CC BY
83
УДК 602.4:628.35:664
РАЗРАБОТКА АМПЕРОМЕТРИЧЕСКОГО БПК-БИОСЕНСОРА НА ОСНОВЕ ДРОЖЖЕЙ ОЕБЛЯУОМУСЕЗ ИЛ№ЕМ1, ИММОБИЛИЗОВАННЫХ В ПОЛИМЕРНУЮ МАТРИЦУ ХИТОЗАНА
Т.Н. Козлова, Н.Ю. Юдина, Д.С. Чекмазова, Т.Н. Абрамова, В.А.Арляпов
Разработан биосенсор для определения биохимического потребления кислорода на основе дрожжей Debaryomyces hansenii, иммобилизованных в полимерную матрицу хитозана. Биосенсор на основе данного биораспознающего элемента характеризуется высоким коэффициентом чувствительности (90 ± 6 с~1^10~5) и низкой границей определяемых содержаний БПК (1,3 мг/дм3), позволяющей анализировать образцы воды категории «чистые». Разработанный рецепторный элемент устойчиво функционирует в течение длительного времени (30 суток). Использование дрожжевых клеток Debaryomyces hansenii, иммобилизованных в гель хитозана как основы рецепторного элемента биосенсора для определения БПК, позволяет получать данные с высокой корреляцией (Я=0,9987) к стандартному методу.
Ключевые слова: биосенсор, БПК, биохимическое потребление кислорода, дрожжи Debaryomyces hansenii, хитозан.
Введение
В настоящее время актуальны разработки методов и аппаратуры для экспресс-анализа проб воды. Список объектов, для которых данный тип анализа актуален, включает образцы сточных вод (муниципальных и промышленных), образцы вод, полученных из объектов окружающей среды (реки, озера, водохранилища). Одним из параметров, определяющих загрязненность проб воды, является биохимическое потребление кислорода (БПК). БПК отражает количество кислорода в мг/дм3, потребленное при окислении биоразлагаемых органических соединений. Традиционная методика определения БПК требует инкубирования насыщенной кислородом пробы в течение 5, 10 или 20 суток (БПК5, БПК10 или БПК20, соответственно) [1]. Стандартный метод определения БПК регламентирован ПНД Ф 14.1:2:3:4.123 - 97 [2]. Длительность выполнения анализа традиционным методом существенно снижает ценность этой методики.
Для оперативного анализа разрабатываются методы оценки БПК, основанные на использовании биосенсорных анализаторов. В БПК-биосенсорах в качестве распознающих элементов применяют микроорганизмы, способные метаболизировать широкий спектр органических соединений. Дрожжи устойчивы к негативным факторам окружающей среды и могут функционировать в распознающем элементе биосенсора длительное время, поэтому являются более предпочтительным биоматериалом для БПК-биосенсоров почти всех типов [3].
Перспективными микроорганизмами для использования в БПК-биосенсорах являются дрожжи рода Debaryomyces. Согласно имеющимся данным дрожжи Debaryomyces hansenii обладают широкой субстратной специфичностью и способны окислять многие спирты, углеводы, аминокислоты и другие органические вещества [4]. Известно также, что дрожжи D. hansenii устойчивы к высоким концентрациям солей [5]. Представленные особенности позволяют предположить, что эти микроорганизмы могут быть эффективно использованы для разработки БПК-биосенсора, обладающего высокой точностью измерений и устойчивостью к воздействию негативных факторов окружающей среды.
Для увеличения стабильности биорецепторного элемента применяют различные методы иммобилизации биоматериала. Эффективные методы получения иммобилизованных клеток связаны с процессами включения их в природные и синтетические гели путем перевода раствора полимера в твердую фазу за счет фазового перехода. В качестве природного гелеобразователя используют хитозан определенной молекулярной массы. Данные гели, как правило, обеспечивают высокий уровень диффузии субстратов и продуктов, а также полную невозможность для клеток покинуть матрицу геля [6, 7]. Гели хитозана характеризуются доступностью и наличием свободных функциональных групп, легко вступающих в разнообразные химические реакции, а также высокой гидрофильностью.
