CC BY
94
Известия Тульского государственного университета Естественные науки. 2015. Вып. 2. С. 108-120
Химия =
УДК 602.4:628.35:664
Выбор основы рецепторного элемента БПК-биосенсора по субстратной специфичности и параметрам роста дрожжей ПвЬагуатусвв Напввпп *
Н. Ю. Юдина, Т. Н. Козлова, П. В. Мельников, В. А. Арляпов
Аннотация. Проведено сравнение ростовых характеристик, морфологических особенностей и субстратной специфичности дрожжей Debaryamyces hansenii У-1050, У-111, У-1585, У-2482 с целью выявления наиболее перспективного штамма для оценки индекса биохимического потребления кислорода (БПК). Наибольшая продуктивность выявлена для дрожжей D. hansenii У-1585 и У-2482. Максимальная окислительная активность наблюдается при культивировании дрожжей D. hansenii в течение 18-24 часов. Профиль субстратной специфичности всех исследуемых штаммов дрожжей Debaryamyces Ь^пнспИ различен. Наиболее перспективными штаммами для создания биосенсора для оценки индекса биохимического потребления являются дрожжи D. Ь^пнспИ У-2482 и У-1585.
Ключевые слова: дрожжи Debaryomyces hansenii, биосенсор, ростовые параметры микроорганизмов, субстратная специфичность, биохимическое потребление кислорода, БПК.
Введение
Во всем мире промышленные биотехнологические компании ведут разработку новых биокатализаторов для внедрения в различные сферы производства и особое внимание уделяется изучению дрожжей, т.к. они синтезируют белки, липиды, внеклеточные полисахариды, витамины группы В и другие необходимые вещества. Одним из направлений применения биокатализаторов на основе дрожжевых клеток является создание БПК-биосенсоров. Это направление актуально, т.к. стандартный метод определения биохимическо-
* Работа выполнена при финансовой поддержке ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы», соглашение № 14.574.21.0062 и гранта Президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых российских ученых-кандидатов наук, договор № 14^56.14.330-МК
го потребления кислорода (БПК) основан на тестах, продолжительность которых составляет 5 суток. Преимуществом использования БПК-биосенсоров является сокращение времени анализа с 5 суток до 20 минут. В зарубежной и отечественной литературе описано большое число БПК-биосенсоров на основе дрожжей [1—3], но это направление до сих пор актуально, так как не найдены микроорганизмы, удовлетворяющие всем требованиям. Дрожжи являются более предпочтительным биоматериалом для БПК-биосенсоров, поскольку устойчивы к негативным факторам окружающей среды и могут функционировать в распознающем элементе биосенсора длительное время [4,5]. Одним из перспективных видов микроорганизмов являются дрожжи Debaryamyces hansenii, т.к. они способны окислять широкий спектр органических веществ и устойчивы в средах с высоким осмотическим давлением [6,8]. Эти дрожжи первоначально были выделены из соленых сред и относятся к самым осмотолерантным дрожжам (могут выдерживать высокие концентрации солей и сахаров) [6]. Дрожжи Debaryamyces hansenii, распространены в различных пищевых продуктах (мясных, молочных и продуктах брожения соевого соуса [7]) и имеют большой биотехнологический потенциал. Особый интерес вызывает возможность культивирования данных дрожжей при солености среды до 24 %, что исключает возможность появления в куль-туральной среде нежелательных микроорганизмов. Кроме того, микроорганизмы Debaryomyces hansenii выделяют токсины, способные подавлять рост других дрожжей [8]. Данный вид дрожжей используется в промышленном масштабе для производства витамина B2 (рибофлавина), а также способен образовывать арабит [9]. Помимо сахаров дрожжи Debaryomyces hansenii способны окислять н-алканы, мелибиозу, раффинозу, растворимый крахмал, инозит, ксилозу, галактозу, молочную и лимонную кислоту [6,8,10]. Данная особенность дрожжей Debaryomyces hansenii позволяет использовать их в создании рецепторного элемента БПК-биосенсора, с целью расширения спектра окисляемых органических соединений.
