CC BY
41
Hygiene & Sanitation (Russian Journal). 2018; 97(10)
DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0016-9900-2018-97-10-995-1000
Original article
О КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2018 УДК 614.31:579.835.12]-078
Шевелёва С.А., ЕфимочкинаН.Р., Пичугина Т.В., Быкова И.Б., Стеценко В.В., МарковаЮ.М., Минаева Л.П.
УСКОРЕННЫЕ МЕТОДЫ ОБНАРУЖЕНИЯ БАКТЕРИЙ РОДА CAMPYLOBACTER В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ
ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии», 109240, Москва
Введение. Кампилобактериоз - острое кишечное заболевание, вызываемое бактериями рода Campylobacter, которое протекает с симптомами энтероколита и гастроэнтерита. В группу возбудителей кампилобакте-риоза входят термофильные виды C. jejuni, C. coli, C. lari, C. upsaliensis и C. helveticus. Заболеваемость кампи-лобактериозом регистрируется повсеместно в виде спорадических случаев, эпидемических очагов с пищевым и водным путями передачи инфекции. Индустриализация производства птицепродуктов привела к ускорению эволюции комменсальных для птицы патогенов рода Campylobacter, усилению контаминации ими продукции и повышению значимости в качестве возбудителей кампилобактериоза с пищевым путём передачи. Материал и методы. Основными объектами исследований являлись сырые птицепродукты и смывы с объектов производственной среды птицеперерабатывающих предприятий. Использованы культуральные, биохимические, иммунологические методы, методы определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам, ПЦР-анализ.
Результаты и обсуждение. Разработаны методы ускоренной индикации термофильных кампилобакте-ров в пищевой продукции и в смывах с объектов производственной среды с использованием комбинированных схем бактериологического и молекулярно-генетического анализа. Поскольку бактерии вида C. jejuni составляют 85-90% пищевых изолятов кампилобактеров, для целей производственного контроля допускается проведение анализа на наличие термофильных представителей рода Campylobacter с применением минимального набора культуральных и биохимических тестов родовой идентификации, что позволит сократить продолжительность анализов на 3-4 сут. в сравнении со стандартизованными методами, и снизить их трудоёмкость. Определены контрольные критические точки производства птицепродуктов, в которых необходимо проведение контроля на наличие термофильных кампилобактеров. Анализ смывов с поверхностей должен осуществляться на этапах убоя, ошпаривания, мойки и обработки на конвейере тушек, в ваннах контактного охлаждения, на участках изготовления полуфабрикатов и в процессе упаковки продукции.
Заключение. Полученные результаты использованы для разработки Методических указаний «Методы ускоренного определения бактерий рода Campylobacter в пищевой продукции и оценка их антибиотикоре-зистентности».
Ключевые слова: бактерии рода Campylobacter; пищевые продукты; смывы; методы детекции; тесты идентификации.
Для цитирования: Шевелёва С . А. , Ефимочкина Н. Р. , Пичугина Т. В. , Быкова И. Б. , Стеценко В. В . , Маркова Ю. М . , Минаева Л . П. Ускоренные методы обнаружения бактерий рода Campylobacter в пищевых продуктах. Гигиена и санитария. 2018; 97(10): 995-1000. DOI: http://dx . doi . org/10.18821/0016-9900-2018-97-10-995-1000
Для корреспонденции: Ефимочкина Наталья Рамазановна, доктор биол . наук, вед . науч . сотр . лаб . биобезопасности и анализа ну-тримикробиома ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» . E-mail: karlikanova@ion . ru
Sheveleva S.A., Efimochkina N.R., Pichugina T.V., Bykova I.B., Stetsenko V.V., Markova Yu.M., Minaeva L.P. RAPID METHODS OF THE DETECTION OF BACTERIA OF THE GENUS CAMPYLOBACTER IN FOOD PRODUCTS
Federal Research Center of nutrition, biotechnologies and food safety, Moscow, 109240, Russian Federation
Introduction. Campylobacteriosis is an acute intestinal disease caused by Campylobacter spp., which manifests with symptoms of enterocolitis and gastroenteritis. The causative agents of campylobacteriosis are C. jejuni, C. coli, C. lari, C. upsaliensis, and C. helveticus. The incidence of campylobacteriosis is recorded worldwide as sporadic cases and foodborne or waterborne outbreaks. The industrialization of poultry production has led both to the acceleration of the evolution of commensal pathogens from the genus of Campylobacter, increased contamination of raw products and importance Campylobacter as foodborne pathogens.
Material and methods. The main objects were raw poultry products and swabs from the environment of poultry processing enterprises. Cultural, biochemical, immunological methods, methods for the detection of the sensitivity of microorganisms to antibiotics, PCR analysis were used. Results and discussion. The methods of rapid detection of thermophilic campylobacters using combined schemes of bacteriological and molecular genetic analysis are developed. Because C. jejuni makes 85-90% offood isolates of campylobacters, for the purposes of production control the detection of thermophilic Campylobacter with a minimum set of cultural and biochemical tests of identification is allowed. This will reduce the duration of analyses up to 3-4 days and decrease their labor-cost. The control critical points of production of poultry products in which it is necessary to control the presence of thermophilic campylobacters are indicated. These are the stages of slaughter, scalding, washing, and processing on the conveyor of carcasses, contact cooling baths, the areas of semi-finished products manufacturing and the packaging.
DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0016-9900-2018-97-10-995-1000 Оригинальная статья
Conclusion. The obtained results were used to develop Guidelines "Methods of rapid determination of bacteria of the genus Campylobacter in food products and evaluation of their antibiotic resistance".
Keywords: bacteria of the genus Campylobacter; food products; swabs; detection methods; identification tests.
For citation: Sheveleva S. A. , Efimochkina N . R. , Pichugina T V. , Bykova I . B . , Stetsenko V. V. , Markova Yu. M . , Minaeva L. P. Rapid methods of the detection of bacteria of the genus Campylobacter in food products . Gigiena i Sanitaria (Hygiene and Sanitation, Russian journal) 2018; 97(10): 995-1000. (In Russ . ) . DOI: http://dx. doi. org/10.18821/0016-9900-2018-97-10-995-1000
For correspondence: NatalyaR. Efimochkina, MD, Ph . D . , DSci . , Leading researcher ofthe laboratory of biosafety and nutrimicrobiome analysis of the Federal Research Centre of nutrition, biotechnology and food safety, Moscow, 109240, Russian Federation . E-mail: karlikanova@ion . ru Information about authors: Sheveleva S. A. https://orcid. org/0000-0001-5647-9709;
Efimochkina N . R . http://orcid. org/0000-0002-9071-0326; Pichugina T V. http://orcid . org/0000-0002-4632-7119; Bykova I. B. https://orcid .org/0000-0001-7288-312X; Stetsenko V. V. http://orcid. org/0000-0001-6470-171X; Markova Yu. M . http://orcid. org/0000-0002-2631-6412; Minaeva L. P. http://orcid. org/0000-0003-1853-5735 .
Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Acknowledgment. The study was carried out at the expense of a grant from the Russian Science Foundation (project No . 15-16-00015-P) . Received: 20 August 2018 Accepted: 18 October 2018
Введение
Гастроэнтероколиты, вызванные бактериями рода Campylobacter, в настоящее время сохраняют лидирующие позиции среди острых кишечных инфекций с пищевым путём передачи . По данным ВОЗ, кампилобактериозные инфекции составляют 21% от общего числа диарейных инфекций вирусной и бактериальной этиологии . В Европейском Союзе в 2016 году число подтвержденных случаев этой инфекции в 2,2 раза превысило число случаев сальмонеллёза, а заболеваемость составила 72,4 на 100 000 населения По оценкам CDC (Centers for Disease Control and Prevention), кампилобактериозом в США страдает более 1,3 млн человек ежегодно [1, 2]. Кампилобак-териозный гастроэнтерит у чувствительных лиц в результате патологического аутоимунного ответа может осложняться развитием хронической патологии: синдрома раздражённого кишечника, реактивных артритов, нейропатий и полирадикулоневритов (синдромов Гийена - Баре и Миллера - Фишера), что резко повышает социальную значимость заболевания [3-6]. Заболеваемость кампилобактериозом преимущественно имеет спорадический характер, однако вспышки с пищевым и водным путями передачи инфекции регистрируются достаточно часто в большинстве стран Европы, в США, Новой Зеландии, Австралии [7-9].
Анализ эпидемиологической ситуации в Российской Федерации, несмотря на некоторое увеличение регистрации случаев кампилобактерио-за, свидетельствует о неудовлетворительном состоянии этиологической диагностики, сложностях при обосновании причинно-следственных связей с факторами распространения возбудителя
Развитие птицеперерабатывающей отрасли пищевой индустрии по темпам роста и объемам продукции превосходит развитие других отраслей животноводства как в России, так и в большинстве стран мира Индустриализация производства мяса птицы и птицепродуктов в глобальном масштабе привела к ускорению эволюции комменсальных для птицы патогенов рода Campylobacter, усилению контаминации ими продукции и повышению значимости в качестве возбудителей острых кишечных инфекций с пищевым путём передачи
Система мер по предупреждению и минимизации риска загрязнения пищевых продуктов кампилобактерами в процессе производства, хранения, транспортирования и реализации продукции регламентирована действующими в Российской Федерации Санитарными правилами СП 3. 1. 7 . 2816-10 «Профилактика кампилобактериоза у людей» . При этом предусматривается проведение производственного контроля по всем эпидемиологически значимым объектам и в критических точках потенциальной контаминации возбудителями кампилобакте-риоза
При выполнении СП 3 1 7 2816-10 требуется совершенствование существующей методической базы по обнаружению возбудителя кам-пилобактериоза, включая применение международных (ISO) или межгосударственных стандартов (ГОСТ) и их адаптацию к отечественным условиям лабораторного контроля сырья, полуфабрикатов, готовой продукции, а также объектов производственной среды
В группу термофильных бактерий рода Campylobacter - возбудителей кампилобактериоза - входят виды C. jejuni, C. coli, C. lari, C. upsaliensis и C. helveticus. Наибольшую эпидемиологическую значимость представляют C.jejuni, которые обусловливают основную часть (85-90%) случаев кампилобактериоза [10-12] Несмотря на высокую чувствительность к воздействию неблагоприятных факторов, в первую очередь к присутствию кислорода, кампилобактеры регулярно обнаруживаются на фермах и птицеперерабатывающих предприятиях, в воде и других объектах, поэтому их обнаружение требует разработки новых ускоренных методов детекции
Материал и методы
Работа выполнена в лаборатории биобезопасности и анализа ну-тримикробиома ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» . Объектами исследований являлись продукты животного и растительного происхождения, смывы с объектов внешней среды птицеперерабатывающих предприятий Всего исследовали более 300 проб, в том числе мясо, полуфабрикаты и субпродукты сырые различных видов птицы (кур, индейки, перепелов), молоко коровье непастеризованное, салаты листовые, смывы с поверхностей технологического оборудования Микробиологические исследования пищевой продукции и смывов на наличие бактерий рода Campylobacter проводили с использованием как общепринятых культуральных методов посева пищевых продуктов, так и с применением вновь разрабатываемых или модифицированных способов выделения и количественного учёта возбудителей кампилобактериоза [13, 14]. При выполнении работы также использовали биохимические, иммунологические методы, стандартные и модифицированные методы определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам, методы ПЦР-анализа
Результаты и обсуждение
Культуральные методы детекции Campylobacter в пищевой продукции предусматривают использование жидких и агаризованных селективных, дифференциально-диагностических сред и культивирование посевов с применением микроаэробно-генерирующих систем . Эти методы регламентированы стандартами ISO 10272:2017, ГОСТ ISO 10272-12013 и ГОСТ ISO/TS 10272-2-2013 [13-15].
