Научная статья на тему 'Тритерпеновые гликозиды - перспективный класс природных соединений для создания новых фитопрепаратов'

Тритерпеновые гликозиды - перспективный класс природных соединений для создания новых фитопрепаратов Текст научной статьи по специальности «Биология»

CC BY
537
37
Поделиться
Ключевые слова
ТРИТЕРПЕНОВЫЕ ГЛИКОЗИДЫ / ФЕРМЕНТНЫЕ БИОТЕСТ-СИСТЕМЫ

Аннотация научной статьи по биологии, автор научной работы — Лупанова Ирина Александровна, Минеева Майя Федоровна, Колхир Владимир Карлович, Мартынов Альберт Михайлович

Впервые в одном исследовании изучается ряд тритерпеновых гликозидов (ТГ), отличающихся между собой строением генина тритерпена и/или строением углеводной части. В работе оценивается непосредственное влияние изучаемых ТГ на ферменты глутатионредуктазу (ГР), каталазу (КАТ), НАДФН-оксидазу и пируваткиназу (ПК), играющие регуляторную роль в процессах адаптации. Установлено, что сходство и различия в структуре изучавшихся тритерпеновых гликозидов проявляются в непосредственном взаимодействии с ферментами, выполняющими различные функции в обмене веществ. Полученные результаты показывают перспективность применения тритерпеновых гликозидов как сырья для создания препаратов с различными молекулярными механизмами действия.

Похожие темы научных работ по биологии , автор научной работы — Лупанова Ирина Александровна, Минеева Майя Федоровна, Колхир Владимир Карлович, Мартынов Альберт Михайлович,

Triterpene glycosides are the prospective class for innovative herbal drugs1All-Russian Research Institute of Medicinal and Aromatic Herbs (VILAR)

For the fi rst time in one research were studied triterpene glycosides, diff erent among themselves in a structure of a carbohydrate part. Direct infl uence studied triterpene glycosides on enzymes glutationreductase (GR), catalase (CAT), NADPH-oxidase, tyrosine hydroxylase and pyruvate kinase (PK) that are playing a regulatory role in adaptation processes was defi ned. It is established that similarity and diff erences in the structure of the carbohydrate part of triterpene glycosides show up in quantitively diff erential eff ect on the essential enzymes of homeostasis. Our results show the perspective of triterpene glycosides as a raw material for drugs with diff erent molecular mechanism of action.

Текст научной работы на тему «Тритерпеновые гликозиды - перспективный класс природных соединений для создания новых фитопрепаратов»

Информация об авторах: 670013, г. Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6, ИОЭБ СО РАН, ОБАВ, e-mail: tatur75@mail.ru, тел. (3012) 433463.

Разуваева Янина Геннадьевна — к.б.н., научный сотрудник,

Николаев Сергей Матвеевич — д.м.н., профессор, заведующий отделом, Надежда Вадимовна Верлан — д.м.н., профессор, декан,

Базарова Надежа Цыреновна — аспирант.

© ЛУПАНОВА И.А., МИНЕЕВА М.Ф., КОЛХИР В.К., МАРТЫНОВ А.М. — 2012 УДК 578.083:577.15.04:615.011

ТРИТЕРПЕНОВЫЕ ГЛИКОЗИДЫ — ПЕРСПЕКТИВНЫЙ КЛАСС ПРИРОДНЫХ СОЕДИНЕНИЙ ДЛЯ СОЗДАНИЯ НОВЫХ ФИТОПРЕПАРАТОВ

Ирина Александровна Лупанова1, Майя Федоровна Минеева1,

Владимир Карлович Колхир1, Альберт Михайлович Мартынов2 ^Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР), директор — д.т.н., акад. РАМН, акад. РАСХН, проф. В.А. Быков, отдел экспериментальной и клинической фармакологии, зав. — д.м.н. В.К. Колхир; 2Иркутский государственный институт усовершенствования врачей,

ректор — д.м.н., проф. В. В. Шпрах)

