CC BY
23
Для корреспонденции
Ефимочкина Наталья Рамазановна - доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории биобезопасности и анализа нутримикробиома ФГБНУ «НИИ питания» Адрес: 109240, г. Москва, Устьинский проезд, д. 2/14 Телефон: (495) 698-53-83 E-mail: karlikanova@ion.ru
Н.Р. Ефимочкина, И.Б. Быкова, Ю.М. Маркова, Ю.В. Короткевич, С.А. Шевелева
Влияние технологических стрессовых факторов на экспрессию генов патогенности возбудителей пищевого кампилобактериоза Campylobacter jejuni
#
The study of influence of stresses on virulence genes expression in foodborne pathogens Campylobacter jejuni
N.R. Efimochkina, I.B. Bykova, Yu.M. Markova, Yu.V. Korotkevich, S.A. Sheveleva
ФГБНУ «НИИ питания», Москва Institute of Nutrition, Moscow
Изучение на генетическом и метаболическом уровнях ответов на холодовое воздействие Campylobacter jejuni - одного из наиболее распространенных возбудителей пищевых токсикоинфекций - имеет важное значение для выяснения механизмов приобретения продуктами, загрязненными кампилобактериями, опасных свойств, эти данные также необходимы для создания эффективных систем микробиологического контроля на всех этапах производства и хранения пищевых продуктов. Проведен подбор 5 пар олигонуклеотидных праймеров для выявления экспрессии генов cadF, cdtB, ciaB, flaA, iamA, кодирующих основные факторы патогенности бактерий С. jejuni -способность к адгезии и инвазии эпителиальных клеток, продукции CDT-токсина и подвижности. Для количественной оценки уровней экспрессии целевых генов C. jejuni разработан сравнительный метод определения количества продуктов амплификации генов, кодирующих факторы патогенности Campylobacter spp, с использованием полиме-разной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени с интеркалирую -щими красителями. Для расчета и количественной оценки экспрессии генов получены математические модели, позволяющие проводить экстраполяцию значений пороговых циклов амплификации к исходному числу копий РНК/ДНК в тестируемых пробах. Установлено, что экспозиция бактерий C. jejuni под воздействием низких температур на уровне +4 °С не приводила к увеличению уровней экспрессии генов cdtB и tiaB. Однако в популяциях C. jejuni, подвергнутых замораживанию с последующей инкубацией при оптимальной для данного патогена температуре +42 °С, происходит усиление экспрессии мРНК, кодирующих синтез белковой субъединицы В цитолетального токсина и антигенных маркеров факторов инвазии этого возбудителя. Количество копий РНК у бактерий C. jejuni после стрессового воздействия увеличивалось на 1,14-2,6 логарифмических порядка в сравнении с интактными культурами. Экспрессия генов cdtB и tiaB у C. jejuni может служить индикатором клеточного ответа на стресс и способствует восстановлению функций бактериальной клетки
66
после прекращения холодового воздействия и возвращения возбудителя в условия, благоприятные для реализации его патогенного потенциала.
Ключевые слова: Campylobacter jejuni, стрессовые воздействия, факторы патогенности, экспрессия генов, устойчивость, количественная ОТ-ПЦР с флуоресцентно-гибриди-зационной детекцией
The study of the responses to cold exposure in Campylobacter jejuni (C. jejuni) -one of the most common foodborne pathogens is important for elucidating the mechanisms of acquisition of products contaminated with campylobacter, hazardous properties. These data are also necessary to create effective systems of microbiological controls at all stages of production and storage of food. 5 pairs of oligonucleotide primers were selected for detecting of genes cadF, cdtB, ciaB, flaA, iamA, encoding the main factors of pathogenicity of foodborne pathogens Campylobacter jejuni - adhesion and invasion of epithelial cells, production of CDT-toxin and mobility. To quantify the expression levels of target genes of C. jejuni a comparative method of determining the amount of amplification products of genes encoding pathogenicity factors of Campylobacter spp. has been developed using real-time PCR with intercalating dyes. To calculate and quantify gene expression the mathematical models have been obtained that allow extrapolation of threshold cycles of amplification to the initial number of copies of RNA/DNA in the tested samples. It has been established that exposure of C. jejuni at low temperatures +4 °C did not lead to increased levels of expression of genes cdtB and ciaB. However, in the populations of C. jejuni subjected to freezing, followed by incubation at optimum for the pathogen temperature of +42 °C, the increase in expression of mRNA encoding protein subunit B of CDT-toxin and antigenic marker of invasion took place. The number of copies of RNA in C. jejuni after stress exposure increased by 1.14-2.6 lg in comparison with intact cultures. CdtB and ciaB gene expression in C. jejuni can serve as an indicator of cell response to stress and helps to restore the functions of the bacterial cells after the termination of cold exposure and return of the pathogen in conditions favourable to the realization of its pathogenic potential.