Среди большого многообразия штаммов D. hansenii наиболее перспективными являются: Debaryamyces hansenii ВКМ Y-111 (Debaryomyces nicotinae var. minor) выделенные в Испании из ферментационного табака; Debaryamyces hansenii ВКМ Y-1050 (Debaryomyces sake) извлеченные из sake-moto (Япония); Debaryamyces hansenii ВКМ Y-1585 которые относились раньше к виду Candida famata; Debaryamyces hansenii ВКМ Y-2482 выделенные в Магаданской области (Россия) из мамонта Димы.
Целью данной работы является определение ростовых параметров, морфологии и субстратной специфичности дрожжей Debaryamyces hansenii Y-111, Y-1050 Y-1585 и Y-2482 для выявления наиболее эффективного биокатализатора для оценки индекса БПК.
Материалы и методы
Биосенсорные измерения. Исследования проводились с помощью многофункционального анализатора рН-метр-иономер-БПК-термооксиметр ЭКСПЕРТ-001-4.0.1 (научно-производственная фирма «Эконикс-эксперт», Москва) в режиме «термооксиметр», что позволяло производить непрерывную регистрацию сигнала. Управление прибором и обработка результатов проводилась с помощью встроенной программы «EXP2PR» (научно-производственная фирма «Эконикс-эксперт», Москва). Измеряемым параметром (ответом биосенсора) являлась максимальная скорость изменения выходного сигнала биосенсора при добавлении субстрата.
Культивирование клеток микроорганизмов. Клетки штаммов дрожжей Debaryamyces hansenii Y-111, Y-1050, Y-1585 и Y-2482 выращивали на богатой среде (жидкая глюкозо-пептонная питательная среда). Состав жидкой среды: глюкоза — 10 г/дм3, пептон — 5 г/дм3, дрожжевой экстракт — 0,5 г/дм3 (Sigma, США). Среду для выращивания клеток стерилизовали автоклавированием при давлении в 1 атмосферу в течение 45 минут. Клетки выращивали аэробно от 18 до 24 часов в качалочных колбах объемом 750 см3 при температуре 29 °С. Затем полученную биомассу центрифугировали при комнатной температуре при 8000 об/мин 10 минут. Далее центрифугат промывали 20 мМ фосфатным буфером рН 6,8. Осевшие клетки рассуспендировали в свежие порции буфера, распределяли по порциям и осаждали на центрифуге «Eppendorf» 5 минут при 8000 об/мин. Промытую биомассу взвешивали и хранили в микропробирках при температуре -25 °С.
Высев на твердую среду. Клетки микроорганизмов Debaryamyces hansenii BKM Y-1050, BKM Y-1585, BKM Y-111, ВКМ Y-2482 выращивали на твердой среде. Состав твердой среды: глюкоза — 10 г/дм3, пептон — 5 г/дм3, дрожжевой экстракт — 0,5 г/дм3 и агар-агар — 20 г/дм3. Колбы с агаризованной питательной средой стерилизовали автоклавированием, затем разливали в стерильные чашки Петри. Для посева использовали микробиологическую петлю, которую прокаливали в пламени горелки. Затем с помощью петли брали тонкую пленку жидкой суспензии из предварительно выращенной культуры. Петлей проводили по поверхности среды, делая серии штрихов. Засеянные чашки помещали в термостат (29°С).
Определение ростовых параметров дрожжевого штамма. Культивирование дрожжей проводили путём перекрывания интервалов времени, в течение которых проводилась оценка оптической плотности. Измерения оптической плотности суспензии проводили турбидиметрическим методом на фотометре Эксперт-003 при длине волны 590 нм и толщине кюветы 1 см относительно кюветы с дистиллированной водой, каждые 2 часа в течение 4 суток.
