CC BY
90
ХИМИЧЕСКИЕ НАУКИ
УДК: 543.9:663
КЛЕТКИ МИКРООРГАНИЗМОВ КАК СТРУКТУРООБРАЗУЮЩИЕ АГЕНТЫ В СИНТЕЗЕ ГИБРИДНЫХ КРЕМНИЙОРГАНИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ С ПРИМЕНЕНИЕМ ЗОЛЬ-ГЕЛЬ ТЕХНОЛОГИЙ
Т.В. Бурмистрова, Д.Г. Лаврова, О.А. Каманина, А.В. Мачулин,
О.Н. Понаморева
Показано, что в ходе иммобилизации микроорганизмов в условиях золь-гель синтеза кремнийорганических полимеров клетки являются центрами формирования архитектуры гибридного биоматериала, причем в зависимости от типа микроорганизмов формируются специфические структуры: клетки метилотрофных дрожжей Ogataeapolymorphaинкапсулированы, а уксуснокислые бактерии Gluconobacteroxydans участвуют в образовании сферических структур геля. Таким образом, используя различные микроорганизмы, можно регулировать архитектуру кремнеземных матералов, т.е. использовать клетки микроорганизмов в роли темплатов.
Ключевые слова: золь-гель, кремнийорганические соединения, биомиметические структуры, инкапсулированные микроорганизмы, гетерогенный биокатализатор.
Введение
Многие инновационные достижения, в том числе в области новых материалов с биомиметическими структурами, инициированы живой природой. Живые организмы в процессе эволюции природных систем выстраивают различные минерализованные структуры, которые представляют собой сложные иерархические архитектуры на основе композитных биоматериалов [1]. Важнейшая функция таких систем — защита организмов и генетического материала своего вида от неблагоприятных условий. Клетки диатомовых водорослей снаружи окружены твердой силикатной оболочкой, обеспечивающей клеткам механическую защиту [2]. Неорганическая оболочка не препятствует поступлению питательных веществ в клетку. Это послужило примером для получения гибридных бионеорганических структур путем иммобилизации живых клеток в силикатные капсулы [3]. Такой подход является относительно новым направлением исследований в нанобиотехнологии и представляет собой один из путей создания биомиметических структур, так называемых «искусственных спор» («artificial spore»), на основе инкапсулированных клеток микроорганизмов [4]. Клетки, покрытые защитной оболочкой или встроенные в неорганический матрикс, являются идеальными стабильными «живыми материалами» [5] и могут использоваться как перспективные биокатализаторы, на их основе можно
создавать биореакторы [6], биосенсоры [7, 8], биопрепараты для деградации токсичных соединений [9], имплантаты [10] и др. [11, 12]. Матрицы на основе оксида кремния имеют преимущества перед органическими гидрогелями, которые наиболее часто используют для иммобилизации живых клеток, так как они способны удерживать воду без значительного набухания, химически и биологически инертны, механически прочны и обеспечивают жизнеспособность клеток в течение длительного времени [13].
Наиболее эффективным способом, обеспечивающим направленное регулирование текстурных характеристик кремнеземных материалов, является золь-гель метод с использованием структурообразующих агентов [14]. В качестве структурообразующих агентов могут выступать клетки микроорганизмов. Они обеспечивают формирование определенных 3Б-структур и могут выступать в роли темплатов [15] или гетерогенных биокатализаторов. Использование бактериальных клеток в роли структурообразующего агента позволяет синтезировать неорганические материалы с полыми частицами, различной формы [16]. Например, кремнеземный материал, полученный с использованием кишечной палочки, имеет удельную поверхность 68 м /г, средний размер пор 2,5 нм и состоит из полых частиц, повторяющих морфологию бактерий [17]. Данное направление в материаловедении пористых материалов является достаточно новым и перспективным. Ранее нами было показано, что в условиях катализа фторидом натрия в нейтральной среде формируются оболочки вокруг каждой клетки дрожжей [18, 19]. В работе исследовали влияние типа микроорганизмов - метилотрофных дрожжей Ogataea ро1ушогрИа и уксуснокислых бактерий ОЫсопоЬа^ег охуйат - на структуру формирующегося кремнийорганического биоматрикса.
