CC BY
119
Известия Тульского государственного университета Естественные науки. 2011. Вып. 2. С. 288-297
Химия
УДК 602.4:628.35:664
Устойчивость во времени ассоциации дрожжевых микроорганизмов Р{сК{о angusta, АгхиЫ од^впшоуогопв и Debaryamyces Нашвпш *
В. А. Арляпов, Д. П. Вельмякин, М. А. Чепурнова, Е. Е. Бабкина,
В. А. Алферов
Аннотация. Изучена устойчивость во времени ассоциации дрожжей ПеЫй апд^Ьа БЕЖ У-2518, Лгхп1а adeninovorans ВГИ 78(6) и БеЬатуатусе8 Нашепп БКМ У-2482. Методами высева на твердую питательную среду, светового микроскопирования и методом с использованием амперометрического биосенсора показано что, через шесть недель после создания ассоциации доминирующим штаммом в ней является Р. апдп8Ьа, что связано с более высокой скоростью роста данных микроорганизмов.
Ключевые слова: биосенсор, биохимическое потребление
кислорода, БПК, ассоциации микроорганизмов, РсЫа апдп8Ьа,
Лгхп1а adeninovorans, БеЬатуатусе8 Натепп.
Введение
Для оценки степени загрязненности воды в настоящее время широко применяется параметр, определенный как «индекс биохимического потребления кислорода» (БПК). Продолжительность классических тестов для определения БПК составляет 5 суток и более, что неприемлемо в ряде случаев [1]. Для оперативного анализа разрабатываются методы оценки БПК, основанные на использовании биосенсорных анализаторов [2].
В БПК-биосенсорах в качестве распознающих элементов применяют микроорганизмы, способные метаболизировать широкий спектр органических соединений. Для создания биораспознающих элементов БПК-сенсоров используют либо чистые культуры микроорганизмов с определенными
* Работа выполнена при поддержке ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы», госконтракт № 16.512.11.2209 и программы «СТАРТ-11», реализуемой Фондом содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере, госконтракт № 9373р/15101.
потребительскими свойствами (широкий спектр окисляемых субстратов, устойчивость к воздействию негативных факторов окружающей среды), либо ассоциации микроорганизмов (искусственные ассоциации, активный ил) [3]. Использование ассоциаций микроорганизмов позволяет существенно повысить спектр окисляемых субстратов и, соответственно, правильность определения БПК. В то же время БПК-биосенсоры на основе ассоциаций микроорганизмов могут иметь недостаточную стабильность, причиной которой является изменение состава ассоциации с течением времени [4].
БПК — биосенсоры, основанные на сложной микробной популяции, такой как в активном иле, имеют наилучшую способность к детекции широкого спектра субстратов, однако из-за нестабильности консорциума в течение времени, такие биосенсоры дают наименее воспроизводимые результаты. Для увеличения числа окисляемых субстратов при сохранении воспроизводимости ответов биосенсора чаще всего используют ассоциации микроорганизмов, состоящие не более чем из двух или трех штаммов [5]. Это приводит к расширению субстратной специфичности и стабилизации функционирования сенсора в течение длительного периода времени.
В качестве биокатализаторов при разработке БПК-биосенсоров используют целые клетки бактерий (Bacillus polymyxa, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida) и дрожжей (Arxula adeninivorans, Hansenula anomala, Trichosporon cutatenium, Serratia marcescens, Saccharomyces cerevisiae) [6]. Дрожжи являются более предпочтительным биоматериалом для биосенсоров почти всех типов, поскольку устойчивы к негативным факторам окружающей среды и могут функционировать в распознающем элементе биосенсора длительное время [7, 8]. В случае совместной иммобилизации дрожжевых и бактериальных клеток бактерии могут вытеснять дрожжи через 20 дней работы [9], поэтому при создании рецепторных элементов БПК-биосенсоров на основе ассоциаций микроорганизмов лучше использовать только дрожжевые клетки.