Процедура выделения Campylobacter из образцов пищевых продуктов является длительной и трудоёмкой: для подтверждения принадлежности выделенных культур к роду Campylobacter и видовой идентификации требуется не менее 7-10 суток.
В лабораторной диагностике кампилобактериоза наиболее трудной задачей является первичная детекция возбудителя в связи с высокими уровнями микробного загрязнения пищевых продуктов и особенно сырья На общем микробном фоне исследуемого субстрата количество патогенов бывает, как правило, незначительным, поэтому их прямое культивирование оказывается невозможным, в связи с чем возникает необходимость применения специальных селективных методов обогащения для выделения и идентификации возбудителя . Для селективного выделения кампилобактерий используется широкий перечень питательных сред, ингибирующих агентов и тестов идентификации, учитывающих наиболее характерные культурально-морфологические и биохимические свойства возбудителя [16, 17]. Способность кампилобактерий переходить под влиянием стрессовых воздействий в некультивируемые формы создаёт особенно трудные методические проблемы для получения объективной оценки степени контаминации продукции и адекватного прогнозирования пригодности используемых схем контроля
Проведенные скрининговые исследования по выделению кампи-лобактерий из продуктов, полуфабрикатов и объектов внешней среды позволили разработать и рекомендовать для внедрения схему ускоренного определения термофильных бактерий рода Campylobacter (рис 1) Схема допускает использование следующих трёх вариантов детекции Campylobacter:
- качественный и количественный бактериологический анализ с идентификацией до рода;
- фермент-связанный флуоресцентный иммуноанализ недифференцированного суммарного определения видов C. jejuni, С. coli, С. lari;
- анализ методом полимеразной цепной реакции (ПЦР-анализ) с ги-бридизационно-флуоресцентной детекцией
DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0016-9900-2018-97-10-995-1000
Original article
Пересев выделенных культур рода Campylobacter в полужидкую среду для криохранения (при необходимости)
Рис .1. Схема проведения анализа на наличие бактерий рода Campylobacter в пищевых продуктах и смывах .
Учитывая, что кампилобактерии очень чувствительны к воздействию физико-химических параметров внешней среды, таких как присутствие кислорода (оксидативный стресс), замораживание, нагревание, высушивание, окислительно-восстановительный потенциал среды, ультрафиолетовое облучение [18-20], большое методическое значение приобретает процедура отбора и предподготовки проб к исследованию на наличие бактерий рода Campylobacter. В связи с этим рекомендуется:
• отбор проб и их доставку в лабораторию для исследования проводить в максимально короткие сроки, по возможности не более 1 ч; пробы должны отбираться в стерильные газонепроницаемые пакеты или герметично закрывающуюся стерильную посуду;
• транспортировка проб в термоконтейнерах или сумках-холодильниках;
• сохранять пробы до проведения анализа в защищенном от света месте при температуре 5 ± 1°С; образцы замороженных продуктов дефростировать при температуре 5 ± 1°С не более 18 ч или в течение 1 ч при температуре 19 ± 1°С;
• после вскрытия упаковки пробы немедленно подвергать анализу; приготовление объединённой пробы, навесок продукта и посев осуществлять в максимально короткие сроки (не более 1 ч); для приготовления объединённой пробы продукт измельчают, не допуская активного перемешивания образца во избежание воздействия кислорода Придавая особое значение технике отбора и тестирования смывов
с поверхностей оборудования и объектов внешней среды на наличие бактерий рода Campylobacter, разработана модифицированная методика, основанная на комплексном применении трёх видов сред для транспортирования и накопления кампилобактеров Пробы в исследуемой зоне отбирают трижды зонд-тампонами (с участков площадью 100 см2 для каждого тампона), и вносят в три среды: бульон Престона с кровью, бульон для бруцелл и транспортную среду Кэри-Блера с последующими пересевами на поверхность агаровых дифференциально-диагностических сред. Инокулированные смывы доставляют в лабораторию в герметично упакованных пакетах с газогенераторными системами и подвергают термостатированию, не нарушая целостности транспортной упаковки . Результаты посевов из трёх жидких сред оценивают положительно при наличии роста Campylobacter хотя бы в одной из засеянных сред
Эффективность разработанной комбинированной методики отбора проб с использованием не менее трёх вариантов транспортных сред была подтверждена исследованиями смывов на наличие бактерий рода Campylobacter в условиях птицеперерабатывающего предприятия [21]. При установленной частоте выявления Campylobacter в количестве 38,7% открываемость проб в трёх вариантах сред различалась: в бульоне
для бруцелл и в среде Кэри-Блера она была примерно равной и составляла 19,4%, а в бульоне Престона - 9,7% положительных проб . При этом в большинстве случаев выявленные позитивные пробы не дублировались одновременно на всех использованных средах
Анализ результатов скрининговых исследований характера контаминации производственной среды предприятий птицеперерабатывающей промышленности позволил разработать и рекомендовать схему и порядок взятия смывов . Ориентировочная частота проведения анализа смывов на наличие кампилобактерий для оценки санитарного состояния конкретного предприятия представлена в табл 1
