CC BY
98
НЕКОТОРЫЕ ПОДХОДЫ К ИССЛЕДОВАНИЮ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МЕХАНИЗМОВ ДЕЙСТВИЯ ТРИТЕРПЕНОВЫХ ГЛИКОЗИДОВ
И.А. Николаева, М.Ф. Минеева, В.К. Колхир
Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) ул. Грина, 7, Москва, Россия, 117216 тел. +79114636467, эл. почта: [email protected]
Впервые в одном исследовании изучали ряд тритерпеновых гликозидов (ТГ), отличающихся между собой строением генина — тритерпена и/или строением углеводной части. Оценивали непосредственное влияние изучаемых ТГ на ферменты: глутатионредуктазу (ГР), каталазу (КАТ) и НАДФН-оксидазу, играющие регуляторную роль в процессах адаптации. Установлено впервые, что ТГ различного строения оказывают непосредственное, неодинаковое влияние на скорость ГР, КАТ и НАДФН-оксидазной реакций, различаясь по знаку и выраженности проявляемого эффекта.
Ключевые слова: тритерпеновые гликозиды, ферментные биотест-системы.
Тритерпеновые гликозиды (ТГ) являются низкомолекулярными биорегуляторами и обладают широким спектром их фармакологических свойств, в том числе с адаптогенной активностью [1]. За последние 30 лет достигнуты значительные успехи в установлении их полной структуры, фармакологического эффекта, однако молекулярные механизмы действия ТГ изучены недостаточно. Вместе с тем выяснение молекулярных механизмов действия ТГ актуально как в теоретическом, так и в практическом отношении.
Объектами исследования были патринозид-Д из патринии гладкой, эсцин из каштана конского, биколорозиды-А и -В из качима двуцветного, календулозид из календулы лекарственной, глицерам из солодки голой, тритерпеновые гликозиды корня женьшеня. Изучали непосредственное влияние выбранных веществ на ферменты глутатионредуктазу (ГР), каталазу (КАТ) и НАДФН-оксидазу. Ранее было показано [2], что соединения адаптогенной направленности избирательно повышают скорость ГР реакции и снижают скорость КАТ реакции in vitro. Акто-протекторы, частный случай адаптогенов, повышают скорость ГР реакции, практически не влияя на скорость КАТ реакции. Активаторы фагоцитоза и активаторы гуморального иммунитета обладают сродством к НАДФН-оксидазе и активируют ее при непосредственном контакте in vitro [3]. Это позволяет выявить не только наличие иммуномодулирующей активности, но и принадлежность соединений к гуморальным иммуноактиваторам или к активаторам клеточного иммунитета [4].
Материалы и методы. НАДФН, глутатион окисленный, а также высокоочи-щенные ферменты глутатионредуктаза, каталаза — реактивы фирмы Сигма, США. Источником НАДФН-оксидазы служили спокойные лейкоциты из лейкоцитарной массы крови собаки. Скорость ферментативных реакций измеряли спектрофотометрически на спектрофотометре Clima-15, Италия; скорость глутатионредуктаз-
ной реакции — по [5], скорость каталазной реакции — по [6], скорость НАДФН-оксидазной реакции — по [7]. ТГ добавляли в пробы после внесения ферментов, в интервале концентраций 1,5—50 мкг/мл пробы.
Результаты и обсуждения. На рис. 1 представлено влияние in vitro ТГ на скорость НАДФН-оксидазной реакции в гомогенате спокойных полиморфноядерных лейкоцитов. Предварительно были определены скорости ферментных реакций в присутствии ТГ в широком диапазоне концентраций: 1,5—50 мкг/мл. Было установлено, что зависимость величины эффекта in vitro от концентрации ТГ описывается кривой с максимумом. Все результаты приведены для оптимальных концентраций каждого ТГ в пробе.
