CC BY
80
УДК: 543.9:663
БПК-БИОСЕНСОР НА ОСНОВЕ ДРОЖЖЕЙ DEBARYOMYCESHANSENIL, ИНКАПСУЛИРОВАННЫХ В КРЕМНИЙОРГАНИЧЕСКИЕ ЗОЛЬ-ГЕЛЬ МАТРИЦЫ
Е.Л. Афонина, Д.Г. Лаврова, К.С. Щукина, О.А. Каманина
Синтезированы органосиликатные материалы на основе тетраэтоксисилана (ТЭОС), метилтриэтоксисилана (МТЭС) и полиэтиленгликоль (ПЭГ) с молекулярной массой 3000 Да. Применение силановых прекурсоров ТЭОС и МТЭС в соотношении 15/85 и ПЭГ 3000 в условиях основного катализа позволили провести иммобилизацию дрожжей ВеЬагуотуеея hansenii ВКМ Y-2482 в кремнийорганическую золь-гель матрицу. Ранее было показано, что в данных условиях вокруг каждой клетки формируются капсулы и органосиликатная капсула защищает клетки от воздействия вредных факторов. Полученный биораспознающий элемент был использован при разработке БПК-биосенсора. Значения БПК, определяемые с помощью биосенсора на основе инкапсулированных дрожжей и стандартным методом, незначимо отличаются между собой. Разработанный биосенсор является перспективным инструментом для мониторинга загрязнений сточных вод.
Ключевые слова: БПК-биосенсор, биохимическое потребление кислорода, золь-гель, инкапсулированные дрожжи, гибридный биоматериал.
Введение
В современном мире огромное количество выбросов приходится на водный бассейн. В водоемы сбрасываются не только бытовые и производственные стоки, но также стоки с пищевых и биотехнологических производств, которые, с химической точки зрения не являются опасными, однако способствуют нарушению природного баланса и тем самым приводят к эвтрофикации водного объекта. Одним из критериев загрязненности воды органическими веществами является количество кислорода, потребляемого в ходе аэробного окисления этих веществ микроорганизмами за определенный интервал времени - биохимическое потребление кислорода (БПК), выражаемое в миллиграммах на литр. Общепринятая методика определения БПК требует инкубирования насыщенной кислородом пробы в течение 5 (БПК5) или 20 суток (БПКполн). Отсутствие оперативности существенно снижает ценность такого определения. По указанной причине могут возникать экологически опасные ситуации, при которых остается "за кадром" поступление в водоемы загрязненных вод или их недоочистка в процессе регенерации, и выброс неочищенных стоков. Это диктует необходимость использования экспресс-методов контроля БПК. Метод оценки БПК, основанный на использовании биосенсорных анализаторов, позволяет сократить время с нескольких суток до нескольких минут, что важно для оперативного
анализа. В настоящее время разработано большое количество лабораторных моделей и коммерчески производимых БПК-анализаторов, информация о которых суммирована в последних обзорах [2, 3].
Анализ результатов исследований по разработке БПК-биосенсоров позволяет заключить, что наиболее достоверные коррелирующие со стандартным методом данные по БПК удается получить на основе биосенсоров с использованием целых клеток микроорганизмов. Важным моментом в развитии БПК-биосенсоров является увеличение времени жизни и устойчивости к различным токсическим веществам микроорганизмов, закрепленных на поверхности преобразователя сенсора [4]. Описанные проблемы могут быть решены с помощью инкапсулирования микроорганизмов в различные матрицы.
