ++ + - -
C. jejuni 39 ++ ++ ++ + + ++ + + - -
П р и м е ч а н и е. «++» - наличие сливного роста тест-штамма при высеве 0,05 см3 суспензии на поверхность кровяного агара; «+» - рост отдельных колоний;«-» - отсутствие роста.
до оптимальных концентраций аминного азота, обеспечивало заданный уровень нутритивных компонентов. Включение в рецептуры дрожжевого экстракта как источника биологически активных компонентов и стимуляторов роста в сочетании с метабисульфитом натрия, сульфатом железа и пируватом натрия способствовало улучшению ростовых свойств субстратов и снижению окислительного стресса. Внесение L-цистеина и аскорбиновой кислоты обеспечивало оптимальный уровень окислительно-восстановительного потенциала среды.
С целью унификации лабораторных процедур подобран комплекс антибактериальных препаратов (полимик-сина В сульфат, рифампицин, амфотерицин В), эффективно ингибирующих рост сопутствующей микрофлоры как в накопительном бульоне, так и при пересевах на агаровую среду. Заданные концентрации антибиотиков в рецептурах предлагаемых сред обеспечивали подавление роста бактерий семейства Enterobacteriaceae, энтерококков, стафилококков, псевдомонад и протея при исходном уровне контаминации посторонней микрофлоры 102-104 КОЕ/см3.
Рекомендуемый для хранения штаммов Campylobacter spp. полужидкий питательный агар, содержащий 0,12% агара, 1,8% аминного азота и 15% глицерина, позволял сохранять жизнеспособность тест-штаммов при крио-хранении в условиях низких температур (-70±2) °С не менее 9 мес. Включение в состав полужидкого агара защитной аэротолерантной смеси (метабисульфит натрия + сульфат железа + пируват натрия) способствовало созданию улучшенных условий для поддержания физиологического статуса и ростовых свойств культур кампилобактеров (табл. 4). При этом основные фе-нотипические характеристики штаммов существенно не менялись и полностью восстанавливались после 2-3 пассажей в неселективной среде. Один из характерных признаков - подвижность - удавалось сохранить на протяжении длительного срока хранения - 9-12 мес.
Определение подвижности проводили, используя способность штаммов формировать моноколонии на поверхности 0,2% полужидкого агара при нанесении 5 мкл суспензии изолята. Посевы проводили в троекратной повторности. Различия признавали достоверными при p<0,05. Этот признак позволял судить о морфологических изменениях стареющих субпопуляций тестируемых штаммов, подтверждающих фенотипическую изменчивость выделенных культур под воздействием неблагоприятных факторов (табл. 5).
В то же время криохранение штаммов при обычных условиях в глицериновом бульоне (15% глицерина + 85% бульона Престона) сопровождалось потерей подвижности и инактивацией тестируемых культур C. jejuni после 2-3 мес наблюдений.
Учитывая сложный многокомпонентный состав субстратов для детекции кампилобактеров, с целью упрощения способа приготовления питательных сред и снижения трудоемкости баканализов разработан оптимизированный способ производства сухих питательных сред для выявления, идентификации и хранения кампилобактерий. Утверждены Технические условия 21.20.23-006-01897222-2016 «Питательные среды сухие для детекции бактерий рода Campylobacter» и Инструкция по применению вышеуказанных сред при контроле пищевой продукции и клинического материала. В перечень критериев оценки качества серийно выпускаемых партий сухих сред включены основные физико-химические и биологические показатели, в том числе растворимость, рН, прочность агарового геля, содержание амин-ного азота, специфичность, селективность, ростовые и ингибирующие свойства (табл. 6).