Отбор смывов производится после санитарной обработки, перед началом работы оборудования При обнаружении бактерий рода Campylobacter в смывах кратность контроля на соответствующем участке увеличивают в 2 раза При обнаружении термофильных кампилобак-терий в смывах с технологического оборудования, инвентаря убойных, яйцеобрабатывающих цехов проводят внеочередную тщательную механическую и санитарную обработку, дезинфекцию оборудования, включая холодильные камеры . При последующем контроле за проведенными мероприятиями термофильные кампилобактерии в смывах не должны обнаруживаться
Модифицированный культуральный метод определения бактерий рода Campylobacter предусматривает посев определённых количеств исследуемой пробы в жидкие селективные среды, содержащие антибиотики и аэротолерантные добавки, с последующим пересевом на поверхность агаризованных селективных сред и инкубированием в микроаэрофильной атмосфере (10% СО 5% О2, 85% N2) при температуре 37-42оС . Выросшие на поверхности селективного агара типичные колонии подвергают идентификации, тестируя их по совокупности культу-ральных, морфологических и биохимических признаков, определяющих принадлежность к бактериям рода Campylobacter. Все этапы инкубации посевов осуществляются в микроаэрофильных условиях .
Кампилобактерии на поверхности агара образуют мелкие округлые колонии или колонии неправильной формы, как бы растекающиеся по ходу штриха, серые или полупрозрачные с сероватым оттенком, гладкие, влажные, блестящие Выросшие культуры окрашивают по Граму и микроскопируют, определяют наличие оксидазы и каталазы
При обнаружении роста на агаровой селективной среде колоний с типичными культуральными свойствами, в которых обнаруживаются грамотрицательные мелкие, тонкие спиралевидные палочки с одним или более завитками, обладающие ферментами каталазой и оксидазой, делают вывод об обнаружении термофильных бактерий рода Campylobacter В качестве дополнительного подтверждающего теста допускается ис-
DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0016-9900-2018-97-10-995-1000 Оригинальная статья
Рекомендуемый порядок взятия смывов на предприятиях птицеперерабатывающей промышленности
Таблица 1
Объект контроля Кратность контроля
Цеха убоя, первичной переработки мяса и птицы: Крупное оборудование, включая конвейеры, поверхности столов, ванны охлаждения Не реже 1 раза в 2 недели, не менее пяти проб
Мелкое оборудование и инвентарь (выборочно, с чередованием единиц оборудования) Не реже 1 раза в 2 недели, не менее пяти проб
Цеха производства сырых полуфабрикатов из мяса и птицы Крупное оборудование Мелкое оборудование и инвентарь (выборочно, с чередованием единиц оборудования), Не Не реже реже 1 раза в месяц, не менее трёх проб двух раз в месяц, не менее трёх проб
Цеха упаковки Тара, упаковочное оборудование, поверхности, контактирующие с продукцией Не реже двух раз в квартал, не менее трёх проб
Руки персонала, одежда у работников, соприкасающихся с продукцией, в середине и в конце смены Не реже 2 раз в квартал, не менее пяти проб
пользовать иммунохроматографические тесты промышленного изготовления для детекции Campylobacter spp.
Основным отличием предлагаемого метода является сокращение в два раза продолжительности селективного обогащения в жидкой среде и культивирования на агаровых средах (до 24 ч вместо 48 ч по ГОСТ 10272), а также подбор минимального комплекса информативных тестов для первичной родовой идентификации, позволяющих определить принадлежность выделенных культур к группе термотолерантных кам-пилобактеров (микроскопия по Граму, наличие ферментов оксидазы и каталазы) . Применение предлагаемого модифицированного метода позволяет не только сократить время анализа, но и снизить трудоёмкость лабораторных исследований . Кроме того, за счёт сокращения времени инкубации удаётся предотвратить рост сопутствующей микрофлоры (особенно протея), что повышает открываемость проб и достоверность получаемых результатов
С целью повышения эффективности выделения бактерий рода Campylobacter из различных объектов были модифицированы рецептуры традиционно используемых питательных сред и подобран сбалансированный состав ростовых и селективных компонентов в соответствии с требованиями ГОСТ ISO 10272-1-2013 и МУК 4. 2. 2321-08 [22]. Учитывая актуальность стандартизации методов контроля бактерий рода Campylobacter и отсутствие в Российской Федерации необходимого набора отечественных аналогов питательных сред разработан оптимизированный способ производства сухих питательных сред для выявления, идентификации и хранения кампилобактерий, выделенных из пищевой продукции и клинического материала [23] Проведённые исследования позволили разработать ТУ 21.20.23-006-01897222-2016 «Питательные среды сухие для детекции бактерий рода Campylobacter» и «Инструкцию по применению питательных сред» . В зависимости от назначения среды вырабатывают в следующих вариантах: жидкая селективная среда для накопления кампилобактерий; дифференциально-диагностический агар для выделения и количественного учёта Campylobacter spp (ДДА Campy); полужидкий питательный агар для криохранения культур Campylobacter spp. Практическое применение этих сред в условиях отечественных лабораторий позволит существенно упростить использование действующих ГОСТов, разработанных на основе международных стандартов ISO, но не адаптированных к основному ассортименту коммерческих сред и реактивов, применяемых при рутинном контроле пищевых продуктов на наличие кампилобактерий
Таблица 2
Критерии оценки чувствительности Campylobacter spp. к АМП
АМП Диаметр зоны, мм Порог чувствительности, мг/л Диапазон тестируемых концентраций, мг/л
S > R <
Ципрофлоксацин 26 25 0,5 0,12-16
Эритромицин 20 19 4-8 1-28
Налидиксовая 20 19 16 1-64
кислота
Тетрациклин 30 30 1-2 0,5-64
Гентамицин 17 16 2 0,12-16
Доксициклин 30 30 - -
Хлорамфеникол 17 17 - -
Амикацин 18 16 - -
Примечание . S - чувствительные штаммы; R - резистентные штаммы .