Keywords: Campylobacter jejuni, stresses, virulence factors, gene expression, tolerance, reverse transcription quantitative Rti-PCR
Жизнедеятельность микроорганизмов в той или иной экологической нише непосредственно связана с генетически закрепленной способностью включать регуляторные системы изменчивости на разных стадиях развития микробной клетки. Перестройка популяционных структур патогенов в условиях окружающей среды существенно отличается от характера персистенции возбудителя в клеточных системах макроорганизма при различных пищевых инфекциях, что требует углубленного изучения биохимических и генетических аспектов этой проблемы.
Наиболее признанной в настоящее время теорией возникновения новых свойств и генетических систем, регулирующих баланс микробных популяций и экспрессию факторов патогенности, является концепция стрессовых ответов микроорганизмов на химические, физические и биологические воздействия.
С учетом многообразия свойств микробных популяций, фенотипического полиморфизма кон-таминантов пищи, изменения традиционных технологий переработки сырья и способов хранения готовой продукции возникает необходимость углубленного изучения наиболее значимых стрессовых воздействий, обусловливающих деструкцию микроорганизмов или формирование толерантности к неблагоприятным условиям среды.
Изменения метаболических профилей пищевых патогенов в результате экспрессии генов патогенности (токсинов, инвазинов, адгезинов, мембраноразрушающих ферментов и др.) носят адаптивный характер и во многом зависят от физико-химических свойств пищевых субстратов и технологических параметров производства. Изучение механизмов формирования стрессовой толерантности патогенов позволяет прогнозировать интенсивность размножения бактериальных
67
#
популяций в пище, оценивать способность возбудителей к преодолению защитных барьеров макроорганизма и, соответственно, степень риска, связанную с применением новых видов технологических воздействий при изготовлении пищевых продуктов.
В процессе производства и хранения пищевых продуктов микроорганизмы подвергаются разнообразным внешним воздействиям, формируя соответствующие стрессовые ответы как на уровне повреждения клеточных оболочек, так и путем изменений ДНК, мембран и энзимов микробной клетки. Наиболее сильным стрессом считают нагревание, которое не только влияет на термотолерантность, но и может вызывать устойчивость к другим стрессовым факторам. Под влиянием низких температур в пищевых продуктах у бактерий также может возникать стрессовый ответ; такие воздействия могут варьировать от сравнительно мягких режимов до экстремальных, выживание при которых требует наличия ряда белков холодового шока [1, 2].
Изучение на генетическом и метаболическом уровнях ответов на холодовое воздействие Campylobacter jejuni - одного из наиболее распространенных возбудителей пищевых токсикоинфек-ций - имеет важное значение для выяснения механизмов приобретения продуктами, загрязненными кампилобактериями, опасных свойств, эти данные также необходимы для создания эффективных систем микробиологического контроля на всех этапах производства и хранения пищевых продуктов. Бактерии C. jejuni обладают несколькими факторами вирулентности, которые определяются такими свойствами возбудителя, как хемотаксис и подвижность, адгезия и инвазия, наличие гли-козилирующих систем, продукция цитолетального токсина CDT, капсулообразование, образование липоолигосахаридов [3-5].
При охлаждении происходят изменения в уровне экспрессии различных генов C. jejuni - появляются мембранные белки с массой более 70 кД, не экспрессируемые при температуре 37 °С, наблюдаются изменения микро- и макроморфологии клеток, когда форма меняется со спиралевидной на кокковидную, уменьшается размер жгутиков. Ж.Н. Шурышевой в 2007 г. [6] было показано, что C. jejuni из птицепродуктов формируют колонии разного морфотипа (S или R) в зависимости от источника выделения - замороженного или охлажденного мяса кур соответственно. Поскольку микробный полиморфизм является одним из механизмов выживаемости микробов с паразитическими свойствами, это можно расценивать как звено в механизме сохранения возбудителя при ухудшении условий обитания.
В целом признается, что C. jejuni способны длительное время находиться при охлаждении
в живом состоянии в высоких концентрациях. Описанные отличия кампилобактеров от других пищевых патогенов и выраженная способность к полиморфизму позволяют им устоять против целого ряда мер, направленных на снижение микробного загрязнения в процессе производства пищевых продуктов. Это подтверждается в условиях предприятий по переработке птицепродуктов, где все технологические процессы происходят при низких температурах.
Практическое значение исследований по данной проблеме состоит в возможности создания более эффективных систем микробиологического контроля на всех этапах производства и хранения пищевых продуктов, а также внедрения предупредительных мер для снижения риска контаминации продуктов наиболее опасными возбудителями пищевых токсикоинфекций C. jejuni.
В связи с изложенным целью данной работы являлось изучение влияния температурных стрессовых воздействий на экспрессию генов - регуляторов транскрипции и генов, кодирующих признаки патогенности у C. jejuni.