Силикатные материалы являются перспективными для иммобилизации живых клеток, поскольку являются естественной средой обитания для многих микроорганизмов. Кроме того, в природе существует целая группа организмов, которые для создания своих скелетов и защитных оболочек используют кремнезем. Клетки диатомовых водорослей снаружи окружены твердой кремниевой оболочкой, называемой панцирем, который обеспечивает клеткам механическую защиту [5]. Важнейшая функция таких систем — защита жизненных функций организмов и генетического материала своего вида от неблагоприятных условий, при этом силикатная оболочка не препятствует поступлению питательных веществ в клетку. Материалы на основе кремнезема имеют преимущества перед полимерными материалами, которые часто используют для иммобилизации клеток, именно, способность удерживать воду без значительного набухания, химическая и биологическая инертность, механическая прочность, контролируемая пористость, оптическая прозрачность [6]. Ещё одним преимуществом является методы получения таких материалов из кремнийорганических соединений (прекурсоров) в мягких условиях золь-гель синтеза. Это важно для сохранения физиологической активности микроорганизмов. Золь-гель методы являются экономичными и экологически чистыми. Использование матриц на основе модифицированных силикагелей для иммобилизации целых клеток является относительно новым направлением исследований в биотехнологии, в том числе для получения инкапсулированных клеток, так называемых «искусственных спор» [7]. Инкапсулированные микроорганизмы представляют значительный интерес для разработки эффективных биокатализаторов [8,9], в том числе при создании биосенсоров [10]. Ранее нами было показано, что в условиях основного катализа при определенном соотношении силановых прекурсоров ТЭОС и МТЭС, в присутствии структурообразующего агента ПЭГ и при участии дрожжей Pichia angusta BKM Y-2559 и Cryptococcus curvatus ВКМ Y-3288
происходит самопроизвольное формирование органосиликатной капсулы вокруг клеток [11].
Важным фактором при разработке БПК-биосенсора является способность микроорганизмов окислять широкий спектр соединений. Дрожжи Debaryomyces hansenii ВКМ Y-2482 (D. hansenii) обладают широкой субстратной специфичностью, и способны легко окислять различные соединения [3]. В предыдущих исследованиях нами было показано, что БПК-биосенсор на основе кислородного электрода и D. hansenii характеризуется высокой долговременной стабильностью и чувствительностью [12, 13]. Эти дрожжи являются перспективными биокатализаторами в БПК-биосенсорах благодаря их гало-, осмо- и криотолерантности, что обеспечивает стабильность функционирования микробного биосенсора в присутствии стрессовых факторов среды [14, 15].
Ранее нашим научным коллективом было показано, что при иммобилизации дрожжевых клеток в золь-гель матрицы на основе силановых прекурсоров ТЭОС, МТЭС и порообразователя ПЭГ 3000, с содержанием гидрофобной добавки МТЭС 85% об. (от общего объема силановых компонентов матрицы) происходит образование структуры, в которой вокруг каждой клетки формируется капсула, при этом инкапсулированные клетки образуют единую структуру [11]. Известно, что прочные силикатные оболочки, образующиеся вокруг клеток, эффективно защищают их от воздействия механического сдвига, осмотического давления и теплоты [16]. Нами в работе [11] показано, что органосиликатная капсула защищает инкапсулированные дрожжевые клетки от УФ-излучения, от присутствия в растворе ионов тяжелых металлов и повышенной кислотности среды. Поскольку БПК определяют в загрязненных стоках, которые могут содержать токсичные для микроорганизмов примеси, то использование инкапсулированных в золь-гель матрицы клеток D. hansenii позволит получить БПК-биосенсор, который способен функционировать стабильно в этих средах.
Материалы и методы В работе использовали метилотрофные бактерии Ogataea polymorpha ВКМ Y-2559 (ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН).
Иммобилизация биоматериала и формирование биораспознающего элемента. К 0,1 см 20 % раствора полиэтиленгликоля 3000 (ПЭГ) («Ferak Berlin», Германия) в фосфатном буферном растворе
3 9 3
прибавляли 0,25 см суспензии клеток ((1,3±0,1)-10 КОЕ/см ) в фосфатном буферном растворе (20 ммоль/дм , рН 7,6) и перемешивали в течение 5 минут (Elmi CM-70M07, Польша), добавляли 0,5 см смеси тетраэтоксисилана (ТЭОС) («Sigma», США) и метилтриэтоксисилана (МТЭС) («Sigma», США) и вновь перемешивали в течение 5 минут. Затем
33
добавляли 0,025 см 0,2 моль/дм раствора катализатора NaF,
перемешивали 15 минут. Дыхательную активность иммобилизованных клеток оценивали с помощью биосенсорной установки.
Биосенсорные измерения. Для проведения исследования использовали модифицированный микробный электрод и анализатора pH-метр-иономер-БПК-термооксиметр Эксперт-001-4.0.1 (ООО «Эконикс-эксперт», Россия), который позволяет регистрировать содержание растворенного кислорода в кювете. В кювету объемом 5 мл помещают буферный раствор и анализируемую пробу.