Исследование микроорганизмов методом микроскопирования.
Морфологию клеток определяли путем оптического микроскопирования. Для микроскопического анализа использовали микроскоп-тринокуляр Биомед-4 (Биомед, Россия). В ламинарном боксе на чистом предметном стекле готовили мазок исследуемых дрожжей, высушивали его на воздухе и после полного высыхания фиксировали. Затем наносили несколько капель красителя фуксина на 1-2 мин., промывали водой и подсушивали фильтровальной бумагой. На высохший препарат наносили иммерсионное масло. Готовый препарат помещали на предметный столик микроскопа и проводили исследования при увеличении в 1600 раз.
Иммобилизация клеток ВвЬатуатусвв Наиввигг. Для формирования рецепторного элемента проводили предварительное разбавление дрожжей БвЬатуатусвв Наиввигг буферным раствором рН 6,8 в соотношении 1:3. Полученною суспензию дрожжей БвЬатуатусвв Наиввигг в объеме 5 мкл наносили на диализную мембрану и фиксировали на электроде с помощью резинового кольца.
Результаты и обсуждение
Согласно имеющимся данным дрожжи БвЬатуотусвв Наиввигг обладают широкой субстратной специфичностью и способны окислять многие спирты, углеводы, аминокислоты и другие органические вещества, устойчивы к высоким концентрациям солей и высокому осмотическому давлению [6], что может быть использовано для разработки рецепторного элемента БПК-биосенсора. Для выявления эффективного биокатализатора для оценки индекса БПК из 4 штаммов дрожжей БвЬатуотусвв Наиввигг проведена оценка интегральных кривых роста, субстратной специфичности и показателей продуктивности.
Кривые роста дрожжей ПвЪатуатусвв Наиввигг. Кривые роста микроорганизмов регистрировали турбидиметрическим методом, снимая зависимость оптической плотности культуральной жидкости во времени. Хотя закон Бугера-Ламберта-Бэра, связывающий концентрацию раствора с поглощением, строго не применим для растворов, сильно рассеивающих свет, но существует линейная зависимость между поглощением света дрожжевой суспензии и количеством клеток в ней в диапазоне оптической плотности примерно до 0,3 (при оптической плотности больше 0,3 производится разбавление суспензии клеток). Количественное измерение выросших клеток после достижения фазы экспоненциального роста затруднено еще и увеличением числа мертвых клеток. Однако зависимость оптической плотности от времени достоверно показывает общий характер роста культуры микроорганизмов.
Кривые роста, полученные при пересеивании дрожжей БвЬатуатусвв Наиввигг У-1585, У-111, У-1050 и У-2482 с твердой среды — агара в жидкую глюкозо-пептонную, среду представлены на рис. 1.
Графическая зависимость оптической плотности культуральной жидкости от времени имеет сигмоидальную форму и является типичной кривой роста дрожжей [11]. На кривых роста дрожжевых штаммов можно выделить 5 фаз роста.
В период лаг-фазы видимые признаки размножения дрожжей отсутствуют, однако обменные процессы в клетках протекают активно: в среду выделяются экзо-ферменты для расщепления высокомолекулярных питательных веществ, внутри клетки синтезируются нуклеиновые кислоты и ферменты, необходимые для дальнейшего активного роста. Продолжительность лаг-фазы (адаптации) зависит от внешних условий, штаммовых особенностей дрожжей и возраста клеток и варьируется от 8 до 18 часов. Дрожжи В. Ьапвепгг У-1050 имеют самую длительную лаг-фазу (18 ч).
