CC BY
66
БИОТЕСТИРОВАНИЕ В ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ФАРМАКОЛОГИИ: ПРИМЕНЕНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТНЫХ БИОТЕСТ-СИСТЕМ IN VITRO
И.А. Лупанова, Л.Б. Стрелкова, Е.В. Ферубко, В.К. Колхир
Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР), Москва [email protected]
Резюме: Впервые предложена система первичного биохимического скрининга с использованием специфических ферментных биотест-систем на основе глутатионредуктазы, каталазы, НАДФН-оксидазы, тирозингидроксилазы, цитохрома Р450 и глутатионтрансферазы для выявления биологической активности и прогнозирования направленности фармакологического действия биологически активных веществ растительного происхождения на примере флавоноидов и тритерпеновых гликозидов.
Ключевые слова: специфические ферментные биотест-системы, биологическая активность.
BIOTESTING IN EXPERIMENTAL PHARMACOLOGY:
APPLICATING SPECIFIC ENZYMATIC BIOTESTSYSTEMSINVITRO
I.A. Loupanova, L.B. Strelkova, E.V. Feroubko, V.K. Kolhir
Russian Scientific and Research Institute for Medicinal and Aromatic Herbs (VILAR), Moscow
Abstract: The article is the first to introduce the system of primary biochemical screening using specific enzymatic biotest systems based on glutathione reductase, catalase, NADPH oxidase, tyrosine hydroxylase, cytochrome P450 and glutathione transferase for detecting biological activity and predicting pharmacological activity targeting for biologically active substances of herbal origin, for example, flavonoids and triterpene glycosides.
Key words: specific enzymatic biotest systems, biological activity.
ВВЕДЕНИЕ
Одной из задач современной фармакологии является поиск новых веществ, обладающих биологической активностью. Проведение такого рода исследований требует адекватного инструмента для оценки тонких механизмов действия этих объектов на молекулярном уровне. В качестве одного из таких инструментов исследования молекулярных механизмов действия биологически активных веществ (БАВ) мы предлагаем применение подходов в условиях опытов in vitro, к которым можно отнести разработанные в ГНУ ВИЛАР Россельхозакадемии специфические ферментные биотест-системы — модели, позволяющие на молекулярном уровне избирательно выявлять корреляты фармакологической активности.
Цель исследования — системная оценка биологической активности фитопрепаратов и фитообъектов, содержащих тритерпеновые гликозиды и флавонои-ды, с применением биотехнологических методов тестирования в условиях опытов in vitro, основанных на специфических ферментных биотест-системах.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Нами для тестирования были выбраны следующие ферментные биотест-системы in vitro: глутатионредук-тазная (ГР) в сочетании с каталазной (КАТ) применяли для выявления адаптогенных, антиоксидантных и про-тивомикробных свойств, НАДФН-оксидазная — им-
муномодулирующих свойств, тирозингидроксилазная (ТГ) — дофаминергических свойств и на основе цитохрома Р450 (цит Р450) в сочетании с глутатионтрансфе-разой (ГТФ) — детоксицирующих свойств. Выбранные нами ферментные тест-системы in vitro превосходят другие способы скрининга по информативности и быстроте выполнения, а также очень удобны для определения молекулярных механизмов действия и определения связи «структура-действие» для БАВ.
Объекты исследования: индивидуальные три-терпеновые гликозиды из качима двуцветного (Gypsophila bicolor) — биколорозиды А и В (БКА и БКВ), различающихся тем, что биколорозид-В содержит в третьем положении два остатка глюкозы, а биколорозид-А — один, тритерпеновые гликозиды женьшеня (Panax ginseng C.A. Mey) — панаксозиды, флавон кверцетин (КВ), флаванон дигидрокверце-тин (ДКВ), гликозид кверцетина рутин, флавоноид-ная фракция из листьев Гинкго Билоба отечественного производства.