Для измерений использовали натрий-калиевый фосфатный буферный раствор (рН = 6,8), концентрация солей в котором составляла 20 мМ. Раствор перемешивали магнитной мешалкой (200 об/мин). Пробы вводили автоматическими микропипетками переменного объема (200 -1000 мкл, 20 - 200 мкл, 0,5 - 10 мкл, Biotech, США). В качестве модельной использовали смесь глюкозы и глутаминовой кислоты в массовом соотношении 1:1 (ГГС), которую применяют как стандарт в определении БПК5 в Российской Федерации и международной практике [19, 20]. В соответствии с нормативной документацией [19] принимали, что БПК5, равное 205 мг/л, соответствует раствору, содержащему 150 мг/л глюкозы и 150 мг/л глутаминовой кислоты (БПК5 = 0,68*Сггс).
Определение БПК5 стандартным методом разбавления. В качестве референтного метода для определения БПК5 использовали метод разбавления. Анализ проводили в соответствии с методикой, указанной в [19, 20]. Определение содержания растворенного кислорода проводили с использованием БПК-термооксиметра Эксперт-001-4.0.1 (ООО «Эконикс-эксперт», Россия).
Результаты и их обсуждение
Согласно рекомендациям подразделения Международного союза теоретической и прикладной химии (IUPAC) по физической и аналитической химии [21] важными характеристиками биосенсоров являются характеристики: чувствительность, рабочий или линейный интервал концентраций, предел обнаружения и нижняя граница определяемых концентраций. Время функционирования биосенсора без замены биораспознающего элемента (долговременная стабильность) позволило судить о стабильности биокатализатора на основе инкапсулированных в кремнийорганическую матрицу микроорганизмов. В ходе работы был получен рецепторный элемент с инкапсулированными органосиликатные золь-гель матрицы клеток D. hansenii и определены основные характеристики разработанных рецеп-торных элементов: субстратная специфичность чувствительность, диапазон определяемых концентраций, операционная и долговременная стабильность.
Важным при разработке БПК-биосенсора является, способность клеток окислять широкий спектр соединений. Профиль субстратной специфичности биораспознающего элемента представлен на рис. 1.
Рис. 1. Профиль субстратной специфичность дрожжей ВеЪагуотуееБ
Нажени ВКМ У-2482
Из рис. 1 видно, что инкапсулированные дрожжи окисляют не только спирты, сахара, аминокислоты и органические кислоты, но и способны метаболизировать ароматические и поверхностно-активные соединения, которые содержатся как в промышленных, так и в хозяйственных стоках, что представляет интерес при разработке БПК -биосенсора.
Аналитические и метрологические характеристики БПК-биосенсора определяли на основе измерения изменения дыхательной активности закрепленных на поверхности кислородного электрода инкапсулированых клеток. Содержание кислорода в приэлектродном пространстве изменялось в зависимости от содержания ГГС. Пересчет на БПК осуществляли по формуле БПК=0,68СГГС. Данная зависимость аппроксимируется гиперболой, что характерно для ферментативной кинетики (рис. 2).
Для определения эффективности биосенсора используют количественную характеристику - чувствительность. Коэффициент чувствительности находили как первую производную к гиперболической
3 1
зависимости, и при низких значения БПК он составил (48,0±0,1)^10~ мин , что на порядок выше, чем при использовании другого метода иммобилизации, включении в гель поливинилового спирта [1], а также
более стабильным, в сравнении с биосенсором другого поколения -
медиаторным биосенсором [18]. ^
Ф
О #
со
3
БПК, мг/дм
Рис.2. Графические зависимости ответа сенсора от БПК для полученного гетерогенного биокатализатора при использовании
в качестве субстрата ГГС
Таким образом, клетки дрожжей В. НатепН, покрытые органосиликатной оболочкой, могут стать основой БПК-биосенсора, характеризующегося повышенной чувствительностью и стабильностью.
С целью апробации и коррелятивной оценки БПК-биосенсора были взяты образцы воды из источников Тульской области. Пробы представляли собой образцы речной и колодезной воды. Отбор проб производился в соответствии со стандартной методикой [19]. Определение БПК5 стоков стандартным методом разбавления проводилось согласно действующим нормативным документам [19, 20]. Полученные результаты представлены в таблице.