Целью настоящей работы являлось определение стабильности во времени ассоциации дрожжевых микроорганизмов Pichia angusta BKM Y-2518, Arxula adeninovorans ВГИ 78(6) и Debaryamyces hansenii BKM Y-2482.
Материалы и методы
Культивирование биомассы дрожжевых микроорганизмов.
Клетки штаммов Debaryomyces hansenii BKM Y-2482, Pichia angusta ВКМ Y-2559 и Arxula adeninovorans ВГИ 78(6) были получены из Всероссийской коллекции микроорганизмов УРАН Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина (г. Пущино).
Микроорганизмы Debaryamyces hansenii выращивали на богатой среде следующего состава: глюкоза — 10 г/дм3, пептон — 5 г/дм3, дрожжевой экстракт — 0,5 г/дм3, при температуре 28°С как описано в [10]. После культивирования клетки собирали центрифугированием при 4500 об/мин в
течение 1Б минут и отмывали двукратно 20 мМ натрий-фосфатным буфером с рН б,8. Промытую биомассу взвешивали и хранили в микропробирках при +4°С.
Микроорганизмы Pichia angusta ВКМ Y-2559 выращивали в жидкой среде при температуре 280С в среде следующего состава (г/дм3): (NH4)2SO4
— 2,Б; MgSO4 7H2O — 0,4; K2HPO4-3H2O - 0,9; Na^PO4-2H2O — 3,9; дрожжевой экстракт — 0,Б; глицерин — 10; MnSO4 — 0,0012; CoC12^6 H2O
— 0,0003; (NH4)6Mo7O24-4H2O — 0,0002; CaCh^O — 0,001Б; FeSO4^7^O
— 0,01; ЭДТА — 0,001, как описано в [11]. После культивирования клетки собирали центрифугированием при 4Б00 об/мин в течение 1Б минут и отмывали двукратно 20 мМ натрий-фосфатным буфером с рН б,8. Промытую биомассу взвешивали и хранили в микропробирках при +40С.
Микроорганизмы Arxula adeninovorans ВГИ 78(б) культивировали в аэробных условиях при 370C 24 часа в питательной среде следующего состава: 0,3% пептон, 0,3% мясной экстракт, 0,3% дрожжевой экстракт и 1,0% глюкоза, как описано в [12]. После культивирования клетки собирали центрифугированием при 4Б00 об/мин в течение 1Б минут и отмывали двукратно 20 мМ натрий-фосфатным буфером с рН б,8. Промытую биомассу взвешивали и хранили в микропробирках при +40С.
Получение кривых роста дрожжевых штаммов. Кривые роста микроорганизмов регистрировали спектрофотометрическим методом, снимая зависимость оптической плотности культуральной жидкости от времени. Измерения оптической плотности суспензии проводили на спектрофотометре СФ-103 (Аквилон, Россия) при длине волны Б40 нм и толщине кюветы 1 см относительно кюветы с дистиллированной водой, каждые 2 часа в течение 2 суток.
Исследование штаммов методом микроскопирования.
Микроскопические исследования проводились на микроскопе проходящего света Биомед-б (Россия). Для этого брали ранее выращенные штаммы Pichia angusta, Arxula adeninovorans, Debaryamyces hansenii и ассоциацию трех штаммов. В ламинарном боксе на стерильное предметное стекло наносили несколько капель красителя фуксина. Затем прокаленной петлей наносили на краситель немного клеток, тщательно перемешивали и оставляли до полного высыхания. На высохший препарат наносили имерсионное масло. Готовый препарат помещали на предметный столик микроскопа и проводили исследования.