Метод фермент-связанного флуоресцентного иммуноанализа.
Для детекции микроорганизмов или их белковых метаболитов разработано большое число методов иммуноферментного анализа (ИФА). Диагностические препараты для ИФА, предназначенные для выявления большинства серологических маркеров, выпускаются различными предприятиями и фирмами как у нас в стране, так и за рубежом Одним из наиболее важных вопросов при их выборе является вопрос чувствительности метода и специфичности получаемых результатов, что достигается стандартизацией и адаптацией предлагаемых методик С целью ускорения и снижения трудоёмкости исследований на наличие термофильных Campylobacter spp. для контроля пищевых продуктов подобран альтернативный метод фермент-связанного флуоресцентного иммуноа-нализа [24].
Для фермент-связанного флуоресцентного иммуноанализа используют автоматические анализаторы, позволяющие проводить измерение флуоресценции 4-метил-умбелиферона при 450 нм, а также тест-наборы, в состав которых входят сенсибилизированные антителами пипетирующие устройства и реагенты для проведения анализа О результатах теста судят по относительной величине флуоресценции (ОВФ), значение которой для положительных проб должно быть > 0,1, а для отрицательных - < 0,1.
Анализ проводится после этапа предварительного обогащения проб пищевых продуктов (или смывов) в селективном бульоне с добавками антибиотиков и не требует выделения чистой культуры При необходимости подтверждения положительного результата проводят высев 0,1 см3 инокулированного бульона обогащения, хранившегося при 2-4°С (без прогревания), на поверхность одной из селективных агаровых сред При обнаружении подозрительных колоний проводят их идентификацию (не менее трёх колоний) на принадлежность к термофильным бактериям рода Campylobacter
Метод детекции термофильных бактерий рода Campylobacter на основе ПЦР предусматривает высев определённых количеств исследуемых проб пищевых продуктов или смывов в селективные питательные среды, инкубирование посевов, экстракцию ДНК из культуральной жидкости, амплификацию участка ДНК со специфичными праймерами и постановку ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией ам-пликонов в режиме реального времени
Подтверждение положительных результатов ПЦР-тестирования проводят культуральным методом или с помощью повторного ПЦР-анализа нетермостатированных парных проб по ГОСТ Р 57989-2017 или Методическим указаниям (МУ) [25, 26]
Предложенная модифицированная схема детекции Campylobacter spp., основанная на применении современных культурально-бактери-ологических методов в комплексе с иммунологическим и молекуляр-но-генетическим анализом, позволяет сократить в два раза продолжительность тестирования (до 3-4 сут вместо 7-10) за счёт упрощения процедуры идентификации выделенных культур, оптимизации режимов пробоподготовки и условий инкубирования на этапах селективного обогащения инокулированных образцов
Результаты исследований по оптимизации состава питательных сред и адаптации методических схем анализа для выявления и идентификации бактерий рода Campylobacter включены в МУ «Методы ускоренного определения бактерий рода Campylobacter в пищевой продукции и оценка их антибиотикорезистентности» (2018 г. ) .
Разработанные МУ также включают оценку чувствительности к антибиотикам термофильных бактерий рода Campylobacter, выделенных из пищевой продукции и смывов с объектов окружающей среды предприятий птицеперерабатывающей промышленности Для этих целей предлагается использование дискодиффузионного метода, основанного на ингибировании роста испытуемых культур в присутствии различных антимикробных препаратов (АМП) Перечень АМП для тестирования штаммов кампилобактерий и сведения о пограничных значениях зон подавления роста представлены в табл 2
DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0016-9900-2018-97-10-995-1000
Original article
Рис . 2 . Определение антибиотикорезистентности Campylobacter spp. дискодиффузионным методом .