Сравнительные квалификационные испытания опытных серий сухих питательных сред в сопоставлении с зарубежными аналогами, зарегистрированными в Российской Федерации, показали их высокую чувствительность, воспроизводимость и практическую при-
Таблица 6. Физико-химические показатели и специфическая активность селективных сред
Таблица 5. Подвижность тест-культур Campylobacter jejuni (мм, M±m) в процессе хранения при низких температурах
№ тест-штаммов Длительность хранения
полужидкий агар для криохранения глицериновый бульон (контроль)
1 мес 3 мес 6 мес 9 мес 12 мес 1 мес 3 мес 6 мес 9 мес 12 мес
Температура хранения (-18±1) "С
C. jejuni NCTC 11168 6,3±0,4 6,0±0,5 5,5±0,0 5,5±0,0 - 6,0±0, 5,3±0,2 - - -
C. jejuni 5.2 8,5±0,5 8,0±0,5 8,0±0,4 - - 8,0±0,4 - - - -
C. jejuni 17п 9,0±0,8 7,5±0,3 - - - 9,4±0,6 8,3±0,4 - - -
C. jejuni 7-9 7,5±0,3 6,0±1,0 - - - 7,5±0,3 - - - -
C. jejuni 39 6,0±1,0 5,5±0,3 - - - 5,5±0,2 - - - -
Температура хранения (-70±2) "С
C. jejuni NCTC 11168 6,5±0,6 6,3±0,7 6,0±0,5 6,5±0,5 6,3±0,4 5,8±0,4 6,0±0,0 5,8±0,6 - -
C. jejuni 5.2 8,8±0,3 8,5±0,7 8,0±0,5 8,2±0,2 8,0±0,4 8,2±0,6 7,0±0,5 - - -
C. jejuni 17п 9,0±0,2 9,0±0,4 8,5±0,5 8,5±0,5 8,0±0,0 9,0±0,2 8,0±0,2 - - -
C. jejuni 7-9 7,5±0,5 7,5±0,0 7,0±0,8 7,5±0,3 7,5±0,0 6,5±0,3 6,5±0,5 5,5±0,0 - -
C. jejuni 39 6,0±0,5 н/д 6,0±1,0 н/д 5,5±0,5 6,0±1,0 н/д 5,3±0,4 - -
Показатель Жидкая селективная среда для накопления кампилобактерий Дифференциально-диагностический агар для выделения и количественного учета Campylobacter spp.
Внешний вид, цвет Мелкодисперсный гигроскопичный порошок серовато-бежевого цвета
Растворимость Растворяется при кипячении в течение 3 мин
рН 7,0±0,2 7,2±0,2
Массовая доля влаги, %, не более 7,0 7,0
Массовая доля аминного азота, %, не менее 1,8 2,0
Прочность агарового геля, г/см2 - Не менее 350
Прозрачность и цветность Готовая среда должна быть прозрачной, светло-соломенного цвета, после добавления крови - темно-красного цвета
Чувствительность среды и стабильность основных биологических свойств тест-штаммов Характеристика роста тест-штаммов через 48±2 ч инкубации в микроаэрофильных условиях (1\12 - 85%, С02 - 10%, 02 - 5%) при температуре 41,5±0,5 °С
Campylobacter jejuni NCTC 11168 C. coli Среда должна обеспечивать рост в виде гомогенного помутнения при посеве 0,1 см3 микробной взвеси тест-штаммов из разведения 10-5-:-10-6. Среда должна обеспечивать рост при посеве 0,1 см3 микробной взвеси тест-штаммов из разведения 10-6-:-10-7.. C. jejuni и C. coli образуют мелкие округлые колонии, полупрозрачные с серым оттенком, гладкие, влажные, иногда матовые или восковидные, зоны гемолиза должны отсутствовать
Ингибирующие свойства Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Proteus vulgaris Staphylococcus aureus При посеве 0,1 см3 микробной взвеси тест-штаммов должен подавляться рост тест-штаммов из разведения 10-2-:-10-3 При посеве 0,1 см3 микробной взвеси тест-штаммов должен подавляться их рост из разведения 10-3-:-10-4. При более высоких концентрациях устойчивые штаммы могут формировать нетипичные для Campylobacter непрозрачные колонии белого или желтого цвета, в том числе с зоной гемолиза
годность для проведения контроля различных объектов для выявления и количественного определения бактерий рода Campylobacter. В зависимости от назначения среды вырабатывают в следующих вариантах: жидкая селективная среда для накопления кампилобактерий; дифференциально-диагностический агар для выделения и количественного учета Campylobacter spp.; полужидкий питательный агар для криохранения культур Campylobacter spp.
Заключение
С целью повышения эффективности выделения бактерий рода Campylobacter из различных объектов
и оптимизации режимов хранения выделенных штаммов были модифицированы рецептуры традиционно используемых питательных сред и подобран сбалансированный состав ростовых и селективных компонентов. Разработаны и утверждены Технические условия 21.20.23-006-01897222-2016 «Питательные среды сухие для детекции бактерий рода Campylobacter». Практическое применение этих сред в условиях отечественных лабораторий позволит существенно упростить использование действующих ГОСТов, разработанных на основе международных стандартов ISO, но не адаптированных к основному ассортименту коммерческих сред и реактивов, применяемых при рутинном контроле пищевых продуктов на наличие кампилобактерий.
Результаты исследований по оптимизации состава питательных сред и адаптации методических схем анализа для выявления и видовой идентификации бактерий рода Campylobacter включены в разработанные «Методические указания по определению в пищевой
продукции возбудителей кампилобактериоза и оценке их антибиотикорезистентности» (2017 г).
Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 15-16-00015).