Исследование штаммов при высеве на твердую питательную среду. Клетки дрожжей Pichia angusta, Arxula adeninovorans, Debaryamyces hansenii и их ассоциацию выращивали на твердой среде LB, содержащей 10 г пептона, Б г дрожжевого экстракта, Б г хлорида натрия и 1б г агара на 1 л раствора. Полученные колбы с агаром стерилизовали автоклавированием, затем разливали в стерильные чашки Петри. Высев микроорганизмов
проводили в чашки Петри со стерильной средой LB методом «истощающего штриха». Засеянные чашки помещали в термостат (280С) на 3 суток.
Биосенсорные измерения. Электрохимические измерения проводили с использованием гальванопотенциостата IPC 2L (Кронас, Россия), интегрированного с персональным компьютером, и специализированного программного обеспечения IPC-micro (Кронас, Россия) для регистрации и обработки сигналов сенсоров. Средняя величина тока, соответствующая содержанию кислорода в дистиллированной воде 9,2 мг/дм3, составляла 30 нА при шуме 0,2Б нА. Измерения выполнены в кювете объемом Б мл. Для измерений использовали натрий-калиевый фосфатный буфер (рН = б,8), концентрация солей составляла 20 мМ. Раствор перемешивали магнитной мешалкой (200 об/мин). Пробы вводили автоматическими микропипетками переменного объема (200-1000 мкл, 20-200 мкл) («Ленпипет», Россия).
Выращенные клетки микроорганизмов непосредственно перед иммобилизацией промывали фосфатным буферным раствором (20 мM, pH б.8), центрифугировали, осадок сырой массы клеток взвешивали и разбавляли буферным раствором до концентрации 200 мг/см3. Для приготовления рецепторного элемента на основе трех штаммов суспензии отдельных культур дрожжей смешивали в соотношении 1:1:1 после чего Б мкл полученного раствора наносилось на стекловолоконный фильтр GF/A (Sigma) размером 3x3 мм. Рецепторный элемент подсушивали в течение Б-1Б минут и фиксировали с помощью капроновой сетки на электроде.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В работе были использованы дрожжевые штаммы Debaryomyces hansenii BKM Y-2482, Arxula adeninovorans ВГИ (78)-б и Pichia angusta ВКМ Y^18. Дрожжи вида Arxula adeninovorans обладают широкой субстратной специфичностью и активно используются для анализа БПК с использованием биосенсора [9, 13]. Дрожжи Pichia angusta отличается высокой чувствительностью к спиртам [14]. Дрожжи Debaryomyces hansenii также отличаются широкой субстратной специфичностью и устойчивостью к негативным факторам окружающей среды [10]. Таким образом, рецепторный элемент на основе ассоциации этих микроорганизмов будет сочетать в себе широкую субстратную специфичность, высокую чувствительность и устойчивость к неблагоприятным условиям среды.
Были получены кривые роста дрожжевых штаммов A. adeninovorans, P. angusta и D. hansenii. Кривую роста микроорганизмов регистрировали спектрофотометрическим методом, снимая зависимость оптической плотности культуральной жидкости от времени.
Проводя сравнительный анализ кривых роста можно отметить, что дрожжи Debaryamyces hansenii имеют более длительную лаг-фазу (21 час). А штамм A. adeninovorans имеет длительные фазы экспоненциального, линейного и замедления роста, что приводит к более позднему выходу
Таблица 1
Фазы роста исследуемых дрожжевых микроорганизмов
Arxula adeninovorans ВГИ (78)-6 Pichia angus-ta BKM Y-2518 Debaryomyces hansenii BKM Y-2482
Лаг-фаза, ч 0-12 0-8 0-21
Экспоненциальная фаза, ч 12-20 8-10 21-24
Фаза линейного роста, ч 20-30 10-14 24-26
Фаза замедления роста, ч 30-38 14-24 26-30
Стационарная фаза, ч 38-42 24-42 30-42
на стационарную фазу. На кривой роста штамма Pichia angusta наиболее длительной фазой, по сравнению с другими штаммами, была фаза замедления роста, которая началась уже через 14 часов посева. Таким образом, микроорганизмы P. angusta имеют большую скорость роста чем A. adeninovorans, D. hansenii.