В качестве мишеней были выбраны 5 генов, участвующих в патогенезе кампилобактерий: cadF - кодирует поверхностный мембранный фибронектин-связывающий белок, обусловливает адгезию и колонизацию C. jejuni, cdtB - синтез субъединицы В цитолетального токсина, ciaB и iamA - генные маркеры инвазивности возбудителя, flaA - синтез флагеллинов (подвижность). Выбранные генные детерминанты патогенности термотолерантных кампилобактеров были использованы в данной работе для изучения физиологических свойств штаммов C. jejuni, выделенных из сырых птице-продуктов методами полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) в реальном времени.
Материал и методы
В работе использованы 9 штаммов кампилобактерий, выделенных из охлажденных и замороженных птицепродуктов. Культуры были идентифицированы как C. jejuni, в том числе C. jejuni ssp. jejuni 1, C. jejuni ssp. jejuni 2, C. jejuni ssp. doylei (табл. 1).
Для изучения воздействия низких температур на уровни экспрессии различных факторов патогенности у штаммов C. jejuni использовали два температурных режима хранения: охлаждение до +4±1 °С и замораживание до -18±1 °С. Бульонную культуру C. jejuni вносили в пищевой продукт (куриное филе, куриный фарш) в соотношении 1:9, после чего зараженные субстраты термо-статировали в микроаэрофильных условиях при 42 °С в течение 2 ч. Плотность популяции микро-
68
организмов в исследуемых пробах составляла 106-107 КОЕ/см3 (г). Далее тестируемые образцы быстро охлаждали до температур +4±1 и -18±1 °С; длительность воздействия составляла 2,5-4 ч. В качестве контроля использовали зараженные образцы, которые хранили при комнатной температуре (20±2 °С), а также исходную бульонную культуру.
Охлажденные до +4 °С пробы экстрагировали сразу после выдержки, замороженные образцы помещали в термостат и прогревали до +42 °С. Куриный фарш до экстракции центрифугировали при 1000 об/мин в течение 5 мин, для экстракции использовали супернатант.
По окончании обработки проводили экстракцию нуклеиновых кислот с использованием автоматизированной станции «NucliSens easyMag» («БиоМерье», Франция) и наборов для экстракции («РИБО-преп», РФ). Очищенные пробы РНК/ ДНК после тщательного перемешивания делили на две части, с одной из которых ставили реакцию обратной транскрипции (ОТ) (30 мин при 37 °С, наборы «Реверта-L»), далее полученные пробы кДНК тестировали параллельно с экстрактами, содержащими интактную ДНК (без ОТ), методом ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) - вариант 1. Аналогичной процедуре подвергали культуры C. jejuni и зараженный фарш, выдержанные при комнатной температуре +20 °С, - вариант 2. В 3-м варианте эксперимента тестировали культуры C. jejuni и искусственно зараженные пищевые субстраты, подвергнутые замораживанию до -18 °С с последующим прогревом до +42 °С. Амплификацию проводили на приборе «ABI PRISM 7500 RealTime PCR» («Applied Biosystems», США).
Полученные экстракты использовали для проведения сравнительных исследований уровней экспрессии генов, кодирующих основные факторы патогенности C. jejuni.
Для изучения выбранных генов-мишеней cadF, cdtB, ciaB, flaA, iamA был проведен подбор 5 пар олигонуклеотидных праймеров [7-12]. Олигонук-леотидные последовательности для ПЦР-детекции вышеуказанных генов приведены в табл. 2. В работе также использовали видоспецифическую для C. jejuni последовательность в области 16S рРНК [13, 14].
Для проведения амплификации вышеуказанных генов методом ПЦР были подобраны составы реакционных смесей и разработана программа амплификации (табл. 3).
Для постановки ПЦР использовали реакционную смесь qPCRmix-HS SYBR+ROX («Евроген», РФ), содержащую высокопроцессивную Taq ДНК-по-лимеразу со специфическими моноклональными антителами, интеркалирующий краситель SYBR Green I, референсный краситель ROX, смесь нук-леотидтрифосфатов, Mg2+, реакционный буфер.