Материалы и методы
Штаммы микроорганизмов. В работе использовали метилотрофные бактерии Ogataea ро!утогрИа ВКМ У-2559и уксуснокислые бактерии GluconoЬacter oxydans ВКМ В-1280(ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН).
Культивирование метилотрофных дрожжей. Дрожжевой штамм Ogataea polymorpha ВКМ У-2559 (далее Og.polymorpha) был получен во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН (Пущино). Культивирование дрожжей проводили на питательной среде следующего состава: (КН4^04 - 2,5 г/дм3, MgS04 — 0,2 г/ дм3, КИ2Р04-3И20 — 0,7 г/дм3, КаН2Р04^Н20 - 3,0
3 3 3
г/дм , дрожжевой экстракт - 0,5 г/дм , глицерин — 8,3 см и микроэлементы — М^04 - 0,0012 г/дм3; СоС1^6Н20 - 0,0003 г/дм3; (КН4)бМо7024-4И20 - 0,0002 г/дм3; СаС1г2Н20 - 0,0015 г/дм3; FeS04•7H20
33
- 0,01 г/дм ; ЭДТА - 0,001 г/дм . Культуру микроорганизмов выращивали
3 3
в колбах объемом 750 см (объем среды 150 см ) при 28°С и аэрации в шейкере при 190 об/мин. Инокулят вносили в количестве 1,5 % по объему среды до конечной концентрации ~106 КОЕ/см3. Биомассу помещали в колбу, содержащую 200 см бесфосфатной среды и индуцировали метанолом (2 см ). Индуцированную биомассу центрифугировали при 2000g в течение 15 мин, осадок промывали фосфатным буферным раствором (30 ммоль/дм3, рН 7,6). Биомассу дрожжей хранили в микропробирках при +4°С.
Культивирование уксуснокислых бактерий. Бактериальный штамм Gluconobacter oxydans subsp. industrius ВКМ B-1280 (далее G. oxydans) был получен во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН (Пущино). Клетки выращивали в жидкой среде аэробно 18-20 часов в качалочных колбах объёмом 750 мл при температуре 28°С в среде следующего состава:
33
сорбит - 200 г/дм , дрожжевой экстракт - 20 г/дм , дистиллированная вода - 100 см . Среду для выращивания бактериальных клеток стерилизовали автоклавированием при давлении 1,1 атмосфера в течение 30 мин. Посевной материал выращивали аналогично 24 часа. Объем инокулята составлял 10 % об. Биомассу собирали центрифугированием при комнатной температуре на центрифуге MiniSpin (Eppendorf AG, Германия) при 8000 об/мин (4270g) 10 минут и отмывали от культуральной среды двукратно 20 мМ фосфатным буфером рН 6,0 (соли Na2HPO4 и KH2PO4, Диа-М, Россия). Осевшие клетки рассуспендировали в свежей порции буфера, распределяли по порциям и осаждали центрифугированием 10 при 4000g. Промытую биомассу взвешивали и хранили в микропробирках при + 4°С.
Золь-гель иммобилизация биоматериала. К 0,1 см 20 %
раствора полиэтиленгликоля 3000 (ПЭГ) («Ferak Berlin», Германия) в фосфатном буферном растворе прибавляли 0,25 см суспензии клеток
9 3 3
((1,3±0,1)-109 КОЕ/см3)
в фосфатном буферном растворе (20 ммоль/дм , рН 7,6) и перемешивали в течение 3 минут (Elmi CM-70M07, Польша), добавляли 0,5 см смеси тетраэтоксисилана (ТЭОС) («Sigma», США) и метилтриэтоксисилана (МТЭС) («Sigma», США) и вновь перемешивали в течение 3 минут. Затем добавляли 0,025 см3 0,2 моль/дм3 раствора катализатора NaF, перемешивали 15 минут. Дыхательную активность иммобилизованных клеток оценивали с помощью биосенсорной установки
[19].
Влияние УФ на дыхательную активность иммобилизованных микроорганизмов. Инкапсулированные в золь-гель матрицу микроорганизмы облучали УФ (254 нм) в течение 5 часов. Интенсивность облучения составляла 680 мкВт/см . После облучения фрагмент гетерогенный биокатализатор с иммобилизованными клетками помещали на поверхность кислородного электрода Кларка и фиксировали с помощью
нейлоновой сетки, дыхательную активность иммобилизованных клеток оценивали с помощью биосенсорной установки [19].
Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ). Образцы органосиликатной золь-гель матрицы наносили на поверхность токопроводящего скотча, который закрепляли на металлическом диске -объектодержателе. Затем на поверхность образца напыляли тонкий слой платиново-углеродной смеси. Напыление осуществляли в вакуумно-напылительной установке JEE-4X ("JEOL", Япония). Электронно-микроскопический анализ образцов проводили с помощью сканирующего электронного микроскопа JSM-6510 LV ("JEOL", Япония) в режиме низкого вакуума (30 Па) при регистрации обратно-отраженных электронов (BSE). Для приготовления образцов клеток Og.polymorpha и G. oxydans
8 3
клеточную суспензию ((2,0±0,2)*10 КОЕ/см ) наносили на поверхность токопроводящего скотча, после 5 минут инкубации каплю удаляли с помощью фильтровальной бумаги, поверхность промывали несколько раз водой, для удаления не связанных с поверхностью клеток. После этого скотч с образцом монтировали на поверхность объектодержателя и проводили напыление платиново-углеродной смеси. СЭМ анализ проводили в режиме низкого вакуума (30 Па) при регистрации BSE, а также в режиме высокого вакуума при регистрации вторичных электронов (SE).
Результаты и их обсуждение
Иммобилизация бактерий Gluconobacter oxydanse органосиликатную матрицу.Уксуснокислые бактерии.
Изучение структуры получаемых матриц проводили методом сканирующей электронной микроскопии. На рис. 1 представлена золь-гель матрица без иммобилизованного биоматериала, которая представляет собой сферы размером от 1 до 5 мкм, плотно упакованные в цепочки. Однако при использовании биоматериала наблюдается образование в фронтальной структуре шаров до 50 мкм (рис. 2).
При использовании 50 % об. МТЭС в составе матрицы (рис. 2А) наблюдается образование сфер, на поверхности которых находятся клетки Gluconobacteroxydans. При разрушении сфер (рис. 2Б) видно, что они полые внутри. Такие структуры при использовании в качестве биокомпонента уксуснокислых бактерий Gluconobacteroxydansв условиях основного катализа были получены впервые. Выявление механизма образования таких структур требует дополнительных исследований.
Иммобилизация дрожжей Ogataea polymorpha в органосиликатную матрицу. При иммобилизации дрожжей в органосиликатные матрицы наблюдается картина, отличная от ранее полученной при иммобилизации бактерий (рис. 3).
Рис. 1. Изображение золь-гель матрицы, полученное с помощью сканирующей электронной микроскопии (соотношение силановых прекурсоров: 50 % об. МТЭС и 50 % об. ТЭОС)
а б
Рис. 2. Изображение золь-гель матрицы с иммобилизованными бактериями Gluconobacteroxydans, полученное с помощью СЭМ с содержанием МТЭС 50 % об. Рамками 1,2,3 отмечены иммобилизованные бактерии. Вставка бактерии Gluconobacteroxydans в чистой культуре (а), изображение разрушенных сфер золь-гель матрицы с иммобилизованными бактериями Gluconobacter
oxydans (СЭМ) (б)
При иммобилизации дрожжевых клеток вокруг каждой клетки формируется капсула, при этом инкапсулированные клетки образуют единую архитектуру гибридного биоматериала (рис. 3).
Воздействие ультрафиолетового излучения на
иммобилизованные микроорганизмы.
Дополнительным доказательством формирования разных структур гибридных материалов можно считать результат воздействия ультрафиолетового излучения на иммобилизованные дрожжи и бактерии. Известно, что силикатные материалы, в частности стекла, непроницаемы для коротковолнового и средневолнового диапазона УФ излучения. УФ излучение часто используют в микробиологии, биотехнологии, медицине
для стерилизации оборудования, поэтому важно понимать насколько эффективно кремнийорганические капсулы защищают живые клетки при облучении. Иммобилизованные микроорганизмы облучали УФ в коротковолновой области (X = 254 нм), после чего определяли дыхательную активность микроорганизмов, как свидетельство их жизнеспособности. Оказалось, что дыхательная активность дрожжей практически не изменилась по сравнению с активностью необлученных дрожжевых клеток. Однако дыхания бактериальных клеток после обучения гибридного материала практически не наблюдалось.