Для изучения устойчивости во времени созданной ассоциации дрожжевых микроорганизмов было проведено исследование субстратной специфичности рецепторных элементов биосенсора на основе отдельных дрожжевых штаммов A. adeninovorans, D. hansenii, P. angusta и их ассоциации. Клеточное дыхание регистрировали, используя кислородный электрод типа Кларка, на поверхности которого располагали рецепторный элемент. В качестве метода иммобилизации применялась адсорбция на стекловолокне. Данный способ иммобилизации в силу своей простоты и безреагентности позволяет в меньшей степени разрушать клетки.
Оценка субстратной специфичности ассоциации иммобилизованных микроорганизмов P. аngusta, A. adeninovorans и D. hansenii проведена с использованием субстратов, относящихся к различным классам органических соединений: спирты, углеводы, аминокислоты, карбоновые кислоты, альдегиды. За 100% был принят максимальный сигнал каждого сенсора, ответы сенсора на остальные субстраты даны в процентных отношениях к максимальному ответу (рис. 1).
Установлено, что штамм P. angusta хорошо окисляет спирты, органические кислоты и альдегиды. Сенсор на основе дрожжевого штамма D. hansenii дает высокие ответы на спирты и углеводы, а так же на органические кислоты и альдегиды. К достоинствам сенсора на основе штамма A. adeninovorans можно отнести его способность к окислению органических кислот и альдегидов.
Рис. 1. Субстратная специфичность рецепторных элементов: а — рецепторные элементы на основе отдельных штаммов микроорганизмов; б — рецепторные элементы на основе ассоциации микроорганизмов в разное время после создания
При изучении субстратной специфичности рецепторных элементов на основе ассоциаций дрожжевых штаммов в промежутке времени 6 недель показано, что к третьему измерению в составе ассоциации остались практически только клетки дрожжевого штамма Ріокіо опди80 Об этом свидетельствует наличие ответов биосенсора на метанол, пропанол, глицерин, муравьиную кислоту, формальдегид и отсутствие ответов на третбутанол, который не окисляется микроорганизмами Ріокіо опди8Іо и маннозу и глутаминовую кислоту, которые плохо окисляются данными микроорганизмами. Однако наличие ответа биосенсора на основе ассоциации микроорганизмов на глюкозу в течение всего времени эксперимента свидетельствует о некоторой выживаемости и других микроорганизмов, входящих в ассоциацию.
Для изучения вида колоний микроорганизмы Ріокіо опди8Їо, Агх-иіо оСвпіпоуогоп8 и БвЬагуотуов8 котвпіі выращивали на твердой агаризованной среде ЬБ. У всех штаммов колонии белые, пастообразные. Единичные колонии штаммов А. осівпіпоуотт и Р. опди8Їо четко выражены. Колонии Б. коп8впіі не выражены, рост сплошным газоном.
Высаживание ассоциации трех культур микроорганизмов на твердую среду проводили три раза в промежутке времени три недели. Внешний вид колонии микроорганизмов, высеянных через шесть недель после создания ассоциации заметно изменился, плотность газона уменьшилась, увеличилось число единичных клеток. Внешне вид колонии третьего посева напоминал колонии штамма Р. опди8Ьо.
Культуры микроорганизмов и их ассоциации, высеянные на твердой среде, исследовались методом светового микроскопирования. Фотографии под микроскопом отдельных штаммов микроорганизмов и их ассоциации представлены на рис. 2.
Рис. 2. Фотографии под микроскопом отдельных штаммов микроорганизмов и их ассоциаций. а — фотография микроорганизмов Arxula adeninovomns; б — фотография микроорганизмов Debaryamyces hansenii; в — фотография микроорганизмов Pichia angusta; г — фотография ассоциации микроорганизмов в момент создания; д — фотография ассоциации микроорганизмов через 6 недель после
создания
Из проведенных микроскопических исследований видно, что клетки микроорганизмов А. айеитоуогаив имеют четко выраженную палочковидную форму, клетки В. Наивеип имеют овальную форму, а клетки Р. аидпв1а крупные, имеют шаровидную форму.