20 30 40
Время культивирования, часы
Рис. 1. Кривые роста дрожжей БеЬагуатусев Напввпп
Экспоненциальная фаза характеризуется интенсивным делением клеток, вследствие чего происходит накопление биомассы и продуктов жизнедеятельности клеточных культур. Клетки чувствительны к стрессовым факторам. Продолжительность экспоненциальной фазы роста для дрожжей В. Ьапвепгг У-1585 составляет 6 часов, В. Ьапвепгг У-2482 — 7 часов, В. Ьапвепгг У-111 — 8 часов, В. Ьапвепгг У-1050 - 10 часов. В замкнутой культуре фаза экспоненциального роста не может продолжаться бесконечно долго, она переходит в фазу линейного роста. В этой фазе наблюдается линейное увеличение числа микробных клеток в зависимости от времени культивирования [12]. Самая продолжительная фаза линейного роста характерна для дрожжей В. Ьапвепгг У-2482 и составляет 12 часов.
Переходная фаза (фаза замедления роста) характеризуется снижением роста клеточной культуры за счет уменьшения числа митозов, понижением
активности дыхательных ферментов, синтезом запасных углеводов. В данной фазе клетки дрожжей более устойчивы к стрессам.
В стационарной фазе происходит замедление роста культуры из-за качественного изменения среды. Число жизнеспособных клеток в популяции перестает увеличиваться. Численность популяции практически не изменяется. Для трех штаммов дрожжей В. }гапввпп У-111 , У-1050 и У-1585 наблюдается практически одновременный выход на стационар (36-40 ч).
Кривые роста дрожжей В. Напвепп, полученные для 4 различных штаммов, апроксимируются сигмоидальной зависимостью, но различаются временными интервалами прохождения стадий роста.
Приближенный анализ интегральных кривых роста дрожжей
Ю. hansenii. Результаты количественного изучения роста микроорганизмов могут быть представлены следующими параметрами: удельная скорость роста, время удвоения биомассы, метаболический коэффициент, характеризующий использование субстрата и образование продукта, максимум биомассы. В настоящей работе проведен приближенный анализ интегральных кривых роста дрожжей В. Ьапзепгг.
Таблица 1
Кинетические и количественные параметра роста клеток БвЪагуатусвв
НаиэвиИ
ЮеЬатуатусев Напвепп
Параметры У-111 У-1585 У-1050 У-2482
Кинетические параметра роста клеток ЮеЬатуатусев Напвепп
Удельная скорость роста клеточной культуры с-1 9,0 • 10-5 9,0 • 10-5 7,0 • 10-5 6•10-5
Предельная максимальная удельная скорость роста ¡лт, с-1 2, 3 • 10-4 3, 6 • 10-4 3,0 • 10-4 2, 4 • 10-4
Параметр, характеризующий сродство клеток культуры к субстрату Кз, М 0,20 0,28 0,29 0,27
Количественные параметры роста клеток ЮеЬатуатусев Напвепп
Выход биомассы (24 ч), г/дм3 6,7 15,6 3,8 14,3
Продуктивность (24 ч), г/дм3ч 0,28 0,65 0,16 0,60
Время удвоения биомассы, ч 2,1 2,1 2,75 3,2
Удельная скорость роста клеточной культуры для всех 4 штаммов дрожжей ВвЬагуатусвз Ьапвепгг имеет один порядок, следовательно, скорость процессов репликации ДНК в Б-фазе клеточного цикла для всех штаммов
примерно равна. Таким образом, все исследуемые штаммы имеют схожую длительность прохождения клеточного цикла.
Наименьшим сродством клеток к субстрату (Ks) обладает штамм дрожжей ВеЬагуатусев Ьапвепгг У-111, что определяет его низкую продуктивность (0,28 г/дм3ч). При создании рецепторных элементов биосенсоров целесообразно использование штаммов дрожжей с высокой продуктивностью. Наибольшая продуктивность и выход биомассы получены для дрожжей ВеЬагуатусев Ьапвепгг У-1585 и У-2482.
