CC BY
115
УДК 606:517.151.5
БИОМИМЕТИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ: ИНКАПСУЛИРОВАННЫЕ В ЗОЛЬ-ГЕЛЬ КРЕМНЕЗЕМА КЛЕТКИ МИКРООРГАНИЗМОВ
О.Н. Понаморева
Новым направлением в создании биомиметических материалов является формирование вокруг клеток защитных силикатных оболочек. Такие «живые» материалы могут использоваться как биокатализаторы и биоматериалы для биосенсоров, биоректоров, тканевой инженерии [и др.] Нами впервые установлено, что в условиях золь-гель синтеза из кремнийорганических прекурсоров в присутствии основания 3Б-архитектура «живых» материалов зависит от типа микроорганизма. Вокруг клеток дрожжей формируются капсулы, которые обеспечивают защиту микроорганизмов в стрессовых условиях (ионы тяжелых металлов, УФ-излучение). Бактерии обеспечивают формирование структур, состоящих из кремнийорганических сфер, на поверхности которых иммобилизованы клетки.
Ключевые слова: биомиметические материалы, инкапсулированные клетки, золь-гель, кремнезем, кремнийорганические соединения, гетерогенные биокатализаторы.
1. Природные одноклеточные организмы как примеры для создания биомиметических материалов - «живых» гибридных материалов
Всем известно, что природа создает свои творения с максимальной эффективностью. Оригинальность, необычность, безупречная точность и экономия ресурсов, с которой природа решает свои задачи, просто не может не вызывать восхищения и желания хоть в какой-то мере скопировать эти удивительные вещества и процессы. Наука, которая занимается таким копированием, называется биомиметикой. Многие инновационные достижения, в том числе в области новых материалов с биомиметическими структурами, инициированы живой природой. Живые организмы в процессе эволюции природных систем выстраивают различные минерализованные структуры, которые представляют собой сложные иерархические архитектуры на основе композитных биоматериалов [1]. Важнейшая функция таких систем — защита организмов и генетического материала своего вида от неблагоприятных условий. Клетки диатомовых водорослей снаружи окружены твердой силикатной оболочкой, обеспечивающей клеткам механическую защиту (рис. 1) [2]. Неорганическая оболочка не препятствует поступлению питательных веществ в клетку. Это послужило примером для получения гибридов живых клеток и неорганических материалов путем иммобилизации микроорганизмов в силикатные капсулы [3].
Рис. 1. Изображение сканирующей электронной микроскопии диатомовых водорослей, бар 5 lm(a); радиолярий, бар 20 lm (b);
губки, бар 2.5 cm (c) [2]
Такой подход является относительно новым направлением исследований в нанобиотехнологии и представляет собой один из путей создания биомиметических структур, так называемых «искусственных спор» («artificial spore»), на основе инкапсулированных клеток микроорганизмов (рис. 2) [4].
Избирательная
Клетка "Искусственная спора"
Рис. 2. Схематическое представление «искусственной споры» [4]
Клетки, покрытые защитной оболочкой или встроенные в неорганический матрикс, являются идеальными стабильными «живыми материалами» [2] и могут использоваться как перспективные биокатализаторы, на их основе можно создавать биореакторы [5, 6], биосенсоры [7-9], биопрепараты для деградации токсичных соединений [10], имплантаты [11].
Матрицы на основе оксида кремния имеют преимущества перед органическими гидрогелями, которые наиболее часто используются для иммобилизации живых клеток, так как они способны удерживать воду без значительного набухания, химически и биологически инертны, механически прочны и обеспечивают жизнеспособность клеток в течение длительного времени [12-13].