Источником НАДФН-оксидазы и тирозинги-дроксилазы служили спокойные полиморфноядерные лейкоциты периферической крови кролика. Протимозин-а — тимический гормон, природный иммуноактиватор. Источником цитохрома Р450 и глутатионтрансферазы служила микросомальная фракция, полученная из печени интактных белых беспородных лабораторных крыс массой 180—200 г
ОБЗОРНЫЕ И ПРОБЛЕМНЫЕ СТАТЬИ
ОБЗОРНЫЕ И ПРОБЛЕМНЫЕ СТАТЬИ
методом дифференциального центрифугирования. Концентрацию белка в микросомах определяли по модифицированному методу Лоури и соавторов, содержание цитохрома Р450 — спектрофотометрически по методу Омура и Сато. Скорость ферментных реакций измеряли спектрофотометрически на двулучевом спектрофотометре Shimadzu MPS-2000 (Япония) и биохимическом анализаторе Clima СМ-15 (Испания) с помощью реактивов фирмы «Sigma-Aldrich», США. Определяли: скорость ГР реакции — по убыли поглощения при 340 нм за счет окисления НАДФН, эквимолярно восстановлению окисленного глута-тиона; скорость КАТ реакции — по цветной реакции комплекса перекиси водорода с молибдатом аммония при 410 нм; монооксигеназную активность цитохрома Р450 в присутствии субстрата I типа — диметиланилина и субстрата II типа — анилина. Скорость реакций оценивали в кинетическом режиме по убыли поглощения при 340 нм за счет окисления НАДФН эквимолярно гидроксилированию анилина и деметилированию диметиланилина. Скорость ГТФ реакции определяли по поглощению при 340 нм окрашенного продукта реакции конъюгации субстратов — 3,4-динитрохлорбензола с восстановленным глутатионом [1].
Растворы тритерпеновых гликозидов и флавоно-идов в интервале концентраций 1,5—50 мкг/мл добавляли в опытную пробу после внесения ферментов. Предварительно определяли форму зависимости скорости реакции от концентрации вещества в пробе. Было установлено, что зависимость скорости ферментативных реакций in vitro от концентрации изучаемых веществ описывается кривой с максимумом, который соответствует оптимальной концентрации образца в пробе. Поэтому для сравнительной оценки непосредственного действия веществ на протекание ферментных реакций использовали скорости реакций, полученные при оптимальных концентрациях изучаемых БАВ.
Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета программ статистического анализа Statistica 6,0 (StatSoft, США). Для оценки значимости отличий между выборками с распределением, приближающимся к нормальному, использовался t-критерий Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В ГНУ ВИЛАР разработана каталазная биотест-система in vitro [2—4], позволяющая в совокупности с глутатионредуктазной биотест-системой in vitro определить наличие адаптогенной, антиоксидантной и противомикробной активности БАВ.
Было доказано, что скорость каталазной реакции угнетается по сравнению с контрольной пробой при добавлении веществ, обладающих адапто-генными и противомикробными свойствами [2, 4],
и возрастает при добавлении веществ, обладающих антиоксидантными свойствами [3]. Угнетение скорости каталазной реакции адаптогенами обусловлено наличием у них противомикробных свойств. Метод выявления искомой биологической активности по влиянию БАВ на скорость каталазной реакции in vitro отличается высокой специфичностью и чувствительностью, хорошей воспроизводимостью, меньшей трудоемкостью, чем известные методики, не требует наличия гомогената клеток и дорогостоящих реактивов.
Результаты сравнительного изучения скоростей глутатионредуктазной и каталазной реакций in vitro в присутствии изучавшихся тритерпеновых гликозидов и флавоноидов представлены на рисунке 1.
Из приведенной гистограммы видно, что три-терпеновые гликозиды (БКА и БКВ) не имеют сродства к глутатионредуктазе и каталазе, или таковым сродством обладают и проявляют адапто-генные свойства (панаксозиды) [2]. В тоже время изучавшиеся флавоноиды (кроме кверцетина) обладали сродством к ключевым ферментам антиок-сидантной защиты, ускоряя эти реакции и проявляя антиксидантные свойства [3]. Исключение составлял кверцетин, который ингибировал скорость и ГР- и КАТ-реакций, проявляя, согласно [4], антимикробные свойства.
Таким образом, при исследовании адаптоген-ных, антиоксидантных и антимикробных свойств у биколорозидов А и В, а также биофлавоноидов, различающихся по структуре и количеству глюкозных остатков, с помощью специфических ферментных биотест-систем, основанных на ГР и КАТ, установлены различия в проявлении специфической биологической активности.
НАДФН-оксидазная ферментная биотест-система in vitro, позволяющая выявлять наличие иммуномодулирующих свойств у изучаемого объекта, была разработана в ГНУ ВИЛАР совместно с ММА
Эффект, %
Н ГР-реакция Н КАТ-реакция
Рис. 1. Гистограммы распределения скоростей глу-татионредуктазной и каталазной реакций in vitro (эффект, %) в присутствии тритерпеноидов и флавоноидов. Здесь и далее * — статистическая значимость отличий от контроля при р < 0,05
Ежеквартальный рецензируемый научно-практический журнал
№1, 2013
им. И.М. Сеченова [5]. НАДФН-оксидаза в гомогенатах лейкоцитов in vitro активируется не только активаторами фагоцитоза, но и активаторами гуморального иммунитета.
НАДФН-оксидазный тест состоит в измерении скорости НАДФН-оксидазной реакции в гомогенатах свежих или хранившихся замороженными клеток миелоидного ряда — полиморфно-ядерных лейкоцитов (ПМЛ), макрофагов без добавления иммуностимулятора и в присутствии иммуностимулятора in vitro. НАДФН-оксидазный тест может быть применен для выявления иммуноактивирующей активности БАВ, в том числе растительного происхождения.