Рост культур на твердой среде. Для контроля чистоты культуры, используемой для создания рецепторного элемента БПК-биосенсора, необходимо произвести изучение морфологических особенностей отдельных колоний дрожжей В. ЬапвепИ. Для выявления морфологических различий отдельных колоний производили выращивание дрожжей В. Ьапвепгг ВКМ У-111, У-1050, У-1585, У-2482 на твердой агаризованной среде. Морфологические характеристики дрожжей В. Ьапвепгг У-1585, У-111 и У-1050 представлены в табл. 2.
Таблица 2
Морфологические характеристики колоний микроорганизмов
Параметры У-111 У-1585 У-1050 У-2482
Цвет Бесцветный Пигментированный
Размер 3 мм 2 мм 1 мм 2 мм
Форма Неправильная Круглая
Поверхность Гладкая
Профиль Кратерообразный Каплевидный Бугристый Каплевидный
Край Зубчатый Гладкий Волнистый Гладкий
Структура Мелкозернистая Однородная
Консистенция Тягучая
Блеск, прозрачность Матовая Блестящая
Все полученные колонии имеют схожее морфологическое строение, характерное для данного вида дрожжей. Так, поверхность всех изучаемых колоний дрожжей В. Ьапвепгг — гладкая; консистенция - тягучая. Отличительной особенностью дрожжей В. Ьапвепгг У-111 является крупный размер (теШссопуег^егРгоёисИБЗ мм3 мм) и неправильная форма колоний. Дрожжи В. Ьапвепгг У-1585 и У-2482 имеют идентичные параметры колоний, и для их различия необходимо исследование культур методом светового микроскопирования.
Исследование культур методом светового микроскопирования.
Исследование морфологии дрожжей В.Ьапвепгг осуществляли методом светового микроскопирования клеток, выращенных в течение 24 часов, посколь-
ку форму и размеры вегетативных клеток, а также характер вегетативного размножения наблюдают на 24-48-часовых культурах. Для работы использовали микроскоп Биомед-4.
Рис. 2. Морфология дрожжей БвЪагуатусвв Наиэвип: а - У-111, б - У-2482, в - У-1050, г - У-1585 (окраска фуксином, увеличение в 1600 раз)
Клетки дрожжей В. Ьапвепп У-1050, У-111, У-2482 крупные, имеют округлую форму с ярко выраженной оболочкой. На рис. 2,в видно много маленьких отпочковывающихся клеток, что характерно для фазы экспоненциального роста. На остальных фотографиях делящихся клеток меньше, что характерно для линейной фазы роста. Дрожжи В. Ьапвепгг У-1585 сильно отличаются от трех других штаммов и имеют вытянутую форму. Таким образом, для контроля чистоты выросшей культуры и отличия отдельных штаммов можно использовать высев на твердые питательные среды и оптическую микроскопию.
Выбор оптимального времени культивирования. Для получения рецепторного элемента с наибольшей активностью необходимо провести выбор оптимального времени культивирования. Для выбора оптимального времени культивирования дрожжей ВеЬагуатусев Ьапвепгг У-1050, У-111, У-1585, У-2482 была проанализирована зависимость окислительной активности рецепторного элемента от стадии роста. Для выполнения анализа был произведен отбор проб клеток после 16, 18, 20, 24, 32, 38 и 50 часов культивирования и иммобилизация на кислородном электроде типа Кларка. Принцип работы микробного сенсора на основе кислородного электрода основан на том, что при окислении субстрата иммобилизованными на поверхности кис-
лородного электрода микроорганизмами возрастает их дыхательная активность, и в приэлектродном пространстве снижается концентрация кислорода, что регистрируется с помощью электрода. В качестве субстрата использовали раствор глюкозо-глутаминовой смеси (ГГС), т.к. он применяется в качестве стандарта при определении БПК [13].