При обнаружении резистентности исследуемого штамма кампило-бактерий к одному или нескольким АМП дискодиффузионным методом (рис 2), определяют минимальные ингибирующие концентрации (МИК) к соответствующим препаратам методом серийных разведений в соответствии с EUCAST, ГОСТ Р ИСО 20776-1-2010 и МУК 4.2.1890-04 [27-29] Сведения о пограничных значениях зон подавления роста и диапазонах тестируемых концентраций АМП обоснованы результатами исследований по оценке чувствительности к расширенному набору антимикробных препаратов нескольких фармгрупп у штаммов Campylobacter spp., выделенных в процессе производства пищевых продуктов [30].
Полученные данные используют для целей мониторинга и наблюдения за циркуляцией антибиотикорезистентных неклинических штаммов бактерий рода Campylobacter, в том числе при проведении профилактических мероприятий в соответствии с СП 3.1. 7. 2816-10 «Профилактика кампилобактериоза у людей» .
Заключение
Разработана комплексная методика ускоренного выявления термофильных кампилобактеров в пищевой продукции и в смывах с объектов производственной среды с использованием комбинированных схем бактериологического, иммунологического и молекулярно-генетического анализа Применение этих схем позволяет сократить время детекции на 3-4 сут в сравнении со стандартизованными методами анализа на наличие бактерий рода Campylobacter
Результаты проведённых исследований использованы для разработки МУ «Методы ускоренного определения бактерий рода Campylobacter в пищевой продукции и оценка их антибиотикорезистентности» . Документ содержит адаптированные для целей производственного контроля ускоренные методы детекции и количественного учёта термофильных кампилобактеров на основе бактериологических, иммунофлуоресцент-ных и молекулярных методов анализа, порядок санитарного обследования птицеперерабатывающих предприятий в контрольных критических точках производства, рекомендации по оценке эффективности санитарной обработки оборудования и инвентаря, а также методы определения антибиотикочувствительности выделенных штаммов Campylobacter spp. для целей мониторинга антибиотикорезистентных возбудителей кампи-лобактериоза и разработки мер ограничения их циркуляции
Финансирование. Исследование выполнено за счёт гранта Российского научного фонда (проект № 15-16-00015-П) .
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов
Литер ату р а
1. Ray B . , Bhunia A. Fundamental Food Microbiology. Fougth Edition .
CRC Press, 2008, 492 p . 2 . Sheppard S . K. , Falush D. A candidate hopeful monster in the genus
Campylobacter. In: Campylobacter Ecology and Evolution, ed . Sheppard S . K. , 2014, Caister Academic Press, Norfolk, UK. 359 p . , ISBN: 978-1-908230-2
3. Dasti J. I . , Tareen A. M . , Lugert R . , Zautner A . T , Gross U . Campylobacter jejuni: a brief overview on pathogenicity-associated factors and disease-mediated mechanisms . Int. J. Med. Microbial. 2010; 3: 205-211. 4 Nachamkin I , Guerry P Campylobacter infections Foodborne Pathogens: Microbiology and Molecular Biology. Wymondham, 2005: 285-293.
5 . Nachamkin I . Chronic effects of Campylobacter infections . Microbes Infect. , 2002; 4: 399.
6. Nachamkin I. , Alios B. M . , Ho T Campylobacter species and Guillain-Barre syndrome . Clin. Microbiol. Rev. 1998; 11: 555-567.
7. World Health Organization. The global view of campylobacteriosis: report of an expert consultation, Utrecht, Netherlands, 9-11 July 2012 . ISBN 978 92 4 156460 1. - www. who . int .
8 Nohra A , Grinberg A , Midwinter A C , Marshall J C , Collins-Emerson J. M . , French N . P. Molecular Epidemiology of Campylobacter coli Strains Isolated from Different Sources in New Zealand between 2005 and 2014 . Appl. and Environ. Microbiol. 2016; 82 (14): 4363-4370.
9. Van Dyke M . I. , Morton V K. , McLellan N. L. , Huck P. M . The occurrence of Campylobacter in river waterand waterfowl within a watershed in southern Ontario, Canada. J. Appl. Microbiol. 2010; 109: 1053-1066. http://dx . doi . org/10 .1111/j. 1365-2672.2010.04730. x .
10 Eurosurveillance Editorial Team 2012 The European Union summary report on trends and sources of zoonoses, zoonotic agents and food-bor-neoutbreaks in 2010 . Euro Surveill. 17:20113. http://www. eurosurveil-lance . org/ViewArticle . aspx?ArticleId?20113
11. Mullner P. , Spencer S. E. , Wilson D. J. , Jones G. , Noble A. D. , Midwinter A. C . , Collins-Emerson J. M . , Carter P. , Hathaway S. , French N . P. Assigning the source of human campylobacteriosis in New Zealand: a comparative genetic and epidemiological approach. Infect. Genet. Evol. 2009; 9: 1311-1319 . http://dx. doi . org/10 ,1016/j. meegid .2009.09.003.
12 . Campylobacter Ecology and Evolution. 2014, Caister Academic Press,
Norfolk, UK, Ed. S . K. Sheppard. 359 p . , ISBN: 978-1-908230-2.
13 ГОСТ ISO 10272-1-2013 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных Методы обнаружения и подсчета бактерий Campylobacter spp. Часть 1. Метод обнаружения
14. ГОСТ ISO/TS 10272-2-2013 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных Методы обнаружения и подсчета бактерий Campylobacter spp Часть 2 Метод подсчета колоний
15. ISO 10272:2017. Microbiology of the food chain - Horizontal method for detection and enumeration of Campylobacter spp Part 1: Detection method
16 . Bolton F. J. , Sails A. D . , Fox A. J. et al . Detection of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli in Foods by Enrichment Culture and Polymerase Chain Reaction Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. J. Food Protection, 2002; 65 (5): 760-767
17. Berghaus R. D . , Thayer S . G , Law B . F. , Mild R. M . , Hofacre C . L. , Singer R. S . Enumeration of Salmonella and Campylobacter spp . in environmental farm samples and processing plant carcass rinses from commercial broiler chicken flocks. Appl. and Environ. Microbiology. 2013; 79 (13): 4106-4114.