Таблица 1. Штаммы Campylobacter spp., выделенные из сырых птицепродуктов
Штамм Вид Продукт
П1 С. jejuni ssp. doylei Печень куриная охлажденная
П4 С. jejuni ssp. doylei Печень куриная охлажденная
П7 С. jejuni ssp. doylei Печень куриная замороженная
П8 С. jejuni ssp. doylei Печень куриная замороженная
К2 С. jejuni ssp. jejuni2 Курица охлажденная
КЗ С. jejuni ssp. jejuni 2 Курица замороженная
К4 С. jejuni ssp. doylei Курица замороженная
K5 С. jejuni ssp. jejuni2 Курица замороженная
K53 С. jejuni ssp. jejuni2 Курица охлажденная
Таблица 2. Олигонуклеотидные праймеры
Целевой ген Олигонуклеотидные последовательности 5'^3'
cadF TGG AGG GTA ATT TAG ATA TG
CTA ATA CCT AAA GTT GAA AC
cdtB GTT AAA ATC CCC TGC TAT CAA CCA
GTT GGC ACT TGG AAT TTG CAA GGC
ciaB CAG CTT CTT GCC AAG CTT TT
TTG TGA GCG AAG CTA TGG TG
flaA CAA GAC CTG TTC CAA CTG AAG
CTA TGG ATG AGC AAT TTA AAA T
iamA GCA CAA AAT ATA TCA TTA CAA
TTC ACG ACT ACT ATG AGG
16S рРНК TCC TAC GGG AGG CAG CAG T
GGA CTA CCA GGG TAT CTA ATC CTG TT
Таблица 3. Программа амплификации генов C. jejuni методом полимеразной цепной реакции
Целевой ген Температура, длительность и количество циклов амплификации Размер ампликонов, bp
cadF 95 °С - 5 мин (95 °С 10 с, 58 °С 10 с, 72 °С 30 с) х 40 циклов 396
cdtB 95 °С - 5 мин (95 °С 10 с, 59 °С 10 с, 72 °С 30 с) х 40 циклов 495
ciaB 95 °С - 5 мин, (95 °С 10 с, 58 °С 10 с, 72 °С 30 с) х 40 циклов 240
flaA 95 °С - 5 мин (95 °С 10 с, 52 °С 10 с, 72 °С 30 с) х 40 циклов 620
iamA 95 °С - 5 мин (95 °С 10 с, 55 °С 10 с, 72 °С 30 с) х 40 циклов 515
16SрРНК 95 °С - 5 мин, (95 °С 10 с, 62 °С 10 с, 72 °С 30 с) х 40 циклов 466
69
Таблица 4. Состав реакционной смеси для проведения полиме-разной цепной реакции (мкл)
Компонент ОТ-ПЦР ПЦР
Вода, очищенная от нуклеаз N* х 14 N х 17
Праймер Р N х 1 N х 1
Праймер Я N х 1 N х 1
5xqPCRm¡x-HS SYBR+ROX N х 5 N х 5
Образец ДНК 4 1
Общий объем реакционной смеси (в 1 пробирке) 25 25
* - N = (число исследуемых проб + контроли + 1).
Пассивный референсный краситель ROX обеспечивает нормирование сигналов репортерной флуоресценции, что позволяет корректировать флуктуацию сигналов между пробами в пределах эксперимента. Состав смесей для постановки ПЦР и ОТ-ПЦР приведен в табл. 4.
Верификацию олигонуклеотидных праймеров и выбранных программ термоциклирования проводили с использованием тест-штаммов C. jejuni методом ПЦР с выявлением ампликонов электро-форетической детекцией в агарозном геле.
Результаты
Для количественной оценки уровней экспрессии выбранных целевых генов C. jejuni при выполнении экспериментальных исследований был разработан сравнительный метод определения продуктов амплификации генов - регуляторов транскрипции и генов, кодирующих факторы патогенности Campylobacter spp., с использованием ПЦР в реальном времени с флуоресцентно-гибридизацион-ной детекцией, c учетом рекомендаций K.J. Livak, T.D. Schmittgen (2001) [15].
На первом этапе для получения сравнительных количественных зависимостей проводили постановку ПЦР, используя последовательный ряд де-
сятикратных разведений штаммов C. jejuni с предварительно рассчитанной концентрацией живых клеток (КОЕ/мл) в исходной суспензии. Ориентировочную оценку исходного числа копий ампли-фицируемых фрагментов ДНК в исследуемых пробах получали на основании анализа результатов амплификации ДНК, которые регистрировали по каналу флуоресценции FAM/Green. Полученные данные, представленные в виде кривых накопления флуоресцентного сигнала (ARn), анализировали с помощью программного обеспечения системы «ABI PRISM 7500 RealTime PCR». Результаты интерпретировали по наличию (или отсутствию) пересечения кривой флуоресценции с установленной на заданном уровне пороговой линией, что соответствовало наличию (или отсутствию) значения порогового цикла Ct.
Значение Ct для положительных проб, содержащих РНК или ДНК C. jejuni, в данной работе было установлено эмпирически на уровне 38-40 (по завершении термоциклирования); увеличение числа циклов амплификации до 45 не приводило к появлению соответствующих кривых накопления флуоресцентного сигнала, или характер флуоресценции не позволял оценивать полученные результаты как достоверные. Исходя из этого отрицательными считали пробы при отсутствии сигнала флуоресценции (neg) или при значениях Ct кривой амплификации более 38. Значения пороговых циклов для ряда разведений тест-штаммов в десятикратно убывающих концентрациях приведены в табл. 5.
Анализ полученных количественных зависимостей значений Ct для использованных генов-мишеней определил направленность дальнейших исследований: в качестве наиболее перспективных объектов детекции были выбраны геномные последовательности cdtB и ciaB, кодирующие продукцию основного токсического белка C. jejuni и факторы инвазии возбудителя.