1 10 20 30 40 50 60
Время культивирования, часы
Рис. 3. Окислительная активность дрожжей ВеЪагуатусев Напввпп
У-1050
Для всех четырех штаммов зависимости окислительной активности от стадии роста имеют схожий характер. Наибольшая активность клеток ВвЬагуатусвз Напзвпп У-1050 (рис. 3) и У-1585 наблюдается в середине экспоненциальной фазы роста (20-24 ч), дрожжей ВвЬагуатусвз Напзвпп У-111 и У-2482 при 18-20 часах роста. Таким образом, оптимальное время культивирования дрожжей ВвЬагуатусвз Напзвпп находится в интервале от 18 до 24 часов, поскольку достигаются высокая окислительная активность и достаточная продуктивность.
Субстратная специфичность дрожжей ПвЪатуатусвв Наиввигг.
Для определения интегрального показателя качества воды, такого как биохимическое потребление кислорода, необходимо использовать микроорганизмы, способные окислять широкий спектр органических соединений, которые могут быть обнаружены в сточных водах.
Анализ литературных данных по применению дрожжей ВвЬагуатусвз Напзвпп, показал, что данный вид дрожжей способен функционировать в соленых средах и окислять широкий спектр субстратов [8,14].
В работе проведена оценка субстратной специфичности дрожжей ВвЬагуатусвз Напзвпп, закрепленных на кислородном электроде с помощью диализной мембраны по 24 субстратам, относящимся к разным классам органических соединений (рис. 4). В качестве субстратов были выбраны
органические вещества, наиболее часто встречающиеся в стоках пищевых и технологических производств.
Рис. 4. Субстратная специфичность дрожжей БеЬагуатусев Напввпп
Дрожжи В. Ьапвепгг У-1585 и У-111 обладают наибольшей чувствительностью к сахарозе, В. Ьапзепгг У-2482 — к глюкозе, ответы на них были приняты за 100 %. Для дрожжей ВеЬагуатусез Ьапзепгг У-1050 максимальный ответ сенсора был зафиксирован на аминокислоту серин и принят за 100 %.
Величина отклика на спирты для дрожжей ВеЬагуатусез Ьапвепгг У-1585, У-1050, У-2482 и У-111 уменьшается по мере увеличения углеводородного радикала. Данная особенность может быть объяснена меньшей проницаемостью крупных и разветвленных молекул спиртов к активным центрам ферментов. Отличительной чертой дрожжей В. Ьапзепгг У-2482, позволяющей использовать эти микроорганизмы для анализа образцов сточных вод лике-роводочных предприятий, является их способность давать высокие ответы на спирты (30-70 %). Дрожжи В. Ьапвепгг У-111 хорошо окисляют глицерин, данная особенность согласуется с литературными данными [15]. Следующий класс анализируемых субстратов — углеводы. Самый большой ответ для всех штаммов дрожжей был получен на сахарозу, он составил 60-100%. Высокие ответы могут быть обусловлены высокой активностью фермента инвертазы, расщепляющего дисахарид сахарозу на а-глюкозу и ^-фруктозу, и последующим окислением этих моносахаридов. Наибольшее электрокаталитическое окисление аминокислот зафиксировано для дрожжей штамма В. Ьапвепгг У-2482.
Окисление этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) дрожжами В. Ьапзепгг У-1050, У-2482, У-1585 является важным с практической точки зрения, т.к. ЭДТА используется в производстве бытовой химии и синтетических
моющих средств, а также при промывке теплоэнергетического оборудования, труб, котлов.
Бензоат калия — пищевая добавка, оказывающая угнетающее действие на дрожжи, подавляя активность ферментов в клетке. Ответ сенсора на основе дрожжей В. Напзвпп У-1050, У-2482, У-1585, У-111 варьировался от 18 до 38 %.
Ценным с практической точки зрения является факт наличия ответов на додецилсульфат (ДДС) натрия, а также отсутствие токсического действия данных субстратов при кратковременном воздействии на клетки ВвЬагуатусвз Напзвпп в составе биорецептора. На данный субстрат были зафиксированы ответы для штаммов дрожжей ВвЬагуатусвз Напзвпп У-2482, У-1585, У-111.