2. Структурированные кремнеземные материалы из золь-гель химии
Для получения структурированных материалов на основе окисда кремния (кремнезема) используют методы золь-гель химии [14]. Большинство методик синтеза силикагелей основаны на гидролизе алкоксисиланов с последующей конденсацией гидроксилсодержащих производных, что приводит к формированию пористых гелей. Для получения таких материалов в качестве силановых прекурсоров, как правило, используют тетраалкоксисиланы. Жесткая структура кремнеземной матрицы может оказывать негативное влияние на физиологическое состояние иммобилизованных микроорганизмов. Для снижения механического давления матрицы на клетки повышают ее гибкость путем использования в золь-гель синтезе органомодифицированных силоксанов, в которых, по крайней мере, одна алкоксильная группа замещена на алкильную. Связи C-Si не гидролизуются, что приводит к образованию органо-неорганического материала, в котором алкильные заместители являются гидрофобными, а внутренняя часть геля - гидрофильной, поэтому алкилалкоксисиланы называют гидрофобной добавкой. Алкильные заместители увеличивают пористость и гибкость геля. При слишком большом количестве алкильных заместителей гель теряет пористую структуру, становится вязким и не может поддерживать структуру. При слишком малом количестве гидрофобных радикалов гель напоминает хрупкий гель, полученный из тетралкоксисилана [15].
Сами по себе пористые кремнеземные материалы широко применяются в самых различных областях промышленности, что объясняется особым набором свойств, включая высокую химическую, термическую и механическую стабильность, низкую токсичность, адсорбционные свойства и каталитическую инертность. Они могут быть использованы при разделении газовых смесей в качестве адсорбентов, в качестве наполнителей резинотехнических изделий и, кроме того, являются подходящим носителем для достижения устойчивого, контролируемого высвобождения молекул лекарственных препаратов и антисептиков или как носители для катализаторов реакций органического синтеза [16]. Для получения структурированных силикатных материалов применяют методы золь-гель химии, которые не требует энергоемкого, дорогостоящего оборудования, являются экономичным и экологически чистым [17].
Наиболее эффективным способом, обеспечивающим направленное регулирование текстурных характеристик кремнеземных материалов, является золь-гель метод с использованием структуроуправляющих агентов [18]. В одном из последних обзоров [19] суммирована информация о самоорганизованном образовании серии кремнеземных наноматералов различной архитектуры, полученных в золь-гель реакциях при участии
органических и биологических молекул, эти структуры поражают воображение. Тем не менее, пока не существует единой общепринятой схемы формирования кремнеземных материалов в присутствии структуроуправляющих агентов, но перспективы получения новых материалов с уникальными структурами на основе гибридов органических молекул и диоксида кремния огромны.
В последние 10-15 лет с интенсивным развитием методов нанотехнологии и бионанотехнологии все большее внимание уделяется исследованиям золь-гель процессов минерализации при участии целых клеток, поскольку прорывные технологии, как правило, разрабатываются на стыке разных областей знаний. Это всегда не просто в силу междисциплинарности тематики. Клети микроорганизмов могут рассматриваться как темплаты для получения силикатных материалов с заданными пространственными структурами и формами (биомиметических материалов) [20]. По нашему мнению, в настоящее время в этой области наблюдается период адаптации и накопления знаний, но вскоре можно будет наблюдать экспоненциальный рост исследований и переход на новое качество понимания процессов, происходящих в таких сложных системах. Недавно, основываясь на анализе информации о ферментных системах организмов, обеспечивающих формирование силикатных панцирей в природе, и известных модельных системах, была выдвинута новая парадигма в бионеорганической химии -ферментативный синтез силикатоснованных полимеров [21], что открывает новые возможности в изготовлении сложных узорных структур из диоксида кремния. Вполне вероятно, что участие микроорганизмов в самоупорядоченном формировании биоминералогических структур может быть обусловлено не только участием определенных молекул и функциональных групп на их поверхности [22-23], но и активностью, как специфических ферментов микроорганизмов, так и ферментов, обеспечивающих градиент концентрации некоторых веществ в околоклеточном пространстве, например градиент рН. Для проверки этой гипотезы необходимо проводить многосторонние исследования, поэтому любые шаги, сделанные в этом направлении, актуальны и позволяют приблизиться к выяснению закономерностей самоорганизованного формирования определенных пространственных структур гибридных материалов.