Рис. 3. Изображение золь-гель матрицы (15 %ТЭОС и 85 %МТЭС) с инкапсулированными метилотрофными дрожжами OgataeapolymorphaBKM У-2559 (рамками 1,2,3 на рисунке выделены капсулы, содержащие дрожжи Og. polymorpha) (СЭМ). Вставка: изображение клеток метилотрофных дрожжей OgataeapolymorphaBKM У-
2559 в чистой культуре (СЭМ)
Эти результаты подтверждают образование капсул вокруг дрожжевых, но не бактериальных клеток, и указывают на беспрецедентные защитные функции кремнийорганического матрикса, что следует учитывать при разработке различных биотехнологий. Так, при использовании инкапсулированных дрожжей в качестве биокатализатора УФ-облучение можно использовать для периодической стерилизации биореактора, что позволит избежать микробной контаминации.
Таким образом, тип микроорганизмов играет важную роль в формировании ЭБ-структуры органомодифицированных золь-гель матрицы. Используя различные микроорганизмы можно регулировать
архитектуру золь-гель матрицы и использовать микроорганизмы в роли темплатов.
Заключение
В ходе работы метилотрофные дрожжи Ogataea polymorpha и уксуснокислые бактерии Gluconobacter oxydans были иммобилизованы в кремнийорганические золь-гель матрицы. Показано, что в условиях основного катализа микроорганизмы играют важную роль при фотмировании архитектуры гибридного биоматериала. Причем в зависимости от типа микроорганизмов формируются специфические структуры: клетки дрожжей Ogataea polymorpha инкапсулированы, а бактерии Gluconobacter oxydans участвуют в образовании сферических структур геля.
Работа выполнена при поддержке РФФИ (грант 16-43-710183-р_центр_а)
Списоклитературы
1. Wang S., Guo Z. Bio-inspired encapsulation and functionalization of living cells with artificial shells // Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 2014. V. 113, I. 1. P. 483-500.
2. Meunier P.F., Dandoy P., Su B.L. Encapsulation of cells within silica matrixes: Towards a new advance in the conception of living hybrid materials // Journal of Colloid and Interface Science. 2010. V. 342. P. 211-224.
3. Living bacteria in silica gels/N.Nassif, O.Bouvet, M.Noelle Rager et al. // Nat Mater. 2002. V. 1, I. 1. P. 42-44.
4. Artificial spores: cytocompatible encapsulation of individual living cells within Thin, Tough Artificial Shells / S.H.Yang, D.Hong, J.Lee et al. // Small. 2013. V. 9, I. 2. P. 178-186.
5. Meunier P.F., Dandoy P., Su B.-L. Encapsulation of cells within silica matrixes: Towards a new advance in the conception of living hybrid materials // Journal of Colloid and Interface Science. 2010. V. 342. P. 211-224.
6. Dickson D. J., Ely R. L. Silica sol-gel encapsulation of cyanobacteria: lessons for academic and applied research // Appl Microbiol Biotechnol. 2013. V. 97, I. 5. P. 1809-1819.
7. Co-immobilized microbial biosensor for BOD estimation based on sol-gel derived composite material / J.Jia, M.Tang, X.Chen et al. // Biosensors and Bioelectronics. 2003. V. 18, I. 8. P. 1023-1029.
8. Depagne P., Roux P., Coradin V. How to design cell-based biosensors using the sol-gel process // Anal Bioanal Chem. 2011. V. 400, I. 4. P. 965-976.
9. Use of silica-encapsulated Pseudomonas sp. strain NCIB 9816-4 in biodegradation of novel hydrocarbon ring structures found in hydraulic
fracturing waters / K.G.Aukema,L.Kasinkas,A.Aksan et al.// Organic Geochemistry 2014 Vol.75 P. 1-27.
10. Fibroblast encapsulation in hybrid silica-collagen hydrogels / M.F.Desimone, P.Helary, G.Mosser et al. // Journal of Materials Chemistry. 2010. V. 20, I. 4. P. 666.