Таким образом, наиболее широкой субстратной специфичностью обладают дрожжи В. Напзвпп У-2482. Субстратная специфичность дрожжей В. Напзвпп У-1050, У-2482, У-1585, У-111, относящихся к одному роду, различается в пределах штамма. Все исследуемые микроорганизмы окисляют сахара, аминокислоты, спирты и другие органические вещества. Перспективными штаммами для дальнейшего применения для оценки индекса биохимического потребления является дрожжи В. Напзвпп У-2482 и У-1050. Для оценки БПК в сточных водах с высоким содержанием спиртов наиболее эффективным является применение дрожжевого штамма В. Напзвпп У-2482, а в водах с высокой концентрацией аминокислот — дрожжевого штамма В. Напзвпп У-1050.
Выводы
Проведен приближенный анализ интегральных кривых роста дрожжевых штаммов ВвЬагуатусвз Напзвпп У-1050, У-111, У-1585, У-2482. Наибольшая продуктивность наблюдается для дрожжей В. Напзвпп У-1585 (0,65 г/дм3ч) и У-2482 (0,60 г/дм3ч). Оптимальное время культивирования дрожжей В. Напзвпп У-1050, У-1585 находится в интервале от 20 до 24 часов, а для дрожжей В. Напзвпп У-111, У-2482 максимальная окислительная активность наблюдается при культивировании в течение 18-20 часов. Клетки дрожжей В. Напзвпп У-1050, У-111, У-2482 крупные, имеют округлую форму с ярко выраженной оболочкой, дрожжи В. Напзвпп У-1585 овальной формы. Поверхность всех изучаемых колоний дрожжей В. Напзвпп - гладкая; консистенция - тягучая. Определен профиль субстратной специфичности дрожжей ВвЬагуатусвз Напзвпп. Все исследуемые микроорганизмы окисляют сахара, аминокислоты, спирты и другие органические вещества. Таким образом, наиболее перспективным штаммом для дальнейшего применения для оценки индекса биохимического потребления является дрожжи В. Напзвпп У-2482, поскольку обладают высокой продуктивностью и широкой субстратной специфичностью.
Список литературы
1. Микробные биосенсоры для определения биологического потребления кислорода (обзор)/ О.Н. Понаморева, В.А. Арляпов, В.А. Алфёров, А.Н. Решетилов // Прикладная биохимия и микробиология. 2011. Т. 47. № 1. С. 5-15.
2. A new BOD estimation method employing a double-mediator system by ferricyanide and menadione using the eukaryote Saccharomyces cerevisiae / H. Nakamura, K. Suzuki, H. Ishikuro, S. Kinoshita, R. Koizumi, S. Okuma, M. Gotoh, I. Karube // Talanta. 2007. V. 72. № 1. P. 210-216.
3. Biosensor analyzer for bod index express control on the basis of the yeast microorganisms Candida maltosa, Candida blankii, and Debaryomyces hansenii / V. Arlyapov, S. Kamanin, O. Ponamoreva, A. Reshetilov // Enzyme and Microbial Technology. 2012. V. 50. № 4-5. P. 215-220.
4. A flow injection analysis system with encapsulated high-density Saccharomyces cerevisiae cells for rapid determination of biochemical oxygen demand / K.S. Seo [et al.] // Applied microbiology and biotechnology. 2009. V. 83. № 2. P. 217-223.
5. Quick and reliable estimation of BOD load of beverage industrial wastewater by developing BOD biosensor / P. Dhall [et al.] // Sensors and Actuators B: Chemical. 2008. V. 133. № 2. P. 478-483.
6. Draft genome sequence of salt-tolerant yeast Debaryomyces hansenii var. hansenii MTCC 234 / S. Kumar [et al.] // Eukaryotic cell. 2012. V. 11. № 7. P. 961-962.