Резюме. Впервые в одном исследовании изучается ряд тритерпеновых гликозидов (ТГ), отличающихся между собой строением генина — тритерпена и/или строением углеводной части. В работе оценивается непосредственное влияние изучаемых ТГ на ферменты глутатионредуктазу (ГР), каталазу (КАТ), НАДФН-оксидазу и пируваткиназу (ПК), играющие регуляторную роль в процессах адаптации. Установлено, что сходство и различия в структуре изучавшихся тритерпеновых гликозидов проявляются в непосредственном взаимодействии с ферментами, выполняющими различные функции в обмене веществ. Полученные результаты показывают перспективность применения тритерпеновых гликозидов как сырья для создания препаратов с различными молекулярными механизмами действия.

Ключевые слова: тритерпеновые гликозиды, ферментные биотест-системы.

TRITERPENE GLYCOSIDES ARE THE PROSPECTIVE CLASS FOR INNOVATIVE HERBAL DRUGS

I.A. Lupanova, M.F. Mineeva, V.K. Kolhir, A.M. Martynov ^All-Russian Research Institute of Medicinal and Aromatic Herbs (VILAR),

2Irkutsk State Institute for post diplomer Education Doctors)

Summary. For the first time in one research were studied triterpene glycosides, different among themselves in a structure of a carbohydrate part. Direct influence studied triterpene glycosides on enzymes glutationreductase (GR), catalase (CAT), NADPH-oxidase, tyrosine hydroxylase and pyruvate kinase (PK) that are playing a regulatory role in adaptation processes was defined. It is established that similarity and differences in the structure of the carbohydrate part of triterpene glycosides show up in quantitively differential effect on the essential enzymes of homeostasis. Our results show the perspective of triterpene glycosides as a raw material for drugs with different molecular mechanism of action.

Key words: triterpene glycosides, enzymatic biotest-systems.

Tpитepпeнoвыe гликозиды — хорошо изученный класс соединений растительного происхождения. Известно, что многие представители данного класса веществ обладают адаптогенными, иммуномодулирующими, противоопухолевыми, тонизирующими и другими свойствами, проявляя высокую биологическую активность различной направленности [б], в том числе седативную, противовоспалительную, отхаркивающую, противомикробную и другие. Однако молекулярные механизмы фармакологического действия этих соединений изучены недостаточно. По-прежнему актуально изучение связи между химическим строением соединений класса тритерпеновых гликозидов и их биологической активностью с целью дальнейшего создания фитопрепаратов различной направленности.

Целью работы явилось выявление значимости строения углеводного остатка в молекуле тритерпенового гликозида для исследования молекулярных механизмов действия, определяющих спектр фармакологической активности на примере близких по структуре тритерпеновых гликозидов из качима двуцветного (Gypsophila bicolor) — биколорозидов A и B, различающихся тем, что биколорозид-B содержит в углеводной части при третьем положении два остатка глюкозы, а биколорозид-A — один.

Материалы и методы

Реактивы: НАДФН, глутатион окисленный, фос-фоенолпируват (ФЕП), аденозиндифосфат (АДф), никотинамидадениндинуклеотид восстановленный (НАДН), а также высокоочищенные ферменты глута-тионредуктаза, каталаза, лактатдегидрогеназа, пиру-ваткиназа и лактатдегидрогеназа — реактивы фирмы “Sigma-Aldrich”, США. Соляная кислота осч, фосфат натрия и калия, хлорид калия и магния, перекись водорода — отечественные реактивы. Объекты исследования: индивидуальные тритерпеновые гликозиды из качима двуцветного (БКА и БКВ), выделенные в лаборатории ВИЛАР. В качестве препарата сравнения использовали стандартизованный сухой экстракт корней женьшеня, содержащий все тритерпеновые гликозиды (панаксози-ды), присущие корню женьшеня. Источником NADPH-оксидазы и тирозингидроксилазы служили спокойные полиморфноядерные лейкоциты периферической крови кролика [5]. Исследование проводилось с применением специфических ферментных биотест-систем in vitro, позволяющих выявлять адаптогенную [1], иммуномодулирующую [2], дофаминергическую [7], энергизиру-ющую активность биологически активных соединений (БАС). Применяли глутатионредуктазную (ГР), ката-лазную (КАТ), НАДФН-оксидазную, тирозингидрок-силазную и пируваткиназную (ПК) биотест-системы. Тритерпеновые гликозиды добавляли в интервале кон-