Таким образом, целью данной работы являлись разработка и определение характеристик амперометрического БПК-биосенсора кюветного типа на основе дрожжей Debaryomyces hansenii, иммобилизованных в полимерную матрицу хитозана.
Материалы и методы
Реактивы и материалы. Для выращивания дрожжей D. hansenii использовали D-глюкозу («Panreac», Испания), пептон («Condra», Испания), дрожжевой экстракт («Helicon», Россия). В качестве носителя для иммобилизации биоматериала использовали два вида хитозана: хитозан низкомолекулярный (США, SIGMA-ALDRICH, (448869), Мг = 20300 кДа); хитозан среднемолекулярный (США, SIGMA-ALDRICH, (448877), Мг = 200-800 кДа).
Культивирование клеток микроорганизмов. Клетки штамма дрожжей Debaryomyces hansenii BKM Y-2482 были получены из Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН (г. Пущино). Дрожжи Debaryomyces hansenii BKM Y-2482 выращивали на богатой минеральной среде (жидкая глюкозо-пептонная питательная среда). Использовали следующий состав
3 3
жидкой среды: глюкоза - 10 г/дм , пептон - 5 г/дм , дрожжевой экстракт -0,5 г/дм . Среду для выращивания клеток стерилизовали
автоклавированием при давлении в 1 атмосферу в течение 45 минут. Клетки выращивали аэробно 18-20 часов в качалочных колбах объемом 750 см3 при температуре 29 оС. Затем полученную биомассу центрифугировали при комнатной температуре при 10000 об/мин 10 минут. Далее центрифугат промывали 20 мМ фосфатным буфером рН 6,8. Осевшие клетки рассуспендировали в свежие порции буфера, распределяли по порциям и осаждали на центрифуге «Eppendorf» 5 минут при 10000 об/мин. Промытую биомассу взвешивали и хранили в микропробирках при температуре -25 °С.
Иммобилизация клеток Debaryamyces hansenii в гель хитозана. Раствор геля хитозана готовили путем растворения 1,0 г хитозана в 100 мл 1,0 %-й уксусной кислоты и перемешивания в течение 3 ч при комнатной температуре до полного растворения. Для формирования рецепторного элемента к разбавленным 1:1 дрожжам D. hansenii добавляли 100 мкл хитозана. Для распределения дрожжей в пленке проводили встряхивание в течение 5 минут на центрифуге «Sky Line». Полученную суспензию наносили на планшет (d=5 мм) и оставляли до полного высыхания. Полученную пленку помещали на поверхность кислородного электрода типа Кларка и фиксировали с помощью капроновой сетки. Последующие измерения проводились при комнатной температуре.
Биосенсорные измерения. Электрохимические измерения проводили с использованием рН-метр-иономер-БПК-термооксиметра ЭКСПЕРТ-001-4.0.1 (ООО «Эконикс-эксперт», Россия), сопряженного с персональным компьютером, работающим под управлением специализированного программного обеспечения EXP2PR (ООО «Эконикс-эксперт», Россия), позволяющего производить регистрацию и обработку сигналов сенсоров. Измеряемым параметром (ответом биосенсора) являлась максимальная скорость изменения концентрации кислорода при добавлении субстратов (мг/дм -с). Датчиками являлись кислородные электроды типа Кларка (ООО "Кронас", Россия) с иммобилизованными клетками микроорганизмов. Измерения выполнены в кювете объемом 5 мл. Для измерений использовали натрий-калиевый фосфатный буферный раствор (рН = 6,8), концентрация солей в котором составляла 20 мМ. Раствор перемешивали магнитной мешалкой (200 об/мин). Пробы вводили автоматическими микропипетками переменного объема (200 - 1000 мкл, 20 - 200 мкл, 0,5 - 10 мкл, Biotech, США). В качестве модельной использовали смесь глюкозы и глютаминовой кислоты в массовом соотношении 1:1 (ГГС), которую применяют как стандарт в определении БПК5 в Российской Федерации и международной практике [8,9]. В соответствии с нормативной документацией [8] принимали, что
33
БПК5, равное 205 мг/дм , соответствует раствору, содержащему 150 мг/дм
3
глюкозы и 150 мг/дм глутаминовой кислоты (БПК5 = 0,68хСггс).