Статистический анализ результатов определения БПК показал, что выборки, полученные двумя методами, однородны по воспроизводимости. Значения БПК, определяемые с помощью биосенсора на основе инкапсулированных дрожжей и стандартным методом, незначимо отличаются между собой.
Определение БПК в реальных образцах
Образец воды 3 Способ измерения БПК, мгО2/дм
С помощью биосенсора Стандартный метод (БПК5)
Колодец Болохово 1,4±0,4 1,4±0,5
Скуратово Талая 1 5±1 4,9±0,3
Скуратово Талая 2 5,2±0,2 5±1
Заключение
В ходе работы дрожжи Debaryomyces hansenii ВКМ Y-2482 были иммобилизованы в кремнийорганическую золь-гель матрицы. Получен стабильный рецепторный элемент биосенсора с высокой чувсвительно-стью. Показано, что с помощью разработанного БПК-биосенсора возможно определять значения БПК сточных вод. Значения БПК, определяемые с помощью разработанного биосенсора и стандартным методом, незначимо отличаются между собой. Таким образом, БПК-биосенсор на основе инкапсулированных дрожжей Debaryomyces hansenii в золь-гель матрицу является перспективным инструментом для мониторинга загрязнений сточных вод.
Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 16-38-00700 мол_а и Правительства Тульской области (ДС/50).
Библиографический список
1. BOD biosensor based on the yeast Debaryomyces hansenii immobilized in poly(vinyl alcohol) modified by N-vinylpyrrolidone / V.A. Arlyapov, N.Y. Yudina, L.D. Asulyan [et al.]// Enzyme Microb. Technol. 2013. V. 53. № 4. P. 257-262.
2. Methods for assessing biochemical oxygen demand ( BOD ): A review / S. Jouanneau, L. Recoules, M.J. Durand [et al.] // Water Res. Elsevier Ltd, 2013. V. 49. P. 62-82.
3. Chouler J., Lorenzo M. Di. Water Quality Monitoring in Developing Countries; Can Microbial Fuel Cells be the Answer. 2015. P. 450-470.
4. Влияние времени культивирования , состава исследуемых проб и условий анализа на окислительную активность дрожжей / Н.Ю. Юдина, В. А. Арляпов, А.С. Зайцева [и др.]// Известия ТулГУ. Естественные науки. 2012. №3. C. 186-197.
5. Living bacteria in silica gels / N. Nassif, O. Bouvet, N.M. Rager [et al.] // Nat Mater. 2002. P. 42-44.
6. Sakai-Kato K., Ishikura K. Integration of biomolecules into analytical systems by means of silica sol-gel technology // National Institute of Health Science. 2005. V. 6. P. 70-75.
7. Artificial Spores: Cytocompatible Encapsulation of Individual Living Cells within Thin, Tough Artificial Shells / S.H. Yang, D. Hong, J. Lee [et al.] // Small. 2013. V. 9. № 2. P. 178-186.
8. Fabrication and characterization of dodecylamine derived monodispersed mesoporous bioactive glass sub-micron spheres / Q. Hu, X. Chen, N. Zhao [et al.] // Journal of Sol-Gel Science and Technology. 2013.10.1007/s10971-013-3167-6. P. 1-8.
9. Dickson D. J., Ely R. L. Silica sol-gel encapsulation of cyanobacteria: lessons for academic and applied research // Appl Microbiol Biotechnol. 2013. V. 97/ I. 5. P. 1809-19.
10. Co-immobilized microbial biosensor for BOD estimation based on sol-gel derived composite material / J. Jia, M. Tang, X. Chen [et al.] // Biosensors and Bioelectronics. 2003. V. 18/ I. 8. P. 1023-1029.
11. Yeast-based self-organized hybrid bio-silica sol-gels for the design of biosensors / O.N. Ponamoreva, O.A. Kamanina, V.A. Alferov [et al.] // Biosens. Bioelectron. 2015. V. 67. P. 321-326.
12. Biosensor analyzer for {BOD} index express control on the basis of the yeast microorganisms Candida maltosa, Candida blankii, and Debaryomyces hansenii / V. Arlyapov, S. Kamanin, O. Ponamoreva [et al.] // Enzyme and microbial technology. 2012. V. 50. №. 4. P. 215-220.