Таблица 1

Влияние биколорозидов-А и —В в сравнении с протимозином-а на НАДФН-оксидазную реакцию in vitro

Вариант опыта Скорость реакции, M±m

мкмоль/мин на 10 мкл гомогената лейкоцитов % от контроля

Протимозин- а 26,7±1,12 100

Панаксозиды 23,2±0,96 87*

Биколорозид-А 10,4±0,68 39*

Биколорозид-В 18,4±0,89 69*

Примечание: * — статистическая значимость отличий от контроля при р<0,05.

центраций 1,5-50 мкг/мл пробы.

Статистическая обработка данных. При нормальном распределении величин в выборке (5 повторов для каждой концентрации исследуемых веществ в каждом эксперименте, n=5) рассчитывали среднюю арифметическую величину и ошибку средней арифметической (М±ш). Статистическую значимость различий между выборками определяли по критерию Стьюдента (t-критерий) [4]. Различия между выборками считались значимыми при р<0,05.

Результаты и обсуждение

При направленном сравнительном изучении биологической активности БКА и БКВ с помощью специфических ферментных биотест-систем in vitro предварительно определяли зависимость эффекта изучаемого вещества от концентрации его в пробе. Было установлено, что зависимость скорости ферментативных реакций от концентрации изучаемых веществ описывается кривой с максимум. Поэтому для сравнительной оценки непосредственного действия веществ на скорость реакций использовали скорости реакций, полученные при оптимальных концентрациях изучаемых БАВ. В таблицах 1-4 приведены результаты тестирования с использованием биотест-систем, полученные при оптимальных концентрациях в пробе БКА и БКВ, а также сухого экстракта корней женьшеня.

В таблице 1 представлены данные по влиянию тритерпеновых гликозидов на скорость НАДФН-оксидазной реакции in vitro. В связи с тем, что в спокойных лейкоцитах НАДФН-оксидаза не активна, для сравнительной оценки непосредственного активирующего влияния изучаемых ТГ на НАДФН-оксидазу скорость реакции, измеренную в присутствии изучаемых объектов, соотносили со скоростью НАДФН-оксидазной реакции в присутствии известного природного иммуноактиватора протимозина-а, принимая ее за 100%. Концентрация препарата сравнения — протимозина-а составляла 1 мкг/мл пробы.

Из таблицы 1 видно, что биколорозиды-А и —В оказывают непосредственное активирующее влияние на НАДФН-оксидазу в условиях in vitro, что свойственно БАС с иммунотропными свойствами [2].

Как видно из таблицы 1, биколорозид-А и —В активируют НАДФН-оксидазу in vitro в различной степени: биколорозид-А на 39% от протимозина-а, а биколорозид-В — на 69%, панаксозиды на 87%. Таким образом, биколорозиды-А и —В обладают свойством активировать НАДФН-оксидазу in vitro, как и панаксозиды, что отражает общие черты в строении тритерпеновых гликозидов. Однако в различии действия (различное сродство БАС к субъединицам НАДФН-оксидазы) отражены различия в структуре биколорозидов-А и —В, различающихся на одну молекулу глюкозы в углеводной части молекулы. Таким образом, строение углеводной части тритер-

пеновых гликозидов играет важную роль во взаимодействии с ключевыми ферментами иммунной системы.

В таблице 2 представлены результаты изучения влияния биколорозидов-А и —В в сравнении с панаксози-дами на скорость ГР и КАТ реакций in vitro.