Определение БПК5 стандартным методом разбавления. В
качестве референтного метода для определения БПК5 был использован метод разбавления. Анализ проводили в соответствии с методикой, указанной в [2]. Содержание растворенного кислорода измеряли с использованием БПК-термооксиметра ЭКСПЕРТ-001-4.0.1 (ООО «Эконикс-эксперт», Россия).
Результаты и обсуждение
Выбор марки хитозана и оптимального содержания дрожжей в рецепторном элементе. Хитозан характеризуется определенной молекулярной массой и степенью деацилирования, что влияет на качество полимерной матрицы для иммобилизации дрожжей D. Натепи. Структура хитозана и его молекулярная масса могут влиять на эффективность диффузии субстратов и продуктов, сетчатость структуры, обеспечивающей невозможность для клеток покинуть матрицу геля и окислительную активность биологического материала за счет связывания и ингибирования активных центров ферментов. Следовательно, эти факторы влияют на такую важную аналитическую характеристику, как чувствительность. Еще одной важной задачей при разработке рецепторного элемента биосенсора также является подбор оптимального содержания дрожжей D. Натепи, поскольку количество иммобилизованного биоматериала влияет на чувствительность сенсора. При увеличении содержания иммобилизованных клеток чувствительность повышается, однако большое количество включенных микроорганизмов будет негативно влиять на механические характеристики гели и, следовательно, снижать стабильность биосенсора.
Для изучения данных особенностей было изготовлено 2 рецепторных элемента с одинаковым содержанием дрожжей, но в качестве носителя использовался хитозан с различной молекулярной массой: низкомолекулярный (н/м, Мг=20-200 кДа) и среднемолекулярный (с/м, Мг=200-800 кДа); 5 рецепторных элементов из низкомолекулярного хитозана одинаковой исходной площади, но с различным содержанием клеток в них. Содержание дрожжей варьировали от 25 до 100 мг на 100 мкл геля низкомолекулярного хитозана (таблица). Выбор марки хитозана и подбор оптимального содержания дрожжей производились по нескольким параметрам, таким как операционная и долговременная стабильность, диапазон определения БПК, а также коэффициент чувствительности.
Созданные рецепторные элементы были использованы в качестве основы биосенсоров для экспресс-анализа БПК. По полученным экспериментальным данным были построены градуировочные зависимости отклика биосенсора от БПК в измерительной кювете для созданных рецепторных элементов (рис. 1).
0,12
о со
0,00 2
0 500 1000 1500 2000 2500
БПК. мг/дм3
б
БПК. мг/дм3
Рис. 1. Зависимости ответа сенсора от БПК при иммобилизации дрожжей О. Натеки в низкомолекулярный и среднемолекулярный хитозан (а) и при разных содержаниях дрожжей 2). катепи в матрице
низкомолекулярного хитозан а (б)
Биорецепторы на основе целых клеток являются биорецепторами каталитического типа, то есть биологический ответ в таких системах обеспечивается ферментативными реакциями. Поэтому зависимости, приведенные на рис.1, хорошо описываются уравнением типа Михаэлиса-Ментен (1):
у - ^тах[-3 М\
(где Утах - максимальная скорость ферментативной реакции, при которой все молекулы фермента участвуют в образовании фермент-субстратного комплекса; достигается она при концентрации субстрата [Б]—>оо; Км -эффективная константа Михаэлиса численно равная концентрации
субстрата, при которой скорость ферментативной реакции равна половине максимального значения).
Для снижения ошибок анализа использовали линейную часть градуировочной зависимости, ограниченную сверху константой Км. Нижнюю границу линейного участка рассчитывали статистическим методом, исходя из критерия относительного стандартного отклонения результатов измерения (Зг(С)) < 0,33.
В таблице представлены основные аналитические и метрологические характеристики амперометрических биосенсоров на основе дрожжей В. НатепН, иммобилизованных в полимерные матрицы хитозана.