% скорости по отношению к протимозину-а
120 -|----------------------------------------------------------
Рис. 1. Влияние ряда тритерпеновых гликозидов на скорость НАДФН-оксидазной реакции в гомогенате спокойных полиморфноядерных лейкоцитов в условиях in vitro
В связи с тем, что в спокойных лейкоцитах НАДФН-оксидаза не активна, для сравнительной оценки непосредственного активирующего влияния изучаемых ТГ на НАДФН-оксидазу скорость реакции, измеренную в присутствии изучаемых объектов, соотносили со скоростью НАДФН-оксидазной реакции в присутствии известного природного иммуноактиватора протимозина-а, принимая ее за 100%. Концентрация препарата сравнения — протимозина-а составляла 1 мкг/мл пробы. Скорость ферментативной реакции в присутствии протимозина-а составляла 26,7 мкмоль/мин на 10 мкл гомогената лейкоцитов.
Как видно из рис. 1, все исследуемые ТГ оказывают активирующее влияние на НАДФН-оксидазу. Максимальный эффект проявляют ТГ женьшеня, активируя фермент на 87% по сравнению с протимозином-а. Эффекты патринозида и эсци-на оказались близки между собой и сравнимы с эффектом биколорозида-В. Бико-лорозид-А и календулозид проявили очень слабое активирующее действие. По величине непосредственного активирующего действия на НАДФН-оксидазу (в % от скорости реакции в присутствии протимозина-а) изучаемые образцы располагаются в следующий ряд: протимозин-а > панаксозиды > патринозид « эсцин > би-колорозид-В > глицерам > биколорозид-А > календулозид.
В табл. 1 представлены кинетические параметры НАДФ-Н-оксидазной реакции при добавлении ТГ к гомогенату спокойных полиморфноядерных лейкоцитов. Для сравнения были взяты: известный природный активатор гуморального иммунитета протимозин-а и активатор терминальной стадии фагоцитоза метилурацил.
Таблица 1
Кинетические параметры НАДФ-Н-оксидазной реакции при добавлении ТГ к гомогенату спокойных полиморфноядерных лейкоцитов
Тритерпеновый гликозид Скорость реакции, мкмоль/мин. на10 мкл гом. Кинетические параметры НАФН-оксидазной реакции
контроль опыт ^ НАДФ-Н, мкМ Vmax, нмоль/мин на 10 мкл гом
Протимозин-а 0 26,7 0,02 30,0
Метилурацил 0 0,26 0,24 34,0
Патринозид 0 20,0 0,15 15,2
Эсцин 0 20,0 0,10 20,0
Биколорозид-А 0 10,4 0,10 22,0
Биколорозид-В 0 18,4 0,06 30,0
Календулозид 0 5,9 0,62 34,0
Глицерам 0 23,2 0,27 23,4
Из таблицы видно, что в контрольной пробе скорость НАДФН-оксидазной реакции равна 0. При добавлении в пробу, к гомогенту спокойных лейкоцитов, протимозина-а, НАДФН окисляется со скоростью 26,7 мкмоль/мин на 10 мкл го-могената клеток. При добавлении метилурацила НАДФН-оксидаза также активируется. При этом НАДФН окисляется со скоростью 0,26 мкмоль/мин на 10 мкл гомогената клеток. Было показано, что активирующее действие биколорозида-В было по своей величине ближе к эффекту протимозина-а. Глицерам проявляет свойства, схожие с метилурацилом. Остальные ТГ, в том числе и панаксозиды, проявили себя как активаторы смешанного иммунитета. Таким образом, в НАДФН-оксидазном тесте in vitro проявляются свойства ТГ как химической группы соединений.
Результаты изучения непосредственного влияния ТГ на ГР и КАТ in vitro представлены на рис. 2.
% скорости по отношению к контролю
Глутатионредуктаза
І і ІТГГ-І*!