Из таблицы 2 видно, что панаксозиды оказывают непосредственное активирующее влияние на ГР и угнетающее влияние на КАТ, что, как было доказано ранее [1], свойственно биологически активным соединениям адаптогенного действия, которое принято считать основным фармакологическим свойством панаксози-дов. Биколорозид-А и — В в разной степени действуют на ферменты: биколорозид-А практически не оказывает влияния на ГР и КАТ, а биколорозид-В — угнетает ГР реакцию и ускоряет на 6% КАТ реакцию, проявляя слабые антиоксидантные свойства.

Тирозингидроксилазный тест in vitro позволяет специфически выявлять вещества, обладающие непосредственным сродством к дофаминергической нейро-медиаторной системе. Это обусловлено тем, что в тиро-зингидроксилазе и дофаминовых рецепторах имеются одинаковые места «узнавания», обеспечивающие избирательное связывание со специфическими лигандами. Поэтому тирозингидроксилаза может использоваться в качестве модели «узнающих» сайтов дофаминовых рецепторов для выявления дофаминергических свойств биологически активных соединений [7].

Результаты изучения влияния тритерпеновых глико-зидов на скорость тирозингидроксилазной реакции in vitro в сравнении с дофамином (природным агонистом дофаминовых рецепторов, аллестерическим ингибитором тирозингидроксилазы) представлены в таблице 3.

Таблица 3

Влияние тритерпеновых гликозидов и дофамина на скорость тирозингидроксилазной реакции

Вариант опыта Скорость реакции, M±m

мкмоль/мин на 10 мкл гомогената лейкоцитов % от контроля

Контроль 17,1 ±0,98 100

Дофамин, 10 мкМ 3,42±0,17 20*

Панаксозиды, 10 мкг/мл 4,96±0,20 29*

Биколорозид-А, 3,3 мкг/мл 10,6±0,38 62*

Биколорозид-В, 6,6 мкг/мл 14,2±0,67 83*

Примечание: * — статистическая значимость отличий от контроля при р<0,05.

Из таблицы 3 видно, что биколорозиды-А и —В оказывают непосредственное угнетающее влияние на скорость тирозингидроксилазной реакции, что свидетельствует о наличии сродства этих соединений к лимитирующему ферменту дофаминовой нейромедиаторной системы. Количественно эффекты биколорозидов —А и —В не одинаковы: в присутствии биколорозида-А скорость тирозингидроксилазной реакции составляет 62% от контроля, в присутствии биколорозида-В —

Таблица 2

Влияние тритерпеновых гликозидов на глутатионредуктазу и каталазу in vitro

Вариант опыта Скорость реакции, M±m

Глутатионредуктазная Каталазная

мкмоль/мин на 1мг белка % от контроля мкмоль/мин на 1мг белка % от контроля

Контроль 2,92±0,12 100 1,50±0,05 100

Биколорозид-В 2,25±0,09 77* 1,59±0,07 106

Биколорозид-А 2,86±0,13 98 1,48±0,07 99

Панаксозиды 3,62±0,15 124* 1,35±0,06 90*

Примечание: * — статистическая значимость отличий от контроля при р<0,05.

83%, что свидетельствует о количественном различии степени сродства этих соединений к тирозингидрокси-лазе. Таким образом, на примере тритерпеновых гли-козидов из качима двуцветного показано, что строение углеводной части молекулы тритерпеновых гликозидов может влиять на их сродство к ферментам, в данном случае — на степень сродства к тирозингидроксилазе. Вместе с тем, угнетающий эффект биколорозидов, как видно из таблицы 3, выражен значительно меньше, чем эффект панаксозидов. Панаксозиды, суммарная фракция тритерпеновых гликозидов, оказывают на тирозингидроксилазу непосредственное угнетающее влияние, количественно близкое к влиянию дофамина, агониста дофаминовых рецепторов и ретроингибитора тирозингидроксилазы. Так как тирозингидроксилаза является частью дофаминовой нейромедиаторной системы, высокое сродство панаксозидов к этому ферменту указывает на существенную роль дофаминовой нейромедиаторной системы в молекулярном механизме действия суммы тритерпеновых гликозидов из женьшеня. Относительно невысокое сродство биколорозидов к тирозингидроксилазе позволяет предполагать, что дофаминовая нейромедиаторная система не является основной мишенью для этих соединений.