Поскольку рецепторные элементы №1, 2 и 6 характеризуются низкой операционной стабильностью (относительное стандартное отклонение больше 10 %), то на их основе не могут быть созданы стабильные БПК-биосенсоры. Рецепторные элементы №3 и 4 с одинаковым содержанием дрожжей В. НатепН (50 мг), иммобилизованных в низкомолекулярный и среднемолекулярный хитозан соответственно, отличаются широким диапазоном определяемых концентраций БПК и высокой экспрессностью. Однако биораспознающий элемент №3 обладает более низкой нижней границей определяемых содержаний БПК, а также функционирует в течение длительного периода времени (40 суток). Поэтому для создания рецепторных элементов БПК-биосенсоров целесообразно применять иммобилизацию дрожжей в низкомолекулярный хитозан.
В целом анализируя полученные данные, был сделан вывод о том, что для дальнейшей работы наиболее перспективным является рецепторный элемент №5 с содержанием дрожжей В. НатепН 750 мг/мл геля низкомолекулярного хитозана. Выбор обусловлен тем, что биосенсор на основе данного биораспознающего элемента характеризуется высоким коэффициентом чувствительности и наименьшей нижней границей определяемых содержаний БПК, позволяющей анализировать образцы воды категории «чистые». Широкий диапазон определяемых концентраций БПК (1,3-65 мг/дм ) позволяет анализировать пробы воды без дополнительного разбавления, что также повышает точность измерений. Помимо этого разработанный рецепторный элемент устойчиво функционирует в течение длительного времени (30 суток) и не уступает по характеристикам мировым аналогам [10, 11].
Основные характеристики рецепторных элементов на основе дрожжей ВеЬагувтусез Натени, иммобилизованных в полимерную матрицу
хитозана
Характеристики Рецепторный элемент
№1 №2 №3 №4 №5 №6
Содержание дрожжей, мг/мл 250 300 500 500 750 1000
Марка хитозана н/м н/м н/м с/м н/м н/м
Коэффициент чувствительности , с-1-10-5 - - 20 ± 1 40 ± 3 90 ± 6 -
Нижняя граница определяемых содержаний, мг/дм3 - - 1,4 4,9 1,3 -
Диапазон определения БПК, мг/дм3 - - 1,4-220,0 4,9-150,0 1,3-65,0 -
Операционная стабильность (15 измерений), % 10,21 11,21 6,11 8,37 5,34 13,63
Долговременная стабильность, сутки 12 10 40 9 30 6
Экспрессность, мин 5-6 5-6 4-5 4-5 4-5 5-6
Определение спектра окисляемых субстратов разработанного рецепторного элемента. Для обеспечения правильности определения БПК необходимо, чтобы используемый рецепторный элемент окислял широкий спектр органических соединений, т.е. обладал низкой селективностью. Для определения влияния свойств полимерной матрицы хитозана на способность дрожжей В. НатепН окислять различные субстраты была оценена субстратная специфичность исследуемых клеток, иммобилизованных в низкомолекулярный и среднемолекулярный хитозан соответственно. Результаты приведены на рис. 2.
Рис. 2. Селективность рецепторных элементов на основе микроорганизмов О. Натвни, иммобилизованных в низкомолекулярный
и среднемолекулярный хитозан
При анализе профилей субстратной специфичности, представленных на рис. 2, было выяснено, что дрожжи В. НатвпН, иммобилизованных в полимерные матрицы низкомолекулярного и среднемолеклярного хитозана, наиболее интенсивно способны метаболизировать глюкозу и глутаминовую кислоту - соединения, входящие в состав ГГС, которая является стандартом при определении БПК [2]. Ценным с практической точки зрения является факт наличия ответов на додецилбензосульфат (ДДБС) натрия (компонент моющих средств), п-нитрофенол и 2,4-динитрофенол, а также отсутствие токсического действия данных субстратов при кратковременном воздействии на клетки В. НатвпН в составе биорецептора.
Таким образом, клетки В. Нansвnii, иммобилизованные в гель хитозана, способны окислять широкий круг субстратов, которые могут быть обнаружены в сточных водах, что является перспективными с точки зрения возможности их использования для оценки БПК. Свойства полимерной матрицы хитозана не оказывают существенного влияния на профиль субстратной специфичности дрожжей.