3. Иммобилизация клеток дрожжей и бактерий в кремнийорганическую матрицу (исследования нашего научного коллектива)
В нашем научном коллективе в лабораториях Естественнонаучного института Тульского государственного университета в течение 4-х лет проводятся исследования по получению таких «живых» гибридных
материалов с использованием методов золь-гель химии. Фундаментальной целью этих исследований является выявление закономерностей формирования ЗБ-архитектуры гибридов клеток микроорганизмов и кремнийорганической матрицы, образующихся в условиях золь-гель синтеза, и определение влияния структуры биоматериала на его характеристики и свойства.
Основными стадиями формирования золь-гель матрицы являются гидролиз кремнийорганических прекурсоров и поликондеобразовавшихся нсация гидроксилсодержащих кремниевых соединений (рис. 3).
Известно, что рН значительно изменяет скорости гидролиза и конденсации алкоксисиланов. Практически все разработанные методики иммобилизации предполагают быстрый кислотный гидролиз прекурсоров, затем иммобилизацию клеток после увеличения рН среды до слабокислой -нейтральной, когда эффективно протекает поликонденсация кремниевой кислоты. Мы исследовали возможности применения основного катализа в мягких условиях при рН близких к нейтральным для контролируемого образования оболочки вокруг каждой клетки [24]. Иммобилизацию микроорганизмов проводили в одну стадию, в качестве исходных прекурсоров использовали тетраэтоксисилан (ТЭОС) и гидрофобную добавку метилтриэтоксисилан (МТЭС), структурообразующий агент полиэтиленгликоль (ПЭГ).
Нам впервые удалось зафиксировать процесс образования капсулы вокруг клеток дрожжей методом оптической микроскопии (рис. 4). Это стало возможно, потому что процесс формирования золь-геля в условиях основного катализа протекает медленно в течение нескольких часов (рис. 3).
Каждая дрожжевая клетка является центром формирования кремнийорганической оболочки. Архитектура формирующегося биоматериала зависит только от соотношения силановых прекурсоров [25]. В то же время, клетки бактерий запускают формирование совершенно другой архитектуры, что показано впервые (рис. 4). Наиболее вероятное объяснение - разные биомолекулярные структуры клеточных стенок бактерий и дрожжей.
ЗБ-Архитектура гибридных биоматериалов определяется соотношением силановых прекурсоров МТЭС и ТЭОС, это находит отражение в свойствах биоматериала. Получены результаты, которые убедительно свидетельствуют о защитной функции кремнийорганической капсулы вокруг клеток: ионы тяжелых металлов в концентрации 100 ПДК снижают активность инкапсулированных дрожжей менее чем на 20%; 5-ти часовая обработка УФ (X = 254 нм) не влияет на активность иммобилизованного биоматериала и дрожжи способны работать в широком диапазоне рН (от 2 до 14) [25].
Рис. 3. Динамика образования капсулы вокруг Cryptococcus curvatus. Оптическая микроскопия, фазовый контраст. Бар-метка 10 мкм
Рис. 4. Архитектура гибридных материалов на основе иммобилизизо-ванных клеток дрожжей (а,в)и бактерий (б,г). СЭМ-изображения (а, б)
и схематические структуры (в, г)
На основе инкапсулированных метилотрофных дрожжей разработали гетерогенный биокатализатор, который можно использовать при разработке биофильтров для очистки метанолсодержащих стоков химических предприятий и нефтедобывающих компаний [26], и как биочувствительный элемент для биосенсоров [27].
4. Направление дальнейших исследований
Исследования по созданию биомиметических материалов методами золь-гель химии будут продолжены в трех направлениях.