7. Kurtzman C., Fell J. W., Boekhout T. The yeasts: a taxonomic study. Т. 1. London: Elsevier, 2011.
8. Breuer U., Harms H. Debaryomyces hansenii — an extremophilic yeast with biotechnological potential // Yeast. 2006. V. 23. № 6. P. 415-437.
9. Gonzalez-Hernandez J.C. Molecular cloning and characterization of STL1 gene of Debaryomyces hansenii // J. of Yeast and Fungal Research. 2010. V. 1. № 4. P. 62-72.
10. Genomic Exploration of the Hemiascomycetous Yeasts: 14. Debaryomyces hansenii var. Hanseni / A. Lepingle [et al.] // FEBS letters. 2000. V. 487. № 1. P. 82-86.
11. Меледина Т.В., Давыденко С.Г., Васильева Л.М. Физиологическое состояние дрожжей: учебное пособие. СПб.: НИУ ИТМО; ИХиБТ, 2013. 48 с.
12. Варфоломеев С.Д., Гуревич К.Г. Биокинетика: практический курс. М.: Фаир-пресс, 1999. 720 с.
13. ПНДФ 14. 1:2:3:4. 123-97. Количественный химический анализ вод. Методика выполнения измерений биохимической потребности в кислороде после п-дней инкубации (БПКполн) в поверхностных пресных, подземных (грунтовых), питьевых, сточных и очищенных сточных водах. М., 1997. 25 с.
14. BOD biosensor based on the yeast Debaryomyces hansenii immobilized in poly (vinyl alcohol) modified by N-vinylpyrrolidone Hanseni / V.A. Arlyapov [et al.] // Enzyme and microbial technology. 2013. V. 53. № 4. P. 257-262.
15. Kurtzman C.P., Fell J.W. The Yeasts, A Taxonomic Study. Peoria, Illinois: Elsevier, 1998. 1055 p.
Юдина Наталья Юрьевна (tysia21-05-90@mail.ru), аспирант, кафедра химии, Тульский государственный университет.
Козлова Татьяна Николаевна, студент, кафедра биотехнологии, Тульский государственный университет.
Мельников Павел Валентинович, к.ф.-м.н., доцент, кафедра физической химии, Московский государственный университет тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова.
Арляпов Вячеслав Алексеевич (v.a.arlyapov@gmail.com), к.х.н., доцент, кафедра химии, Тульский государственный университет.
Select of the receptor element BOD biosensor based on substrate specificity and growth parameters of yeast Debaryamyces hansenii
N.Yu. Yudina, T.N. Kozlova, P.V. Melnikov, V.A. Arlyapov
Abstract. In this research we compared the growth characteristics, and morphological traits and the substrate specificity of yeast Debaryamyces hansenii Y-1050, Y-111, Y-1585, Y-2482 in order to identify the most promising strain for biochemical oxygen demand (BOD) assessment. The highest productivity was discoved for the yeast D. hansenii Y-1585 and Y-2482. Maximum oxidation activity of D. hansenii yeast was after 18-24 hours of culturation. Profile substrate specificity of the studed strains of yeast Debaryamyces hansenii was different. Yeast D. hansenii Y-2482 and Y-1585 was the most promising to create a biosensor for biochemical demand assessment.
Keywords: biosensor, biochemical oxygen demand, BOD, yeast Debaryomyces hansenii.
Yudina Natal'ya (tysia21-05-90@mail.ru), postgraduate student, department of chemistry, Tula State University.
Kozlova Tatiana, student, department of biotechnology, Tula State University.
Melnikov Paul, candidate of physical and mathematical sciences, associate professor, department of physical chemistry, Lomonosov Moscow State University of Fine Chemical Technologies.
Arlyapov Vyacheslav (v.a.arlyapov@gmail.com), candidate of chemical sciences, associate professor, department of chemistry, Tula State University.
Поступила 03.02.2015