Для сравнительной количественной оценки величины непосредственного активирующего влияния изучаемых соединений на скорость НАДФН-оксидазной реакции in vitro, соотносили скорости реакции, полученные в упомянутых пробах, со скоростью НАДФН-оксидазной реакции в пробе, содержащей известный природный иммуноактиватор протимозин-а, принимая ее за 100%. Результаты сравнительного изучения скорости НАДФН-оксидазной реакции in vitro в присутствии изучавшихся три-терпеновых гликозидов и флавоноидов, а также протимозина-а, представлены на рисунке 2.
Из данных, представленных на рисунке 2, видно, что все изученные БАВ ускоряли НАДФН-оксидазную реакцию, что свидетельствует о наличии у них иммуномодулирующих свойств [5]. Однако количественное влияние изученных веществ на активность данного фермента было неодинаково. Тритер-пеновые гликозиды, за исключением биколорозида А, значительно больше ускоряли реакцию по сравнению с флавоноидами. По активирующему влиянию на НАДФН-оксидазную реакцию изучаемые вещества располагались в следующем порядке: панаксо-зиды > биколорозид В > флавоноидная фракция из листьев Гинкго Билоба > кверцетин = биколоро-зид А > рутин > дигидрокверцетин.
Тирозингидроксилазный тест in vitro [6] позволяет специфически выявлять вещества, обладающие непосредственным сродством к дофаминенергической нейромедиаторной системе. Это обусловлено тем, что в тирозингидроксилазе и дофаминовых рецепторах имеются одинаковые места «узнавания», обеспечивающие избирательное связывание со специфическими лигандами. Поэтому тирозингидроксилаза может использоваться в качестве модели «узнающих» сайтов дофаминовых рецепторов для выявления дофаминовых БАВ.
Фермент тирозингидроксилаза (ТГ), лимитирующий биосинтез катехоламинов, играет важную роль в обеспечении специфической активности катехоламиненергических, прежде всего дофами-ненергических, нейронов. В цепи биосинтеза катехоламинов стадия превращения тирозина в ДОФА является наиболее важной, поскольку она лимитирует и регулирует в организме скорость образования катехоламинов.
Прямой спектрофотометрический метод определения скорости ТГ реакции основан на измерении прироста поглощения для 335 нм, обусловленного окислением птеринового кофактора ДМПН4 (в ДМПН2), сопряженным с превращением субстрата реакции L-тирозина в L-ДОФА.
Результаты сравнительного изучения скорости ТГ-реакций in vitro в присутствии изучавшихся три-терпеновых гликозидов и флавоноидов представлены на рисунке 3.
Как видно из данных (Рис. 3), все объекты исследования ингибировали ТГ-реакцию. Однако максимальным ингибирующим эффектом, количественно сходным с эффектом дофамина, обладали панаксо-зиды. Остальные исследовавшиеся вещества, за исключением кверцетина, рутина и биколорозида А, угнетали ТГ-реакцию менее чем на 30%. Это свидетельствует о том что, и для тритерпеновых гликозидов (биколорозид В), и для флавоноидов (дигидрок-
^ ¡4
лу' -'0> -ЄЛ
S5
Эффект, %
120 100 80 60 40 20 0
100
83 74* . , 82
62* ■ _ . 54* 61* I
і 2)1 | ■ 1
о 2 29
_ _ _ _______
&
Рис. 2. Скорость НАДФН-оксидазной реакции in vitro (в %) в присутствии тритерпеноидов и флавоноидов (скорость реакции с участием природного иммуноактиватора — протимозина-а принята за 100%)
Рис. 3. Скорость тирозингидроксилазной реакции в опыте in vitro в присутствии изучавшихся веществ в сравнении с дофамином — природным ретроингибитором тирозингидроксилазы и агонистом дофаминовых рецепторов
ОБЗОРНЫЕ И ПРОБЛЕМНЫЕ СТАТЬИ
ОБЗОРНЫЕ И ПРОБЛЕМНЫЕ СТАТЬИ
верцетин, флавоноидная фракция из листьев Гинкго Билоба) дофаминовая нейромедиаторная система не является основной мишенью.
Таким образом, по ингибирующему действию на ТГ-реакцию изучаемые вещества располагаются в следующем порядке: панаксозиды > кверцетин > рутин = биколорозид А > дигидрокверцетин > флавоноидная фракция из листьев Гинкго Билоба = биколорозид В.