1. Выяснение роли органических полимеров как структурообразующих агентов в формировании определенных ЗБ-архитектур гибридных биоматериалов из целых клеток микроорганизмов и кренийорганических прекурсоров. Известно, что структурообразующие органические полимеры полиэтиленгликоль (ПЭГ) и поливиниловый спирт (ПВС) часто используются для получения органомодифицированных силикатных материалов с различной степенью жесткости, регулируемой пористостью, гидрофобностью и гидрофильностью. Применение ПВС позволяет повысить активность инкапсулированных ферментов примерно в 25 раз [28], формировать тонкие пленки и нановолокна из оксид кремния/ПВС [29] и обеспечивает формирование плоских структур иммобилизованных бактерий для создания биосенсоров [30]. Использование ПЭГ для предварительной обработки клеток приводит к образованию однородного гидратного слоя на поверхности клетки, что направляет образование силикатных капсул вокруг клеток [31]. Сравнительный анализ структур, полученных при участии двух полимерных структурообразующих агентов ПЭГ и ПВС биогибридных материалов, позволит прояснить роль химического строения гидрофильных полимеров в формировании ЗБ- архитектуры биоматрикса и предложить механизмы формирования гибридных структур при участии клеток микроорганизмов структурообразующих агентов ПЭГ и ПВС соответственно.
2. Определение степени влияния параметров золь-гель процесса (рН/катализ, прекурсоры, соотношение реагентов, время) на формирование органосиликатных капсул вокруг клеток дрожжей. Выяснение взаимосвязи между характеристиками ПЭГ, морфологией образующихся гибридных биоматериалов - иммобилизованных дрожжевых клеток и их свойствами является важным для понимания механизмов структурирования материалов в присутствии полимера с разными молекулярными массами, формой и распределением молекул в растворе. Сравнительный анализ структуры материалов, полученных в ходе золь-гель процессов при участии клеток, со структурами, полученными без участия микроорганизмов позволит выяснить влияние микроорганизмов как темплатов на формирование структур кремнеземных материалов.
З. Выяснение взаимосвязи между строением клеточных стенок микроорганизмов и самоорганизованном формировании 3D-архитектур гибридного биоматрикса как основы формирования биомиметических структур. В работе будут выявлены фундаментальные закономерности формирования органосиликатной капсулы вокруг дрожжевых клеток, что поможет глубже понять механизмы иммобилизации клеток микроорганизмов.
Заключение
Биоматериалы на основе живых клеток, иммобилизованных в силикатные матрицы с использованием мягких нетоксичных методов золь-гель химии, являются перспективными материалами для инновационного развития пищевой, фармацевтической, биотехнологической промышленности, методов защиты окружающей среды. Объединение инертных носителей с биологическими системами - идеальный способ создания стабильных «живых материалов», которые уже сейчас используют в качестве биокатализаторов. В Италии инкапсулированные клетки растений используют многие косметические и пищевые компании для получения ценных веществ, что приносит этим компаниям значительную прибыль. Промышленные компании неохотно меняют технологии, так как это требует значительных затрат. Однако возрастающие требования к экологическим нормативам заставят в скором времени все компании, которые используют технологии, далекие от «зеленых», перестраивать свое производство и внедрять новые катализаторы, в том числе на основе модифицированных силикатных материалов. В перспективе малые и средние химические и фармацевтические предприятия могут использовать биокатализаторы на основе инкапсулированных живых клеток при создании инновационных производств.
Работа выполняется при поддержке РФФИ (грант 16-43-71G1S3-р_центр_а)
Библиографический список
1. Wang S., Guo Z. Bio-inspired encapsulation and functionalization of living cells with artificial shells // Colloids Surf B Biointerfaces. 2G14. V. 113. P. 4S3-5GG.
2. Meunier C.F., Dandoy P., Su B.L. Encapsulation of cells within silica matrixes: Towards a new advance in the conception of living hybrid materials // Journal Colloid Interface Science. 2G1G. V. 342. P. 211-224.