Характер кривых накопления ампликонов для генов cadF, flaA, iamA свидетельствовал о пригодности этих мишеней для целей детекции C. jejuni,
Таблица 5. Пороговые циклы кривых роста флуоресценции продуктов полимеразной цепной реакции фрагментов cadF, cdtB, ciaB, flaA, iamA и 16S рРНК C. jejuni
Количество бактериальных клеток, КОЕ/мл Средние значения С для генов (n=4)
cadF cdtB ciaB flaA iamA 16SрРНК
Бульонная культура («109) 27,1 17,3 8,3 27,9 Нет данных 10,5
108 31,6 18,9 11,7 33,4 29,7 13,9
107 37,1 21,5 14,8 34,8 32,0 15.1
106 39,8 23,0 18,4 37,7 33,8 17,9
105 - 25,4 21,5 39,5 35,3 21,0
104 - 28,3 25,3 37,7 39,9 24,7
103 - 31,8 28,1 - - 27,3
102 - 35,9 Нет данных - - 28,1
однако не давал возможности для экстраполяции результатов от числа бактериальных клеток к концентрации целевых нуклеиновых кислот в исследуемой пробе. При постановке ОТ-ПЦР с целевыми генами cadF, flaA, iamA были получены те же закономерности скорости накопления флуоресцентного сигнала.
Для экстраполяции значений Ct к исходному числу копий РНК/ДНК в пробах учитывали экспоненциальную зависимость, используемую для расчета теоретической концентрации ампликонов при многократном повторении температурного цикла, которая выражается как:
Xn=X0x2n, (1)
где X0 - стартовое количество ДНК-мишени, Xn -концентрация ампликонов после n циклов.
При этом концентрация копий рассчитывается следующим образом:
RT=AxX0kx(1+Ek)ak, (2)
где RT - пороговое значение флуоресценции, А -константа (коэффициент пропорциональности), k -исследуемый образец.
С учетом зависимостей, полученных при тестировании десятикратных разведений суспензий штаммов C. jejuni, скорость накопления ампликонов в ходе ПЦР при тестировании целевого гена cdtB оценивали в соответствии с формулой (3):
а=-2,6441дКОЕ+34,355. (3)
Скорость накопления ампликонов при тестировании целевого гена ciaB оценивали в соответствии с формулой (4):
Ct=-2,589lgWDE+39,504. (4)
♦ cdtB □ciaB A16S рРНК
Рис. 1. Значения Ct суточных бульонных культур C. jejuni и их десятикратных разведений
Для определения количества копий исследуемых генов и нормализации значений относительно числа исходных бактериальных клеток использовали фрагмент хромосомной последовательности 16S рРНК (рис. 1).
Значения Ct, полученные для cdtB и ciaB методом ПЦР без ОТ, использовали в качестве базовых величин для выявления относительной экспрессии генов непосредственно по концентрации мРНК в клетках и сравнительной оценки количества транскриптов кДНК в контрольных и опытных образцах C. jejuni, а также в экспериментально зараженных ими пробах пищевых продуктов.
Результаты амплификации фрагментов сdtB и daB, кодирующих продукцию цитолетального токсина и факторы инвазии C. jejuni, а также последовательности 16S рРНК в исследуемых пробах, подвергнутых различным температурным воздействиям, приведены в табл. 6-8.
Таблица 6. Значения Ct-кривых флуоресценции полимеразной цепной реакции с праймерами к гену cdtB
Объект исследования ОТ-ПЦР ПЦР
вариант 1 +4 оС вариант 2 +20 оС вариант 3 -18 оС/+42 оС вариант 1 +4 оС вариант 2 +20 оС вариант 3 -18 оС/+42 оС
C. jejuni К53 17,26 16,71 14,98 27,57 26,20 20,95
C. jejuni К5 21,82 15,34 7,26 23,45 18,81 16,20
C jejuni К2 26,37 22,68 14,87 27,33 15,85 26,91
М±m 21,8±2,6 18,2±2,3 12,4±2,6 26,1 ±1,3 20,3±3,1 21,4±3,1
Фарш + C. jejuni К53 14,98 20,95 6,43 17,57 16,20 17,31
Фарш + C. jejuni К5 27,73 26,18 19,87 19,89 19,69 26,18
Фарш + C. jejuni K2 27,98 27,97 - 23,59 23,64 -
М±m 23,6±4,3 25,0±2,1 13,2±6,8 20,4±1,8 19,8±2,1 21,7±1,2
71
Таблица 7. Значения Ct-кривых флуоресценции полимеразной цепной реакции с праймерами к гену rnB
Объект исследования ОТ-ПЦР ПЦР
вариант 1 +4 оС вариант 2 +20 оС вариант 3 -18 оС/+42 оС вариант 1 +4 оС вариант 2 +20 оС вариант 3 -18 оС/+42 оС
C. jejuni К53 22,8 19,2 13,11 18,72 16,71 15,56
C. jejuni К5 27,86 23,25 18,64 22,63 19,82 21,03
C. jejuni К2 17,91 17,60 - 18,83 14,99 -
М±m 22,9±2,9 20,0±1,7 15,9±2,8 20,1 ±1,3 17,4±2,0 18,3±2,7
Фарш + C. jejuni К53 22,52 19,53 18,83 18,86 16,0 21,84
Фарш + C. jejuni К5 26,86 24,61 21,19 22,53 19,90 25,78
Фарш + C. jejuni K2 22,32 36,43 - 18,87 15,33 -
М±m 23,9±1,5 26,9±5,0 20,0±1,2 20,1 ±1,2 17,1 ±1,4 23,8±2,0