Анализ образцов воды с использованием разработанного биосенсора. Проведен анализ двенадцати образцов воды и четырех продуктов брожения крахмалистого сырья с использованием разработанного БПК-биосенсора на основе дрожжей В. Иатепп, иммобилизованных в полимерную матрицу низкомолекулярного хитозана. Пробы представляли собой сточные воды городских очистных сооружений, талые воды и продукты брожения крахмалистого сырья. Отбор проб производился в соответствии со стандартной методикой [12]. Определение БПК5 стоков стандартным методом разбавления проводилось согласно действующим нормативным документам [2]. На рис. 3 показана корреляция между значениями БПК образцов воды, определенными с помощью разработанного биосенсора, и значениями БПК, измеренными стандартным методом разбавления.
Б ПК;. мгСЪ/дм3. измеренное стандартным методом
Рис. 3. Корреляция между значениями БПК, определенными с помощью разработанного биосенсора на основе дрожжей О. Натвни, и значениями БПК, измеренными стандартным методом
Статистическая обработка полученных данных показывает, что результаты анализа стандартным методом разбавления и биосенсорным методом незначимо различаются между собой. Таким образом, разработанный биосенсор на основе дрожжевых клеток В. НатепН, иммобилизованных в полимерную матрицу низкомолекулярного хитозана, можно эффективно использовать для анализа различных образцов воды.
Заключение
Разработан рецепторный элемент БПК-биосенсора на основе дрожжей D. hansenii, иммобилизованных в полимерную матрицу хитозана. Показано, что для создания рецепторных элементов БПК-биосенсоров целесообразно применять иммобилизацию дрожжей в низкомолекулярный хитозан. Определены аналитические и метрологические характеристики биосенсоров на основе дрожжей D. hansenii, иммобилизованных в гель хитозана. Показано, что лучшими характеристиками обладает рецепторный элемент с содержанием дрожжей D. hansenii 750 мг/мл геля низкомолекулярного хитозана. Разработанный биораспознающий элемент характеризуется высоким коэффициентом чувствительности (90 ± 6 с-1 х 10-5) и наименьшей нижней границей определяемых содержаний БПК, позволяющей анализировать образцы воды категории чистые. Широкий диапазон определяемых концентраций БПК (1,3-65 мг/дм ) позволяет анализировать пробы воды без дополнительного разбавления, что также повышает точность и скорость измерений.
Показано, что дрожжи D. hansenii, иммобилизованные в полимерную матрицу хитозана, обладают широкой субстратной специфичностью - способны окислять субстраты, относящие к разным классам органических соединений. Свойства полимерной матрицы хитозана не оказывают существенного влияния на профиль субстратной специфичности дрожжей.
Проведено определение БПК воды и продуктов брожения крахмалистого сырья. Показано, что использование дрожжевых клеток D.hansenii, иммобилизованных в гель хитозана как основы рецепторного элемента биосенсора для определения БПК, позволяет получать данные с высокой корреляцией (R=0,9987) к стандартному методу.
Работа выполнена в рамках гранта Президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых российских ученых -кандидатов наук, договор № 14.756.16.5425-МК и гранта РФФИ № 16-48710959 р_а.
Библиографический список
1. Bourgeois W., Burgess J.E., Stuetz R.M. On-line monitoring of wastewater quality: a review // Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 2001. V. 76. P. 337-348.
2. ПНДФ 14. 1:2:3:4. 123-97. Количественный химический анализ вод. Методика выполнения измерений биохимической потребности в кислороде после n-дней инкубации (БПКполн) в поверхностных пресных, подземных (грунтовых), питьевых, сточных и очищенных сточных водах. М.: 1997. 25 с.
3. A flow injection analysis system with encapsulated high-density Saccharomyces cerevisiae cells for rapid determination of biochemical oxygen demand / K.S. Seo, K.H. Choo, H.N. Chang [et al.] //Applied microbiology and biotechnology. 2009. V. 83. № 2. P. 217-223.