3. Living bacteria in silica gels / N. Nassif, O. Bouvet, M. N. Rager [et al.] // Nat. Mater. 2GG2. V. 1. P. 42-44.
4. Artificial Spores: Cytocompatible Encapsulation of Individual Living Cells within Thin, Tough Artificial Shells / S.H. Yang, D. Hong, J. Lee [et al.] // Small. 2013. V. 9. P. 178-186.
5. Living hybrid materials capable of energy conversion and CO2 assimilation / C.F. Meunier, J.C. Rooke, A. Leonard [et al.] // Chemical Communications. 2010. V. 46. P. 3843-3859.
6. Dickson D.J., Ely R.L. Silica sol-gel encapsulation of cyanobacteria: lessons for academic and applied research // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2013. V. 97(5). P. 1809-1819.
7. Novel BOD optical fiber biosensor based on co-immobilized microorganisms in ormosils matrix / Ling Lina, Lai-Long Xiaoa, Sha Huang [et al.] // Biosens. Bioelectron. 2006. V. 21. P. 1703-1709.
8. Depagne C., Roux C., Coradin T. How to design cell-based biosensors using the sol-gel process // Anal. Bioanal. Chem. 2011. V. 400. P. 965-976.
9. Sol-gel silica platforms for microalgae-based optical biosensors / M. Perullini, Y. Ferro, C. Durrieu [et al.] // Journal Biotechnol. 2014. V. 179. P. 6570.
10. Use of Silica-Encapsulated Pseudomonas sp. Strain NCIB 9816-4 in Biodegradation of Novel Hydrocarbon Ring Structures Found in Hydraulic Fracturing Waters / K.G. Aukema, L. Kasinkas, A. Aksan [et al.] // Applied and Environmental Microbiology. 2014. V. 80. P. 4968-4976.
11. Fibroblast encapsulation in hybrid silica-collagen hydrogels / M.F. Desimone, C. Helary, G. Mosser [et al.] // Journal of Materials Chemistry. 2010. V. 20. P. 666.
12. Blondeau M., Coradin T. Living materials from sol-gel chemistry: current challenges and perspectives // Journal of Materials Chemistry. 2012. V. 22. P. 223-235.
13. Evaluation of sol-gel silica matrices as inoculant carriers for Mesorhizobium spp. cells, in Current Reseach, Technology and Education Topics in Applied Microbiology and Microbioal Biotechnology / G.S. Alvarez, F.L. Pieckenstain, M.F. Desimone [et al.] // A. Mendez-Vilas, Editor. 2010, FORMATEX. P. 160-166.
14. Шабанов Н.А., Саркисов П. Д. Золь-гель технологии. Нанодиспесный кремнезем. Нанотехнологии. М.: БИНОМ. Лаборатория знаний. 2012. - 331c.
15. Brinker C.J., Scherer G.W. Sol-Gel Science. The Physics and Chemistry of Sol-Gel Process. 1990, San Diego New York Boston London Sydney Tokyo Toronto: Academic Press. 908.
16. The Sol-Gel Route to Advanced Silica-Based Materials and Recent Applications / R. Ciriminna, A. Fidalao, V. Pandarus [et al.] // Chemical Reviews. 2013. V. 113. P. 6592-6620.
17. Recent bio-applications of sol-gel materials / D. Avnir, T. Coradin, О. Lev [et al.] // Journal of Materials Chemistry. 2006. V. 16. P. 1013-1030.
18. Milea C.A., Bogatu C., Duta A. The influence of parameters in silica sol-gel process // Bulletin of the Transilvania University of Brasov. Series I: Engineering Sciences. 2011. V. 4. P. 59-66.
19. Jin R.-H., Yao D.-D., Levi R. Biomimetic Synthesis of Shaped and Chiral Silica Entities Templated by Organic Objective Materials // Chemistry -A European Journal. 2014. V. 20. P. 7196-7214.
20. Synthesis of hollow silica microparticles from bacterial templates / T. Nomura, Y. Morimoto, M. Ishikawa [et al.] // Advanced Powder Technology. 2010. V. 21. P. 8-12.