В образцах первого посева ассоциации (рис. 2, г) отчетливо видны клетки всех трех штаммов. В образцах второго посева также присутствуют клетки трех штаммов, но количество клеток дрожжей А. айеитоуогаив и В. Наивеип уменьшилось. В образцах третьего посева (рис. 2, д) четко видны только клетки Р. аидпвЬа.
Таким образом, ассоциация трех штаммов в пропорции 1:1:1 за шесть недель заметно изменилась, доминирующим стал штамм Р. аидпв1а. Скорее всего это связано с более высокой скоростью роста данных микроорганизмов (см. табл. 1). Исходя из полученных данных, при создании ассоциаций микроорганизмов рекомендуется использовать штаммы с близкими скоростями роста.
Выводы
Спектрофотометрическим методом анализа были получены кривые роста дрожжевых штаммов Debaryomyces hansenii BKM Y-2482, Arxula adeninovorans ВГИ (78)-6 и Pichia angusta ВКМ Y-2518 в жидкой глюкозо-пептонной среде и определена длительность каждой стадии роста. Выявлено, что микроорганизмы P. angusta имеют большую скорость роста чем A. Adeni-novorans и D. hansenii.
Изучено изменение субстратной специфичности ассоциации микроорганизмов Debaryomyces hansenii, Arxula adeninovorans и Pichia angusta с течением времени. Показано, что через шесть недель после создания ассоциации ее субстратная специфичность наиболее соответствует субстратной специфичности микроорганизмов P. angusta.
Дрожжевые штаммы Debaryomyces hansenii, Arxula adeninovorans и Pichia angusta и их ассоциация были изучены методом микроскопирования с использованием оптического микроскопа. Показано, что через шесть недель после создания ассоциации доминирующим штаммом в ней является P. angusta.
Полученные данные показывают, что в ассоциации микроорганизмов Debaryomyces hansenii, Arxula adeninovorans и Pichia angusta с течением времени начинают значительно преобладать микроорганизмы Pichia angusta. Скорее всего это связано с более высокой скоростью роста данных микроорганизмов. Таким образом, при создании ассоциаций микроорганизмов рекомендуется использовать штаммы с близкими скоростями роста.
Список литературы
1. ПНДФ 14. 1:2:3:4. 123-97. Количественный химический анализ вод. Методика выполнения измерений биохимической потребности в кислороде после п-дней инкубации (БПКполн) в поверхностных пресных, подземных (грунтовых), питьевых, сточных и очищенных сточных водах. М.: 1997. 25 с.
2. D’Souza S.F. Microbial biosensors // Biosens. Bioelectron. 2001. V.16. Р.337-353.
3. Rodriguez-Mozaz S., de Alda M.J.L, Barcelo D. Biosensors as useful tools for environmental analysis and monitoring // Anal. Bioanal. Chem. 2006. V.386, №4, Р.1025-1041.
4. Теория и применение микробных биосенсоров для оперативного мониторинга биохимического потребления кислорода / О.Н. Понаморева [и др.] // Вестник биотехнологии. 2009. Т.5, №1. C.42-48.
5. The use of co-immobilization of Trichosporon cutaneum and Bacillus licheniformis for a BOD sensor / L. Suriyawattanakul [et al.] // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002. V.59, №1. P.40-44.
6. Микробные биосенсоры для определения биологического потребления кислорода / О.Н. Понаморева [и др.] // Прикладная биохимия и микробиология. 2011. Т.47, №1. C.5-15.
7. A flow injection analysis system with encapsulated high-density Saccharomyces cerevisiae cells for rapid determination of biochemical oxygen demand / K.S. Seo [et al.] // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2009. V.83, №2. P.217-223.