11. Blondeau M., Coradin V. Living materials from sol-gel chemistry: current challenges and perspectives // Journal of Materials Chemistry. 2012. V. 22, I. 42. P. 22335-22343.
12. Encapsulation of cells within silica matrixes: Towards a new advance in the conception of living hybrid materials / J.Van Wijk, P.F.Meunier, P.Dandoy et al.// Journal of Colloid and Interface Science. 2010. V. 342. P. 211224.
13. Evaluation of sol-gel silica matrices as inoculant carriers for Mesorhizobium spp. cells / G.S.Alvarez, F.L.Pieckenstain, M.F.Desimone et al. // Current Reseach, Technology and Education Topics in Applied Microbiology and Microbioal Biotechnology / Mendez-Vilas A.FORMATEX, 2010. P. 160166.
14. Collinson M. M. Recent trends in analytical applications of organically modified silicate materials // TrAC Trends in Analytical Chemistry. 2002. V. 21, I. 1. P. 31-39.
15. Zhou H. Hydrothermal synthesis of ZnO hollow spheres using spherobacterium as biotemplates // Microporous and Mesoporous Materials. 2007. V. 100. P. 322-327.
16. Nomura T. Fabrication of silica hollow particles using Escherichia coli as a template // Materials Letters. 2008. V. 62. P. 3727-3729.
17. Nomura T. Synthesis of hollow silica microparticles from bacterial templates // Advanced Powder Technology. 2010. V. 21. P. 218-222.
18. Synthesis of organosilicon sol-gel matrices and preparation of heterogeneous biocatalysts based on them / O.A.Kamanina, D.G.Fedoseeva, T.V. Rogova et al. // Russ. J. Appl. Chem. 2014. P. 761-766.
19. Yeast-based self-organized hybrid bio-silica sol-gels for the design of biosensors /O.N.Ponamoreva, O.A.Kamanina, V.A.Alferov et al. // Biosens. Bioelectron. 2015. P. 321-326.
Бурмистрова Татьяна Вячеславовна, магистрант,
tatyana. [email protected], Россия, Тула, Тульский государственный университет.
Лаврова Дарья Геннадьевна, магистрант, d.g. fedoseevaagmail. com, Россия, Тула, Тульский государственный университет,
Каманина Ольга Александровна, к.х.н, ассистент, o.a.kamanina@,gmail.com, Россия, Тула, Тульский государственный университет,
Мачулин Андрей Валериевич, к.б.н., научный сотрудник, and.machul@,gmail.com, Россия, Пущино, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН,
Понаморева Ольга Николаевна, д.х.н., зав. кафедрой биотехнологии, [email protected], Тульский государственный университет
THE STUDY OF THE STRUCTURE OF SILICONE MATRIX SCANNING
ELECTRON MICROSCOPE
Burmistrova T., Lavrova D., Kamanina O.,MachulinA.,Ponamoreva O.
In this work it was shown that cells become the centers offormation of hybrid biomaterial architecture during the immobilization of microorganisms in the conditions of the solgel synthesis of silicone polymer. Formation of specific structures depends on the type of microorganisms: cells of methylotrophic yeast Ogataeapolymorphaare encapsulated and acetic acid bacteria Gluconobacteroxydans involved in formation of spherical gel structures. Thus, by using different microorganisms, it is possible to adjust the silica material architecture, i.e. to use microbial cells as templates.
Keywords. sol-gel, a heterogeneous biocatalyst, hybrid materials, biomaterials, encapsulated microorganisms.
Burmistrova Tatyana Vyacheslavovna, graduate student, tatyana.burmistrova.94@,mail.ru, Russia, Tula, Tula State University,
Lavrova Daria Gennadievna, graduate student, [email protected], Russia, Tula, Tula State University,
Kamanina Olga Aleksandrovna, candidate of chemical sciences, assistant professor, [email protected], Russia, Tula, Tula State University,
Machulin Andrey Valerievich, candidate of biology sciences, research associate, and.machul@,gmail.com, Russia, Pushchino, Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Russian Academy of Sciences,
Ponamoreva Olga Nikolaevna, doctor of chemical sciences, department of biotechnology, [email protected], Russia, Tula, Tula State University