13. BOD biosensor based on the yeast Debaryomyces hansenii immobilized in poly(vinyl alcohol) modified by N-vinylpyrrolidone / V. A. Arlyapov, N.Yu. Yudina, L.D. Asulyan [et al.] // Enzyme and microbial technology. 2013. V. 53. №. 4. P. 257-262.
14. PereiraM. F. O. S. A Portrait of State-of-the-art Research at the Technical University of Lisbon / ed. Pereira M. F. O. S.: Springer, 2007. 621 p.
15. Breuer U., Harms H. Debaryomyces hansenii an extremophilic yeast with biotechnological potential // Yeast. 2006. V. 23. № 6. P. 415-437.
16. Ratledge C.T.K.-H. In Yeast Biotechnology and Biocatalysis. Marcel Dek. New York, 1990. 253 p.
17. Determination of BOD-values of starch-containing waste water by a BOD- biosensor / M. Reiss, A. Heibges, J. Metzger [et al.] // Biosens. Bioelectron. 1998. Vol. 13, № 10. P. 1083-1090.
18.. Медиаторный биосенсор на основе дрожжевых клеток Debaryomyces hansenii для определения БПК / Е.Е. Бабкина, В.А. Арляпов, А.В. Беленьких [и др.] // Известия Тульского государственного университета. Естественные науки. 2011. T. 3. C. 199-209
19. ISO 5815-1:2003, 2003. Water Quality-Determination of Biochemical Oxygen Demand after NDays (BODn) - Part 1: Dilutionand Seeding Method with Allylthiourea Addition.
20. ПНД Ф 14. 1:2:3:4. 123-97. Количественный химический анализ вод. Методика выполнения измерений биохимической потребности в кислороде после n-дней инкубации (БПКполн) в поверхностных пресных, подземных (грунтовых), питьевых, сточных и очищенных сточных водах. М.: 1997. 25 с.
21. Electrochemical biosensors: recommended definitions and classification / D. R. Thevenot, K. Toth, R.A. Durst [et al.] // Biosens. Bioelectron. 2001. V. 16. P. 121-131.
Афонина Елена Леонидовна, магистрант, still_elive@mail. ru, Россия, Тула, Тульский государственный университет
Лаврова Дарья Геннадьевна, аспирант, [email protected], Россия, Тула, Тульский государственный университет
Щукина Ксения Сергеевна магистрант, [email protected], Россия, Тула, Тульский государственный университет
Каманина Ольга Александровна, канд. хим. наук, ассист., [email protected], Россия, Тула, Тульский государственный университет
BOD-BIOSENSOR BASED ON THE YEAST DEBARYOMYCES HANSENII IMMOBILIZED IN SOL-GEL MATRIX
E.L. Afonina, D.G. Lavrova, K.S. Shukina, O.A. Kamanina
Organosilicate materials based on tetraethoxysilane (TEOS), methyltriethoxysilane (MTES) and polyethylene glycol (PEG) with a molecular weight of3000 Da were synthesized. Silane precursors TEOS and MTES (ratio of 15/85) and PEG 3000 were used for immobilization of yeast Debaryomyces hansenii VKM Y-2482 in the silicone sol-gel matrix. Previously, it was shown that capsules are formed around each cell and protect them from harmful environmental factors. Encapsulated microorganisms were used to develop a BOD- biosensor. BOD values determined using biosensor-based encapsulation of yeast and standard method differ insignificantly. The developed biosensor is a promising tool for monitoring waste water pollution degree.
Key words: BOD-biosensor, biochemical oxygen demand, sol-gel, encapsulated microorganisms, hybrid materials
Afonina Elena Leonidovna, undergraduate, still_elive@,mail.ru, Russia, Tula, Tula State University,
Lavrova Daria Gennadievna, postgraduate student, d.g.fedoseeva@gmail. com, Russia, Tula, Tula State University,
Shukina Kseniya Sergeevna, undergraduate, shukina. xenya@yandex. ru, Russia, Tula, Tula State University,
Kamanina Olga Aleksandrovna, candidate of chemical sciences, assistant professor, [email protected], Russia, Tula, Tula State University