8. Quick and reliable estimation of BOD load of beverage industrial wastewater by developing BOD biosensor / P. Dhall [et al.] // Sens. Act. B. 2008. V.133, №2. P.478-483.
9. Measurement of biodegradable substances using the salt-tolerant yeast Arxula adeninivorans for a microbial sensor immobilized with poly(carbamoyl)sulfonate (PCS): Part II: application of the novel biosensor to real samples from coastal and island regions / M. Lehmann [et al.] // Biosensors and Bioelectronics. V.14, Iss.3. P.295-302.
10. Биосенсор для экспресс-анализа биохимического потребления кислорода на основе дрожжевых микроорганизмов родов Candida и Debaryomyces / О.Н. Понаморева [и др.] // Вестник биотехнологии. Т.6, №3. 2010. C.5-12.
11. Применение низкоселективных микробных биосенсоров для определения содержания компонентов в многокомпонентных водных средах / В.А. Арляпов [и др.] // Сенсорные системы. 2011. Т.25, №3.
12. Микробные биосенсоры для экспресс-определения БПК сточных вод предприятий пищевой промышленности / В.А. Арляпов [и др.] // Вода: Химия и Экология. 2008. №3. C.23-30.
13. Использование дрожжей рода Arxula для определения БПК / Е.А. Воронова [и др.] // Микроорганизмы и биосфера: тез. докл. Междун. научн. конф. Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН. 2007.
14. Воронова Е.А., Ильясов П.В., Решетилов А.Н. Исследование параметров сенсора для детекции этанола на основе метилотрофных дрожжей Pichia an-gusta ВКМ Y-2518 // Альманах клинической медицины. 2006. №12. С.107-107.
Арляпов Вячеслав Алексеевич (gwinbleidd@rambler.ru), к.х.н., доцент, кафедра химии, Тульский государственный университет.
Вельмякин Денис Павлович (norman-90@mail.ru), студент, кафедра биотехнологии, Тульский государственный университет.
Чепурнова Майя Александровна (chepurnovama@rambler.ru), к.б.н., доцент, кафедра биотехнологии, Тульский государственный университет.
Бабкина Елена Евгеньевна (babkinael@rambler.ru), к.х.н., доцент, кафедра химии, Тульский государственный университет.
Алферов Валерий Анатольевич (chem@tsu.tula.ru), к.х.н., профессор, зав.кафедрой, кафедра химии, Тульский государственный университет.
Stability analysis of association of yeast microorganisms Pichia angusta, Arxula adeninovorans and Debaryamyces hansenii
V. A. Arlyapov, D.P. Velmyakin, M.A. Chepurnova, E. E. Babkina,
V. A. Alferov
Abstract. Stability of the time the association of yeast microorganisms Pichia angusta VKM Y-2518, Arxula adeninovorans VGI 78(6) and Debaryamyces hansenii VKM Y-2482 was studied. Methods of sowing on solid medium, optical microscopy and by using amperometric biosensor shows that, six weeks after the establishment of the association of dominant strain in it is a P. angusta, which is associated with a higher rate of growth of these microorganisms.
Keywords: biosensors, biochemical oxygen demand, BOD, association of microorganisms, Pichia angusta, Arxula adeninovorans, Debaryamyces hansenii.
Arlyapov Vyacheslav (gwinbleidd@rambler.ru), candidate of chemical sciences, associate professor, department of chemistry, Tula State University.
Velmyakin Denis (norman-90@mail.ru), student, department of biotechnology, Tula State University.
Chepurnova Maya (chepurnovama@rambler.ru), candidate of biological sciences, associate professor, department of biotechnology, Tula State University.
Babkina Elena (babkinael@rambler.ru), candidate of chemical sciences, associate professor, department of chemistry, Tula State University.
Alferov Veleriy (chem@tsu.tula.ru), candidate of chemical sciences, professor, head of department, department of chemistry, Tula State University.
Поступила 30.06.2011