Сведения об авторах
ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва):
Ефимочкина Наталья Рамазановна - доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории биобезопасности и анализа нутримикробиома E-mail: karlikanova@ion.ru
Пичугина Татьяна Викторовна - кандидат технических наук, научный сотрудник лаборатории биобезопасности и анализа нутримикробиома E-mail: bbtvp@ion.ru
Стеценко Валентина Валерьевна - аспирант E-mail: stetsenko_valentina1992@mail.ru
Быкова Ирина Борисовна - научный сотрудник лаборатории биобезопасности и анализа нутримикробиома E-mail: bykova@ion.ru
Маркова Юлия Михайловна - научный сотрудник лаборатории биобезопасности и анализа нутримикробиома E-mail: yulia.markova.ion@gmail.com
Короткевич Юлия Владимировна - младший научный сотрудник лаборатории биобезопасности и анализа нутри-микробиома
E-mail: ulya_korotkevich@mail.ru
Полянина Анна Сергеевна - лаборант-исследователь лаборатории биобезопасности и анализа нутримикробиома E-mail: polyanina.anna.sergeevna@gmail.com
Шевелева Светлана Анатольевна - доктор медицинских наук, заведующая лабораторией биобезопасности и анализа нутримикробиома E-mail: sheveleva@ion.ru
Литература
1. World Health Organization. WHO estimates of the global burden 5. of foodborne diseases: foodborne disease burden epidemiology reference group 2007-2015. URL: www.who.int
2. Ефимочкина Н.Р. Оценка роли бактерий рода Campylobacter в воз- 6. никновении пищевых токсикоинфекций и современные методы обнаружения возбудителя // Вопр. питания. 2015. № 6. С. 5-18.
3. Булахов А.В., Ефимочкина Н.Р., Шевелева С.А. Обнаружение бактерий рода Campylobacter в птицепродуктах с помощью метода полимеразной цепной реакции // Вопр. питания. 2010. Т. 79, № 3. 7. С. 24-29.
4. Humphrey T., O'Brien S., Madsen M. Campylobacters as zoonotic pathogens: a food production perspective // Int. J. Food Microbiol. 2007. Vol. 117, N 3. P. 237-257.
Guerin M.T., Sir C., Sargeant J.M. et al. The change in prevalence of Campylobacter on chicken cascasses during processing: a systematic review // Poult. Sci. 2010. Vol. 89. P. 1070-1084. Шевелева С.А., Ефимочкина Н.Р., Козак С.С., Минаева Л.П., Быкова И.Б., Пичугина Т.В. и др. Влияние традиционных технологий охлаждения на профиль патогенных микробных контаминантов мяса птицы отечественного производства // Вопр. питания. 2016. Т. 85, № S2. С. 38.
Ефимочкина Н.Р., Быкова И.Б., Стеценко В.В., Минаева Л.П., Пичугина Т.В., Маркова Ю.М. и др. Изучение характера контаминации и уровней содержания бактерий рода Campylobacter в отдельных видах пищевой продукции // Вопр. питания. 2016. Т. 85, 5. С. 52-59.
References
World Health Organization. WHO estimates of the global burden of foodborne diseases: foodborne disease burden epidemiology reference group 2007-2015. URL: www.who.int. Efimochkina N.R. Evaluation of the role of Campylobacter spp. in the occurrence of foodborne diseases and modern methods to detect the pathogen. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2015; 84 (6): 4-17. (in Russian)
Bulakhov A.V., Efimochkina N.R., Sheveleva S.A. Detection of bacteria of genus Campylobacter in poultry products using PCR assay. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2010; 79 (3): 24-9. (in Russian) Humphrey T., O'Brien S., Madsen M. Campylobacters as zoonotic pathogens: a food production perspective. Int J Food Microbiol. 2007; 117 (3): 237-57.
Guerin M.T., Sir C., Sargeant J.M., et al. The change in prevalence of Campylobacter on chicken cascasses during processing: a systematic review. Poult Sci. 2010; 89: 1070-84. Sheveleva S.A., Efimochkina N.R., Kozak S.S., Minaeva L.P., Byko-va I.B., Pichugina T.V., et al. The Influence of traditional technologies of the chilling of chicken carcasses on the profile of pathogenic micro-bial contaminants in poultry meat of domestic production. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2016; 85 (S2): 38. (in Russian) Efimochkina N.R., Bykova I.B., Stetsenko V.V., Minaeva L.P., Pichugina T.V., Markova Yu.M., et al. Study of the contamination and the levels of Campylobacter spp. during the processing of selected types of food. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2016; 85 (5): 52-9. (in Russian)
5
2
6
3
7.