21. Silicateins — A Novel Paradigm in Bioinorganic Chemistry: Enzymatic Synthesis of Inorganic Polymeric Silica. / W.E.G. Muller, Н.С. Schroder, Z. Burqhard [et al.] // Chemistry - A European Journal. 2013. V. 19. V. 5790-5804.
22. Spray-Dried Multiscale Nano-biocomposites Containing Living Cells / P.E. Johnson, Р. Muttil, D. Mackenzie [et al.] // ACS Nano. 2015. V. 9. P. 6961-6977.
23. Phospholipid Fatty Acids as Physiological Indicators of Paracoccus denitrificans Encapsulated in Silica Sol-Gel Hydrogels / J Trogl. I Jirkova, P Kuran [et al.] // Sensors. 2015. V. 15. P. 3426-3434.
24. Синтез кремнийорганических золь-гель матриц и получение на их основе гетерогенных биокатализаторов / О.А. Каманина, Д.Г. Федосеева, Т.В. Рогова [и др.] // Журнал прикладной химии. 2014. Т. 87. С. 753-759.
25. Yeast-based self-organized hybrid bio-silica sol-gels for the design of biosensors / O.N. Ponamoreva, O.A. Kamanina, V.A. Alferov [et al.] // Biosensors and Bioelectronics. 2015. V. 67. P. 321-326.
26. Silica sol-gel encapsulated methylotrophic yeast as filling of biofilters for the removal of methanol from industrial wastewater / O.A. Kamanina, D.G. Lavrova, V.A. Arlyapov [et al.] // Enzyme and Microbial Technology. 2016. V. 92. P. 94-98.
27. Понаморева О. Н., Алферов В. А., Каманина О. А. Гибридные биоматериалы на основе инкапсулированных в органосиликатные матрицы метилотрофных дрожжей и их применение в биосенсорном анализе // Известия ТулГУ. Естественные науки. 2015. Вып. 1. С. 124-132.
28. Gupta R., Chaudhury N.K. Entrapment of biomolecules in sol-gel matrix for applications in biosensors: problems and future prospects // Biosens Bioelectron. 2007. V. 22. P. 2387-2399.
29. Hybrid Silica-PVA Nanofibers via Sol-Gel Electrospinning / T. Pirzada, S.A. Arvidson, C.D. Saquing [et al.] // Langmuir. 2012. V. 28. P. 58345844.
30. Zhang Y., Ye L. Structure and property of polyvinyl alcohol/precipitated silica composite hydrogels for microorganism immobilization // Composites Part B: Engineering. 2014. V. 56. P. 749-755.
31. "Fish-in-Net", a Novel Method for Cell Immobilization of Zymomonas mobilis / X. Niu, Z. Wang, Y. Li [et al.] // PLoS ONE. 2013. V. 8. P. e79569.
Понаморева Ольга Николаевна, д-р хим. наук., доц., зав. кафедрой, [email protected], Россия, Тула, Тульский государственный университет
Biomimetic Materials: Silica sol-gel encapsulation of microbial cells
O.N. Ponamoreva
A new trend in the biomimetic materials design is the formation of silica shells around the cells. Such "living" materials can be used as biocatalysts and biomaterials for the biosensors, bioreactors, tissue engineering. We established that the 3D-architecture of silica sol-gel encapsulation cell depends on the microbial cell type. Yeasts are form the capsules around the cell. These capsules protected the cells under stress conditions (heavy metal ions, UV radiation). Bacteria ensure formation of the structures consisting of silica spheres. The bacterial cells are at the sphere surface.
Key words: biomimetic materials, encapsulated cells, sol-gel, silica, ORMOSIL, heterogeneous biocatalysts.
Ponamoreva Olga Nikolaevna, doctor of chemical sciences, associate professor, head of department, [email protected], Russia, Tula, Tula State University