Как известно, в результате первой фазы обезвреживания с участием цитохрома Р450 происходит модификация веществ с образованием функциональных групп, повышающих растворимость гидрофобного соединения. В результате модификации возможна потеря молекулой ее биологической активности или даже формирование более активного соединения, чем вещество, из которого оно образовалось.
Вторая фаза обезвреживания веществ реакции конъюгации, в ходе которых происходит присоединение к функциональным группам, образующимся на первом этапе, других молекул или групп эндогенного происхождения, увеличивающих гидрофильность и уменьшающих токсичность ксенобиотиков. Особое место среди ферментов, участвующих в обезвреживании ксенобиотиков, инактивации нормальных метаболитов, лекарств, занимают глутатионтрансферазы (ГТФ).
В качестве тест-объектов в данной работе мы использовали ключевые ферменты первого и второго этапов системы биотрансформации и детоксикации ксенобиотиков в клетке: цитохрома Р450 и глутатионтрансферазы [7].
Сравнительные результаты изучения прямого влияния тритерпеновых гликозидов и флавоноидов на монооксигеназную активность (гидроксилазную и деметилазную) цитохрома Р450, а также на конью-гирующую активность глутатионтрансферазы представлены на рисунке 4.
Известно, что увеличение скорости образования токсических веществ в монооксигеназной системе цитохрома Р450 на 1-м этапе, по сравнению со скоростью их коньюгации с помощью ГТФ на 2-м этапе процесса детоксикации, как правило
ЛИТЕРАТУРА
Эффект, %
200
150
100
50
223*
180*
100
122
йЦ2 121* 110* -
184*
-ШигйЗ*
139*
122*
4? ^ ^ / У /
^
^ ^ ^ ^
ГР-реакция КАТ-реакция И ГТФ
Рис. 4. Скорость реакций (в %), катализируемых цитохромом Р450 и глутатионтрансферазой в присутствии изучавшихся веществ в опытах in vitro
свидетельствует о снижении эффективности детоксицирующей системы [7]. Поэтому на основании полученных данных можно заключить, что детоксицирующая активность исследованных веществ уменьшается в ряду: панаксозиды > БКВ > БКА. Детоксицирующая активность исследованных флавоноидов уменьшается в ряду дигидрокверцетин > кверцетин > флавоноидная фракция из листьев Гинкго Билоба > рутин.
Таким образом, наибольшей детоксицирующей активностью обладают: дигидрокверцетин и па-наксозиды; биколорозид А и кверцетин также обладают детоксицирующей активностью, но менее выраженной.
ВЫВОДЫ
Разработанные в ВИЛАР оригинальные специфические ферментные биотест-системы in vitro проявляют высокую избирательность к БАВ, обладающим соответствующими фармакологическими свойствами, успешно применяются в фармакологии и фармации: для поиска и разработки новых фитопрепаратов, изучения молекулярного механизма их действия, прогнозирования характера зависимости эффекта от дозы, для экспресс-оценки качества растительного сырья и биотехнологических продуктов, для подбора оптимального соотношения компонентов в композициях, для поиска маркеров в целях стандартизации фитообъектов.
1. Лупанова И.А. Исследование молекулярных механизмов действия биологически активных веществ на примере тритерпеновых и флавоноидных гликозидов. Автореф. дис... к. биол. н. М. 2012. 25 с.
2. Быков В. А., Минеева М. Ф., Дубинская В. А., Ребров Л.Б., Колхир В.К. Способ выявления веществ, обладающих адаптогенными свойствами, in vitro. Патент РФ №2181890. 2001. С.А. 137:379958. 2003.
3. Быков В.А., Дубинская В.А., Минеева М.Ф., Ребров Л.Б., Колхир В.К. Способ выявления веществ, обладающих антиоксидантными
свойствами, in vitro. Патент РФ № 2181892.
2002.
4. Быков В.А., Минеева М.Ф., Дубинская В.А., Ребров Л.Б., Колхир В.К. Способ выявления веществ, обладающих противомикробны-ми и противовирусными свойствами, in vitro. Патент РФ №2181891. 2002.
5. Быков В.А., Минеева М.Ф., Попова Н.Б. Способ выявления веществ с потенциальной иммуномодулирующей активностью, in vitro с применением NADPH-оксидазной тест-системы. Патент №2194077. 2002. С.А 138: 297591. 2004.
Минеева-Вялых М.Ф. Метод прямого спектрофотометрического определения скорости тирозингидроксилазной реакции // Вопросы медицинской химии. 1976.
Т. 22 (2). С. 274-279.
Лупанова И.А., Минеева М.Ф., Колхир В.К, Стрелкова Л.Б., Сокольская Т.А. Применение специфических ферментных биотест-систем in vitro для исследования биологической активности некоторых природных соединений // Вопросы биол., мед. и фарм. химии. 2012. № 1.
С. 172-177.
250
0