Таблица 8. Значения Ct-кривых флуоресценции полимеразной цепной реакции с праймерами 16S рРНК
#
Объект исследования ОТ-ПЦР ПЦР
вариант 1 +4 оС вариант 2 +20 оС вариант 3 -18 оС/+42 оС вариант 1 +4 оС вариант 2 +20 оС вариант 3 -18 оС/+42 оС
C. jejuni К53 10,57 11,94 11,23 15,23 15,26 19,24
C. jejuni К5 24,54 9,57 19,98 9,75 14,14 12,68
C. jejuni К2 21,77 20,74 11,56 18,91 25,84 17,43
М±m 19,0±4,3 14,1±3,4 14,9±0,5 14,6±2,7 18,4±3,7 16,5±2,0
Фарш + C. jejuni К53 18,77 18,59 25,35 20,18 18,99 17,43
Фарш + C. jejuni К5 24,51 24,65 22,19 neg (>40) 16,55 36,78
Фарш + C. jejuni K2 24,88 23,77 - 21,20 neg (>40) -
М±m 22,7±2,0 24,2±0,4 23,8±2,4 27,1±6,4 25,2±7,4 27,1±9,7
Ф
Обсуждение
Известно, что стрессовый ответ Campylobacter spp. на охлаждение не идентичен таковому у других пищевых патогенов, таких как сальмонеллы и E. coli, и не сопровождается выработкой белков теплового шока, в связи с чем охлажденные клетки кампилобактерий не становятся термотолерантными. У C. jejuni также не найдены белки холо-дового шока, что частично объясняет их неспособность расти ниже 30 °С. Известно, что разные виды Campylobacter spp. обладают разными профилями выживаемости при низких температурах, но механизм адаптации к этим факторам остается неизвест ным [16]. В то же время установлено, что при низких температурах C. jejuni проявляют значительную метаболическую активность, в том числе способны к синтезу некоторых белков и хемотаксису. При 4 °С неоднократно фиксировали увеличение плотности популяции на 0,5-1,0lg, хотя это может свидетельствовать не столько о способности C. jejuni расти при охлаждении, сколько об осуществлении перехода
72
между жизнеспособным культивируемым и некуль-тивируемым состоянием [16].
Полученные в данной работе результаты показали, что в большинстве случаев культуры C. jejuni после охлаждения не экспрессировали факторы патогенности, кодируемые генами сdtB и daB, в сравнении с культурами, хранившимися при +20 °С. Полученные средние значения Ct после обратной транскрипции РНК в ДНК свидетельствуют о том, что количество исходных копий мРНК в подвергнутых холодовому шоку бактериальных суспензиях было на 10-20% ниже, чем в пробах, инкубированных при комнатной температуре. Эта закономерность наблюдалась как для чистых культур C. jejuni, так и при тестировании образцов сырого куриного фарша, экспериментально зараженного тест-штаммами в соответствующих концентрациях. Выявленные количественные различия по числу амплифицированных копий фрагментов генов сdtB и daB в охлажденных и неохлажденных образцах, по всей вероятности, были связаны с угнетением основных физиологических функций кампилобак-
терий под действием холодового шока и увеличением времени генерации исследуемых популяций.
В случае тестирования нуклеиновых кислот опытных и контрольных проб по фрагменту хромосомной последовательности 16S рРНК однозначной тенденции не выявлено, различия по числу копий РНК в охлажденных и контрольных пробах находились в пределах статистических колебаний и рассматривались как недостоверные. Следует отметить, что полученные данные подтвердили пригодность использования геномной последовательности 16S рРНК в качестве внутреннего контроля для постановки количественной ПЦР при исследовании C. jejuni.
В целом анализ полученных результатов позволил заключить, что экспозиция жизнеспособных клеток C. jejuni под воздействием неблагоприятных для данного вида бактерий низких температур на уровне +4 оС приводит к снижению уровней экспрессии токсических белковых субъединиц CdtB и факторов инвазии, кодируемых геном ciaB.
Анализ данных, полученных в 3-м варианте эксперимента (замораживание и прогрев до +42 оС проб суспензий C. jejuni и контаминированных образцов продукта), позволил выявить иной характер изменений интенсивности накопления транскриптов. Сопоставление значений Ct в амплифицированных пробах в вариантах ОТ-ПЦР и прямой ПЦР показало, что в популяциях C. jejuni, инкубированных при оптимальных для данного патогена температурах после воздействия холодового шока, происходит усиление экспрессии процессов транскрипции и синтеза белковых метаболитов, кодируемых генами cdtB и ciaB. Различия в количестве циклов для cdtB составили 8,8, для ciaB - 3,8 Ct.