Результаты изучения влияния тритерпеновых гли-козидов на скорость пируваткиназной реакции in vitro представлены в таблице 4. Пируваткиназа — гликолити-ческий фермент, катализирующий (при наличии ионов магния и калия) предпоследнюю реакцию гликолиза — перенос остатка фосфорной кислоты от фосфоенолпи-рувата (ФЕП) на АДФ с образованием АТФ и пирувата (пировиноградной кислоты). Ускорение ПК-реакции приводит к увеличению фонда аденозинтрифосфата, что особенно важно в условиях недостатка кислорода [3].

Таблица 4

Влияние тритерпеновых гликозидов на скорость пируваткиназной реакции

Вариант опыта Скорость реакции, M±m

мкмоль/мин на 1мг белка % от контроля

Контроль 13,1 ±0,21 100

Панаксозиды 26,5±1,04 202*

Биколорозид-А 15,7±0,63 120*

Биколорозид-В 12,4±0,51 95

Примечание: * — статистическая значимость отличий от контроля при р<0,05.

Из таблицы 4 видно, что биколорозид-А статистически значимо ускоряет ПК-реакцию (на 20%), биколорозид-В — практически не влияет, а панаксо-зиды ускоряют ПК-реакцию на 102%. Таким образом, биколорозиды-А и —В различаются по направленности непосредственного влияния на скорость ПК-реакции, что свидетельствует о важности различий в структуре углеводной части биколорозидов-А и —В для взаимодействия с пируваткиназой.

В совокупности результаты показывают, что сходство и различия в структуре изучавшихся тритерпено-вых гликозидов проявляются в непосредственном взаимодействии с ферментами, выполняющими различные функции в обмене веществ. Полученные результаты свидетельствуют о перспективности использования тритерпеновых гликозидов как сырья для создания на их основе фитопрепаратов с различными молекулярными механизмами действия, обладающих широким спектром фармакологических свойств.

ЛИТЕРАТУРА

1. Быков В.А., Минеева М.Ф., Дубинская В. А. и др. Способ выявления веществ, обладающих адаптогенными свойствами, in vitro. // Патент РФ №2181890. — 2001. — С.А. 137:379958. —

2003.

2. Быков В.А., Минеева М.Ф., Попова Н.Б. Способ выявления веществ с потенциальной иммуномодулирующей активностью, in vitro с применением NADPH-оксидазной тест-системы. // Патент №2194077. — 2002. — С.А 138: 297591. —

2004.

3. Куприянов В.В., Сеннет Э.К, Емелин И.В. Стационарная кинетика пируваткиназы // Биохимия. — 1979. — T. 44. Вып. 1. — C. 104-115.

4. Лакин Г.Ф. Биометрия. — Изд. доп. — М.: Высшая школа, 1990. — 352 с.

5. Минеева М.Ф. Тирозингидроксилаза лейкоцитов крови. // Бюлл. эксперим. биол. мед. — 1987. — Т. 104. N7. — С. 99-101.

6. Francis G., Keren Z., Makkar H.P.S., Becker K. The biological action of saponins in animal systems: a review. // British Journal of Nutrition. — 2002. — Vol. 88. — P. 587-605.

7. Mineeva M.F. Classification of typical and atypical

neuroleptics on the basis of their specifical effect on the tyrosine hydroxylase kinetics in vitro. // VIII Soviet-Italian meeting on neuro-phytopharmacology: Proceedings. Leningrad, 25-27

October, 1990. — Moscow, 1992. — P. 62-68.

Информация об авторах: 117216, г. Москва, ул. Грина, дом 7 (ВИЛАР), группа биохимической фармакологии отдела экспериментальной и клинической фармакологии центра медицины ВИЛАР, e-mail: iriss86@mail.ru Лупанова Ирина Александровна — аспирант, научный сотрудник Минеева Майя Фёдоровна — профессор, д.б.н., руководитель группы;

Колхир Владимир Карлович — д.м.н., руководитель центра медицины, заведующий отделом.