Рис. 2. Влияние тритерпеновых гликозидов на скорость глутатионредуктазной и каталазной реакции в условиях in vitro
На рис. 2 видно, что патринозид, календулозид, панаксозиды и глицерам оказывают активирующее влияние на ГР, что свидетельствует наличии в их структуре близких по строению элементов, обеспечивающих взаимодействие с этим ферментом и последующую его активацию; биколорозид-А и -В угнетают ее. Наиболее выраженный эффект активации проявляют панаксозиды и патринозид. При этом эсцин не оказывает влияния на скорость глутатионредуктазной реакции. Активирующие ГР панаксозиды оказывают угнетающее действие на каталазу, а патринозид не влияет. Глицерам, календулозид и эсцин также ингибируют действие фермента. При этом заметнее всего угнетающий эффект проявил глицерам. Это свидетельствует о сходстве элементов структуры в молекуле ТГ, обеспечивающих взаимодействие с каталазой, приводящее к ее торможению. По ингибирующему действию на каталазу образцы расположились в следующий ряд: биколорозид-А > патринозид > панаксозиды > календулозид > эсцин > глицерам. Биколорозид-В проявляет слабые антиоксидантные свойства, ускоряя на 6% каталазную реакцию.
Таким образом, впервые установлено, что тритерпеновые гликозиды различного строения оказывают непосредственное, неодинаковое влияние на скорость ГР, КАТ и НАДФН-оксидазной реакции, различаясь по знаку и выраженности проявляемого эффекта, что отражается в различиях спектров их фармакологического действия.
Выводы.
1. С использованием специфических ферментых биотест-систем in vitro — глутатионредуказной, каталазной и НАДФН-оксидазной — были выявлены сходства и различия в молекулярных механизмах действия ТГ из растений семейств Аралиевых, Гвоздичных, Валериановых и Конскокаштановых.
2. Тритерпеновые гликозиды (панаксозиды, патринозид, глицерам и календулозид) непосредственно активируют ГР и угнетают КАТ. В то же время биколо-розиды-А и -В угнетают ГР, при этом биколорозид-А не влияет на КАТ, а бико-лорозид-В активирует ее.
ЛИТЕРАТУРА
[1] Попов А.М. Механизмы биологической активности гликозидов женьшеня: сравнение с гликозидами голотурий // Вестник ДВО РАН. — 2006. — № 6. — С. 92—104.
[2] Быков В.А., Минеева М.Ф., Дубинская В.А. и др. Способ выявления веществ, обладающих адаптогенными свойствами, in vitro // Патент РФ № 2181890. — 2001. — С.А. 137:379958. — 2003.
[3] Быков В.А., Минеева М.Ф., Попова Н.Б. Способ выявления веществ с потенциальной иммуномодулирующей активностью, in vitro с применением НАДФН-оксидазной тест-системы // Патент № 2194077. — 2002. С.А 138: 297591. — 2004.
[4] Лукашина Т.В., Минеева М.Ф., Дубинская Л.Б. и др. Использование специфических ферментных тест-систем in vitro для разработки многокомпонентного препарата Стабинорм // Вопросы биол., мед. и фармац. химии. — 2008. — № 1. — С. 1—56.
[5] Королюк М.А., Иванова М.И., Майорова И.Г. и др. // Лаб. Дело. — 1988. — № 1. — С. 1—8.
[6] Daniels R.H., Elmore M.A., Hill M.E. et al. // Immunology. — 1994. — N 3. — P. 465.
[7] Aebi H. Glutathione reductase // Methods in enzymatic analysis. — 1974. — V. 2. — P. 673—678.
SOME APPROACHES TO RESEARCH OF MOLECULAR MECHANISMS OF ACTION THREE-TERPENS GLYCOSIDE
I.A. Nikolaeva, M.F. Mineeva,
V.K. Kolhir
All-Russian Institute of Medicinal Plants (VILAR)
Green's str., 7, Moscow, Russia, 117216 tel. +79114636467, email: [email protected]
For the first time in one research were studied three-terpens glycoside (TG), different among themselves a structure of genin-three-terpen and-or a structure of a carbohydrate part. Direct influence studied TG on enzymes glutationreductase (GR), catalase (CAT) and NADFH-oxidase, playing a regulatory role in adaptation processes was defined. It is established for the first time that TG a various structure make direct, unequal impact on speed reactions of GR, CAT and NADFH-oxidase, differing on a sign and expressiveness of shown effect.
Key words: three-terpens glycoside, enzymatic biotests-systems.