18 Seinige D , Krischek C , Klein G , Kehrenberg C Comparative Analysis and Limitations of Ethidium Monoazide and Propidium Monoazide Treatments for the Differentiation of Viable and Nonviable Campylo-bacter Cells . Appl. and Environ. Microbiology. 2014; 80 (7): 2186-2192.
19 Friesema I H , Havelaar A H , Westra P P , Wagenaar J A , van Pelt W Poultry culling and campylobacteriosis reduction among humans, the Netherlands . Emerg Infect Dis. 2012; 18 (3): 466-468.
20 . Stintzi A. Gene Expression Profile of Campylobacter jejuni in Response
to Growth Temperature Variation. J. of Bacteriology, 2003; 185 (6): 2009-2016
DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0016-9900-2018-97-10-995-1000 Оригинальная статья
21. Ефимочкина Н . Р. , Быкова И . Б . , Стеценко В . В . , Минаева Л . П . , Пичу-гина Т В. , Маркова Ю. М . , Короткевич Ю. В . , Козак С . С. , Шевелева С . А. Изучение характера контаминации и уровней содержания бактерий рода Campylobacter в отдельных видах пищевой продукции . Вопросы питания. 2016; 85 (5): 52-59 .
22 . МУК 4. 2. 2321-08 «Методы определения бактерий рода Campylobacter
в пищевых продуктах» . М . , Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2008. - 31 с .
23 . Ефимочкина Н . Р. , Пичугина Т. В . , Стеценко В . В . , Быкова И . Б . , Мар-
кова Ю . М . , Короткевич Ю . В . , Полянина А. С . , Шевелева С . А. Оптимизация методов контроля пищевых продуктов на основе создания дифференциально-диагностических сред для выделения и культивирования бактерий рода Campylobacter. Вопросы питания. 2017; 86 (5): 34-41
24. МУК 4.2.2878-11 «Методы определения бактерий рода Campylobacter в пищевых продуктах. Дополнения и изменения 1 к МУК 4. 2. 232108» М , Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотреб-надзора, 2011. 8 с .
25 . ГОСТ Р 57989-2017 Продукция пищевая специализированная . Ме-
тоды выявления патогенных микроорганизмов на основе полимераз-ной цепной реакции
26 МУК 4 2 2872-2011 «Методы выявления и идентификации патогенных бактерий - возбудителей инфекционных заболеваний с пищевым путём передачи в продуктах питания на основе ПЦР с гибри-дизационно - флуоресцентной детекцией» М , Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2011. 47 с.
27 Клинические рекомендации «Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам», 2014 г
28. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters . Version 5. 0, January. 2015.
29 . МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганиз-
мов к антибактериальным препаратам» М , Федеральный центр госсанэпиднадзора Минздрава России, 2004 91 с
30 Ефимочкина Н Р , Короткевич Ю В , Стеценко В В , Пичугина Т В , Быкова И Б , Маркова Ю М , Минаева Л П , Шевелева С А Анти-биотикорезистентность штаммов Campylobacter jejuni, выделенных из пищевых продуктов Вопросы питания 2017; 86 (1): 18-28
References
1. Ray B . , Bhunia A. Fundamental Food Microbiology. Fougth Edition.
CRC Press, 2008, 492 p . 2 . Sheppard S. K. , Falush D. A candidate hopeful monster in the genus
Campylobacter. In: Campylobacter Ecology and Evolution, ed . Sheppard S. K. , 2014, Caister Academic Press, Norfolk, UK. 359 p. , ISBN: 978-1-908230-2
3. Dasti J. I. , Tareen A. M . , Lugert R. , Zautner A. T , Gross U. Campylobacter jejuni: a brief overview on pathogenicity-associated factors and disease-mediated mechanisms . Int. J. Med. Microbial. 2010; 3: 205-211. 4 Nachamkin I , Guerry P Campylobacter infections Foodborne Pathogens: Microbiology and Molecular Biology. Wymondham, 2005: 285293
5. Nachamkin I . Chronic effects of Campylobacter infections . Microbes Infect. , 2002; 4: 399.
6 . Nachamkin I. , Allos B. M . , Ho T Campylobacter species and Guillain-
Barre syndrome . Clin. Microbiol. Rev. 1998; 11: 555-567.
7 . World Health Organization . The global view of campylobacteriosis:
report of an expert consultation, Utrecht, Netherlands, 9-11 July 2012 . ISBN 978 92 4 156460 1. - www. who. int.
8 Nohra A , Grinberg A , Midwinter A C , Marshall J C , Collins-Emerson J. M . , French N . P. Molecular Epidemiology of Campylobacter coli Strains Isolated from Different Sources in New Zealand between 2005 and 2014. Appl. and Environ. Microbiol. 2016; 82 (14): 4363-4370.