4. A yeast co-culture-based biosensor for determination of waste water contamination levels / N.Yu. Yudina, V.A. Arlyapov, M.A. Chepurnova [et al.] // Enzyme and Microbial Technology. 2015. V. 78. P. 46-53.
5. Mechanisms underlying the halotolerant way of Debaryomyces hansenii / C. Prista, M.C. Loureiro-Dias, V. Montiel [et al.] // FEMS Yeast Research. 2005. V. 5. № 8. P. 693-701.
6. Варфоломеев, С. Д. Химическая энзимология. М.: Издательский центр «Академия», 2005. 480 с.
7. Скрябин К.Г., Вихорева Г.А., Варламов В.П. Хитин и хитозан: Получение, свойства и применение. М. : Наука, 2002. - 386 с.
8. ISO 5815-1:2003, 2003. Water Quality - Determination of Biochemical Oxygen Demand after N Days (BODn), Part 1: Dilution and Seeding Method with Allylthiourea Addition.
9. ISO 5815-2:2003, 2003. Water Quality - Determination of Biochemical Oxygen Demand after N Days (BODn), Part 2: Method for Undiluted Samples.
10. BOD biosensor based on the yeast Debaryomyces hansenii immobilized in poly (vinyl alcohol) modified by N-vinylpyrrolidone / V.A. Arlyapov, N.Yu. Yudina, L.D. Asulyan [et al.] // Enzyme and microbial technology. 2013. V. 53. №. 4. P. 257-262.
11. Methods for assessing biochemical oxygen demand (BOD): A review / S. Jouanneau, L. Recoules, M.J. Durand [et al.] // Water research. 2014. V. 49. P. 62-82.
12. ГОСТ Р 51592 - 2000. Вода, общие требования к отбору проб. -М. : ИПК Издательство стандартов. 2000. 30 с.
Козлова Татьяна Николаевна, магистрант, kozlovatatyana_1993@,mail.ru, Россия, Тула, Тульский государственный университет,
Юдина Наталья Юрьевна, аспирант, [email protected], Россия, Тула, Тульский государственный университет,
Чекмазова Дарья Сергеевна, студент, dasha-chek1996@,mail.ru, Россия, Тула, Тульский государственный университет,
Абрамова Татьяна Николаевна, студент, [email protected], Россия, Тула, Тульский государственный университет,
Арляпов Вячеслав Алексеевич, канд. хим. наук, доц., [email protected], Россия, Тула, Тульский государственный университет
DEVELOPMENTAMPEROMETRIC BOD-BIOSENSOR BASED ON YEAST DEBARYOMYCES HANSENII, IMMOBILIZED IN A POLYMER MATRIX OF
CHITOSAN
T.N. Kozlova, N.Y. Yudina, D.S. Chekmazova, T.N. Abramova, V.A. Arlyapov
It developed a biosensor for determining the biochemical oxygen consumption based on the yeast Debaryomyces hansenii, immobilized in the chitosan polymer matrix. A biosensor based on its receptor element is characterized by high sensitivity factor (90 ± 6 s-1* 105) and lower boundary defined by the BOD content (1.3 mg/dm3), which allows to analyze water samples clean category. Designed receptor element operates stably for a long time (30 days). Using yeast Debaryomyces hansenii, immobilized in chitosan gel as the basis of biosensor receptor element for determining the BOD, provides data with high correlation (R=0,9987) to the standard method.
Key words: biosensor, BOD, biochemical oxygen demand, yeast Debaryomyces han-senii, chitosan.
Kozlova Tatyana Nikolaevna, graduate student, Department of Chemistry, kozlovatatyana [email protected], Russia, Tula, Tula State University,
Yudina Natalia Yuryevna, postgraduate student, Department of Chemistry, [email protected], Russia, Tula, Tula State University,
Chekmazova Daria Sergeevna, student, Department of Chemistry, [email protected], Russia, Tula, Tula State University,
Abramova Tatiana Nikolaevna, student, Department of Chemistry, [email protected], Russia, Tula, Tula State University,
Arlyapov Vyacheslav Alexeyevich, candidate of chemical sciences, associate professor of Chemistry, Tula State University, v. a. arlyapov@gmail. com, Russia, Tula, Tula State University