С учетом рассчитанных ранее закономерностей накопления ампликонов в ходе ПЦР для тест-штаммов C. jejuni можно предполагать, что различия в числе копий РНК в исходных пробах для целевой последовательности cdtB, установленные в данном исследовании, составляли 2,64lg, для гена ciaB - 1,14lg (рис. 2).
Заключение
Получены данные, подтверждающие увеличение экспрессии мРНК, кодирующих синтез белковой субъединицы В цитолетального токсина C. jejuni и антигенных маркеров факторов инвазии этого возбудителя, при кратковременном температурном воз-
10 -|-
8--_
6--
4--=;-
ACt 2-------
о—-—^—т—--^—1
-2--
-4----=!-
-6-
+4°C -18°C/+42°C
UcdtB П ciaB ■ 16S рРНК
Рис. 2. Изменения количества транскриптов у C. jejuni, подвергнутых охлаждению и замораживанию, соотнесенные со значениями Ct для положительных проб в реакции ПЦР-РВ
действии с последующим интенсивным прогреванием. Эти результаты позволяют предполагать, что экспрессия генов cdtB и ciaB у C. jejuni может служить индикатором клеточного ответа на стресс и способствует восстановлению функций бактериальной клетки после прекращения холодового воздействия и возвращения возбудителя в условия, благоприятные для реализации его патогенного потенциала.
Вместе с тем очевидно, что для подтверждения вышеописанного эффекта необходимы более детальные исследования метаболических процессов, участвующих в формировании стрессовых ответов Campylobacter spp. и их роли как потенциальных транскрипционных регуляторов.
В целом полученные данные свидетельствуют о необходимости углубленного изучения процессов формирования толерантности возбудителей пищевых токсикоинфекций C. jejuni, основанного на определении полного генетического и протеом-ного профилей патогенов, включая изучение внутриклеточных механизмов регуляции и экспрессии факторов патогенности.
Авторы выражают благодарность за помощь в разработке методических подходов, использованных для изучения экспрессии генов патогенности C. jejuni, кандидату биологических наук А.В. Булахову.
Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 15-16-00015).
Сведения об авторах
ФГБНУ «НИИ питания» (Москва):
Ефимочкина Наталья Рамазановна - доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории биобезопасности и анализа нутримикробиома E-mail: karlikanova@ion.ru
Вопросы питания. Том 85, № 1, 2016 73
Быкова Ирина Борисовна - научный сотрудник лаборатории биобезопасности и анализа нутримикро-биома
E-mail: bykova@ion.ru
Маркова Юлия Михайловна - младший научный сотрудник лаборатории биобезопасности и анализа
нутримикробиома
E-mail: yulia.markova.ion@gmail.com
Короткевич Юлия Владимировна - младший научный сотрудник лаборатории биобезопасности и анализа нутримикробиома E-mail: ulya_korotkevich@mail.ru
Шевелева Светлана Анатольевна - доктор медицинских наук, заведующая лабораторией биобезопасности и анализа нутримикробиома E-mail: sheveleva@ion.ru
Литература
#
Stintzi A. Gene expression profile of Campylobacter jejuni in 9. response to growth temperature variation // J. Bacteriol. 2003. Vol. 185, N 6. P. 2009-2016.
Weber M.H.W., Marahiel M.A. Bacterial cold shock responses // Sci. Prog. 2003. Vol. 86. P. 9-75. 10.
Levin R.E. Rapid Detection and Characterization of Foodborne Pathogens by Molecular techniques. USA : CRC Press, 2010. 592 p. 11.
On S.L.W., Dorrell N., Petersen L., Bang D.D. et al. Numerical analysis of DNA microarray data of Campylobacter jejuni strains correlated 12. with survival, cytolethal distending toxin and haemolysin analysis // Int. J. Med. Microbiol. 2006. Vol. 296, issue 6. P. 353-363. 13.
Poly F., Guerry P. Pathogenesis of Campylobacter // Curr. Opin. Gastroenterol. 2008. Vol. 24, issue 1. P. 27-31. Шевелева С.А., Шурышева Ж.Н, Пискарева И.И. Загрязненность пищевых продуктов бактериями рода Campylobacter // Вопр. 14. питания. 2006. № 6. С. 38-44.
Bohaychuk V.M., Gensler G.E., King R.K. et al. Evaluation of detection methods for screening meat and poultry products for the presence 15. of foodborne pathogens // J. Food Protection. 2005. Vol. 68, N 12. P. 2637-2647.
Hassane D., Lee R., Mendenhall M., Picket C. Cytholetal distending 16. toxin demonstrates genotoxic activity in a yeast model // Infect. Immun. 2001. Vol. 69, Is. 9. P. 5752-5759.