9 . Van Dyke M. I. , Morton V K. , McLellan N. L. , Huck P. M . The occur-
rence of Campylobacter in river waterand waterfowl within a watershed in southern Ontario, Canada. J. Appl. Microbiol. 2010; 109: 1053-1066. http://dx . doi . org/10 .1111/j. 1365-2672. 2010. 04730. x .
10 . Eurosurveillance Editorial Team . 2012 . The European Union summary
report on trends and sources of zoonoses, zoonotic agents and food-bor-neoutbreaks in 2010. Euro Surveill. 17:20113 . http://www. eurosurveillance . org/ViewArticle . aspx?ArticleId?20113
11. Mullner P. , Spencer S . E. , Wilson D. J. , Jones G. , Noble A. D. , Midwinter A . C . , Collins-Emerson J. M . , Carter P. , Hathaway S . , French N . P. Assigning the source of human campylobacteriosis in New Zealand: a comparative genetic and epidemiological approach . Infect. Genet. Evol. 2009; 9: 1311-1319 . http://dx. doi . org/10 ,1016/j. meegid .2009.09. 003.
12 . Campylobacter Ecology and Evolution. 2014, Caister Academic Press, Norfolk, UK, Ed. S. K. Sheppard. 359 p. , ISBN: 978-1-908230-2.
13. GOST ISO 10272-1-2013. Microbiology of food and animal feed . Methods of detection and counting of bacteria Campylobacter spp Part 1 Detection method
14. GOST ISO/TS 10272-2-2013 Microbiology of food and animal feed. Methods of detection and counting of bacteria Campylobacter spp Part 2 . Colony count technique .
15. ISO 10272:2017. Microbiology of the food chain - Horizontal method for detection and enumeration of Campylobacter spp Part 1: Detection method
16 Bolton F J , Sails A D , Fox A J et al Detection of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli in Foods by Enrichment Culture and Polymerase Chain Reaction Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. J. Food Protection, 2002; 65 (5): 760-767
17 . Berghaus R. D . , Thayer S. G. , Law B . F. , Mild R. M . , Hofacre C . L . , Singer
R . S. Enumeration of Salmonella and Campylobacter spp . in environmental farm samples and processing plant carcass rinses from commercial broiler chicken flocks . Appl. and Environ. Microbiology. 2013; 79 (13): 4106-4114.
18 Seinige D , Krischek C , Klein G , Kehrenberg C Comparative Analysis and Limitations of Ethidium Monoazide and Propidium Monoazide Treatments for the Differentiation of Viable and Nonviable Campylobacter Cells . Appl. and Environ. Microbiology. 2014; 80 (7): 2186-2192.
19 Friesema I H , Havelaar A H , Westra P P , Wagenaar J A , van Pelt W Poultry culling and campylobacteriosis reduction among humans, the Netherlands . Emerg Infect Dis. 2012; 18 (3): 466-468.
20 . Stintzi A. Gene Expression Profile of Campylobacter jejuni in Response
to Growth Temperature Variation . J. of Bacteriology, 2003; 185 (6): 2009-2016.
21. Efimochkina N . R . , I . B . Bykova, L. P. Minaeva, T. V Pichugina, V V Stet-senko, Yu. M. Markova, Yu. V. Korotkevich, S . S . Kozak, S . A. Sheveleva. Study of the contamination and the levels of Campylobacter spp during the processing of selected types of food. Voprosi pitanya. 2016; 85 (5): 52-59. (In Russian) .
22 . Methodological guidelines 4.2.2321-08 «Methods for the determination of bacteria of the genus Campylobacter in food products» M , Federal center of hygiene and epidemiology of Rospotrebnadzor, 2008: 31
23. Efimochkina N . R . , Pichugina T. V , Stetsenko V V , Bykova I . B . , Markova Yu . M . , Korotkevich, Y. V. , Polyanina, A . S . , Sheveleva S . A. Optimization methods of food control, based on differential-diagnostic media for the isolation and cultivation of bacteria of the genus Campylobacter Voprosi pitanya. 2017; 86 (5): 34-41. (In Russian).
24 . Methodological guidelines 4. 2. 2878-11 " Methods for determination of bacteria of the genus Campylobacter in food Addendum and amendments 1 to methodological guidelines 4. 2. 2321-08". M . , Federal Center of hygiene and epidemiology of Rospotrebnadzor, 2011. 8 p .
25. GOST R 57989-2017 Specialized Food Products . Methods of detection of pathogenic microorganisms based on polymerase chain reaction
26 . Methodological guidelines 4.2.2872-2011 "Methods for detection and
identification of bacterial foodborne pathogens in the food products based on PCR with fluorescence detection" M , Federal Center of hygiene and epidemiology of Rospotrebnadzor, 2011. 47 p .
27 Clinical guidelines "Determination of microbial susceptibility to antimicrobial agents", 2014
28 European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters Version 5 0, January. 2015 .
29 . Methodological guidelines 4.2.1890-04 "Determination of sensitivity of
microorganisms to antibiotics" M , Federal Center of Gossanepidnadzor of the Ministry of health of Russia, 2004. 91 p .
30 . Efimochkina N. R. , Korotkevich Yu. V. , Stetsenko V. V. , Pichugina T. V ,
Bykova I. B. , Markova Yu. M . , Minaeva L. P. , Sheveleva S. A. Antibiotic resistance of Campylobacter jejuni strains isolated from food products Voprosi pitanya, 2017; 86 (1): 18-28 (In Russian)
Поступила 12 . 07 .18 Принята к печати 18. 10 .18