Konkel M.E., Gray S.A., Kim B.J. et al. Identification of the enteropathogens Campylobacter jejuni and Campylobacter coli based on the cadF virulence gene and its product // J. Clin. Microbiol. 1999. Vol. 37, N 3. P. 510-517.
Line J., Hiett K., Conlan A. Comparison of challenge models for determining the colonization dose of Campylobacter jejuni in broiler chicks // Poult. Sci. 2008. Vol. 87. P. 1700-1706. van Vliet A.H., Ketley J.M. Pathogenesis of enteric Campylobacter infection // J. Appl. Microbiol. 2001. Vol. 90, issue S6. P. 45S-56S. Young K.T., Davis L.M., Dirita V.J. Campylobacter jejuni: molecular biology and pathogenesis // Nat. Rev. Microbiol. 2007. Vol. 5, N 9. P. 665-679. Josefsen M.H., Cook N., D'Agostino M. et al. Validation of a PCR-based method for detection of food-borne thermotolerant Campylobacters in a multicenter collaborative trial // Appl. Environ. Microbiol. 2004. Vol. 70, N 7. P. 4379-4383. Wolffs P., Norling B., Hoorfar J. et al. Quantification of Campylobacter spp. in chicken rinse samples by using flotation prior to real-time PCR // Appl. Environ. Microbiol. 2005. Vol. 71, N 10. P. 5759-5764. Livak K. J., Schmittgen T.D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-AACt Method // Methods. 2001. Vol. 25. P. 402-408.
Humphrey T., O'Brien S., Madsen M. Campylobacters as zoonotic pathogens: a food production perspective // Int. J. Food Microbiol. 2007. Vol. 117, issue 03. P. 237-257.
2.
5
6
7
8
References
Stintzi A. Gene expression profile of Campylobacter jejuni in 9. response to growth temperature variation. J Bacteriol. 2003; Vol. 185 (6): 2009-2016.
Weber M.H.W., Marahiel M.A. Bacterial cold shock responses. Sci 10. Prog. 2003; Vol. 86: 9-75.
Levin R.E. Rapid Detection and Characterization of Foodborne Pathogens by Molecular techniques. USA : CRC Press, 2010: 592 p. 11. On S.L.W., Dorrell N., Petersen L., Bang D.D. et al. Numerical analysis of DNA microarray data of Campylobacter jejuni strains correlated 12. with survival, cytolethal distending toxin and haemolysin analysis. Int J Med Microbiol. 2006; Vol. 296 (6): 353-63. 13. Poly F., Guerry P. Pathogenesis of Campylobacter. Curr Opin Gastroenterol. 2008; Vol. 24 (1): 27-31.
Shurisheva J.N. Sheveleva S.A., Piskareva I.I. Assessment of the risk of contamination of food by Campylobacter spp. Voprosi pitaniia 14. [Problems of Nutrition]. 2006; Vol. 6: 38-44. (in Russian). Bohaychuk V.M., Gensler G.E., King R.K., et al. Evaluation of detection methods for screening meat and poultry products for the pres- 15. ence of foodborne pathogens. J Food Protection. 2005; Vol. 68 (12): 2637-47.
Hassane D., Lee R., Mendenhall M., Picket C. Cytholetal distend- 16. ing toxin demonstrates genotoxic activity in a yeast model. Infect Immun. 2001; Vol. 69 (9): 5752-9.
Konkel M.E., Gray S.A., Kim B.J., et al. Identification of the enteropatho-gens Campylobacter jejuni and Campylobacter coli based on the cadF virulence gene and its product. J. Clin. Microbiol. 1999; Vol. 37 (3): 510-7. Line J., Hiett K., Conlan A. Comparison of challenge models for determining the colonization dose of Campylobacter jejuni in broiler chicks. Poult Sci. 2008; Vol. 87: 1700-6.
van Vliet A.H., Ketley J.M. Pathogenesis of enteric Campylobacter infection. J Appl Microbiol. 2001; Vol. 90 (S6): 45S-56S. Young K.T., Davis L.M., Dirita V.J. Campylobacter jejuni: molecular biology and pathogenesis. Nat Rev Microbiol. 2007; Vol. 5 (9): 665-79. Josefsen M.H., Cook N., D'Agostino M., et al. Validation of a PCR-based method for detection of food-borne thermotolerant Campy-lobacters in a multicenter collaborative trial. Appl Environ Microbiol. 2004; Vol. 70 (7): 4379-83.
Wolffs P., Norling B., Hoorfar J., et al. Quantification of Campylo-bacter spp. in chicken rinse samples by using flotation prior to realtime PCR. Appl Environ Microbiol. 2005; Vol. 71 (10): 5759-64. Livak K. J., Schmittgen T.D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-AACt Method. Methods. 2001; Vol. 25: 402-8.
Humphrey T., O'Brien S., Madsen M. Campylobacters as zoonotic pathogens: a food production perspective. Int J Food Microbiol. 2007; Vol. 117 (03): 237-57.
74
2.
5
6
7.
8
