CC BY
88
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ МЕДИЦИНА
УДК (615.276:615.015.26-092):611.018.53
© С.В. Чаусова, Г.П. Бондарева, Е.А. Усанова, В.С. Евстратова, И.Ю. Малышев, Е.А. Дмитриева, 2014
С.В. Чаусова1, Г.П. Бондарева1, Е.А. Усанова1, В.С. Евстратова1, И.Ю. Малышев2, Е.А. Дмитриева2 ВЛИЯНИЕ ДИКЛОФЕНАКА НАТРИЯ НА ОКСИДАНТНЫЕ ФУНКЦИИ ПОЛИМОРФНО-ЯДЕРНЫХ ЛЕЙКОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЗДОРОВЫХ ДОНОРОВ И БОЛЬНЫХ С ПОВЫШЕННОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬЮ К ДИКЛОФЕНАКУ 1ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет
им. Н.И. Пирогова» Минздрава России, г. Москва 2ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова» Минздрава России, г. Москва
Исследовали влияние диклофенака натрия на секрецию активных форм кислорода полиморфно-ядерными лейкоцитами периферической крови у доноров и больных с повышенной чувствительностью к диклофенаку с помощью метода лю-минолзависимой хемилюминесцении. Было выявлено снижение секреции активных форм кислорода у больных с непереносимостью диклофенака по сравнению с донорами. Также оценивали активность НАДФН-оксидазы полиморфноядерных лейкоцитов методом люцигенинзависимой хемилюминесценции. Активность НАДФН-оксидазы снижалась в большей степени при воздействии на кровь диклофенака у больных с непереносимостью данного препарата по сравнению с донорами.
Ключевые слова: диклофенак натрия, непереносимость диклофенака, активные формы кислорода, хемилюминесцен-ция, полиморфно-ядерные лейкоциты.
S.V. Chausova, G.P. Bondareva, E.A. Usanova, V.S. Evstratova, I.Yu. Malyshev, E.A. Dmitrieva THE INFLUENCE OF SODIUM DICLOFENAC ON OXIDATIVE FUNCTIONS OF POLYMORPHONUCLEAR LEUKOCYTES OF BLOOD DONORS AND PATIENTS WITH HYPERSENSITIVITY TO SODIUM DICLOFENAC
We investigated the influence of sodium diclofenac on the secretion of reactive oxygen species by polymorphonuclear leukocytes of blood in donors and patients with hypersensitivity to sodium diclofenac using luminol- dependent chemiluminescence method. It revealed a reduction of reactive oxygen species in patients with hypersensitivity to sodium diclofenac when compared with donors. Activity of NADPH-oxidase was measured in all the investigated persons using lucigenin-dependent chemilumines-cence method. Activity of NADPH-oxidase decreased to a greater extent when the blood was influenced by diclofenac in patients with hypersensitivity to diclofenac than in donors.
Key words: sodium diclofenac, diclofenac intolerance, chemiluminescence, reactive oxygen species, polymorphonuclear leukocytes.
В последние годы стремительно растет количество больных, страдающих повышенной чувствительностью к нестероидным противовоспалительным препаратам (НПВП). В связи с этим имеется острая необходимость в лабораторно-диагностических методиках. Разработка и применение метода хемилюминес-ценции лейкоцитов периферической крови открыли новые возможности для выявления повышенной чувствительности к лекарственным препаратам, в том числе НПВП. Данный метод является наиболее точным и адекватным методом, позволяющим оценить секрецию активных форм кислорода (АФК) полиморфно-ядерными лейкоцитами (ПМЛ).
В 1985 году Пыцким В.И и соавторами [5] был открыт феномен специфического угнетения аллергеном стимулированной сульфатом бария люминолзависимой хеми-люминесценции лейкоцитов (СЛХЛ) периферической крови сенсибилизированных людей. На основе этого феномена был разработан
тест для выявления специфической сенсибилизации к пыльцевым, бытовым, лекарственным (пенициллин) и другим аллергенам. Затем было установлено изменение СЛХЛ крови и при псевдоаллергии. Так, например, добавление салицилата натрия или анальгина к пробам крови лиц с непереносимостью данных препаратов также вызывало угнетение СЛХЛ, которое оказалось дозозависимым. По результатам проведенных исследований был разработан безопасный и экономичный тест in vitro для диагностики непереносимости аспирина и анальгина [11]. Однако диагностика непереносимости НПВП хемилюминесцент-ным методом ограничивается определением повышенной чувствительности к аспирину и анальгину, а спектр применяемых в клинической практике НПВП довольно широк. Особое место среди НПВП занимает диклофенак натрия, который по праву считается «золотым стандартом» для лечения воспалительных и дегенеративных заболеваний суставов и по-
звоночника. Учитывая широкое применение диклофенака и рост числа больных с непереносимостью этого препарата, целью настоящей работы стало определение общих закономерностей изменения СЛХЛ крови под влиянием диклофенака у больных с непереносимостью данного препарата и доноров, а также оценить вклад НАДФН-оксидазной ферментной системы ПМЛ в выявляемые изменения СЛХЛ крови исследуемых лиц.
Материал и методы
Объектом исследования были 18 больных (12 женщин и 6 мужчин) с астматической триадой (бронхиальная астма, полипозный риносинусит, непереносимость НПВП) в возрасте от 19 до 70 лет. В анамнезе все пациенты испытывали приступы удушья при приеме диклофенака. Показания к включению пациентов в исследование: приступы экспираторного диспноэ при приеме диклофенака в любой лекарственной форме. Противопоказания: проявления острой или обострение хронической инфекции, прием антигистаминных препаратов, системных глюкокортикостероидов, антибиотиков, других НПВП за 2 недели до исследования. Контрольная группа практически здоровых людей состояла из 19 человек (11 женщин и 8 мужчин) в том же возрастном диапазоне, не принимавших НПВП в ближайшие 2 недели до эксперимента.
Для исследования использовалась гепа-ринизированная венозная кровь (50 ЕД/мл). Из образцов крови отбирали объемы, содержащие 1х106 лейкоцитов, и доводили их до 0,69 мл средой Хенкса. Затем к полученным образцам добавляли 0,01 мл растворенного в воде для инъекций диклофенака натрия (Фармстандарт, Россия) в различных концентрациях. В контрольные пробы добавляли воду для инъекций в том же объеме. Пробы инкубировали в течение 45 минут при температуре 37°С при постоянном перемешивании. После инкубации проводили измерение интенсивности хемилюминесценции (ХЛ) проб
на 36-кюветном биохемилюминесцентном анализаторе БЛМ 3606 - 01 (СКТБ «Наука» КНЦ СО РАН, Россия), сигнал от которого поступал на персональный компьютер и анализировался с помощью программы BLM-Obrab. В качестве активаторов свечения использовали люминол (отражает суммарную выработку всех АФК) и люцигенин (отражает количество О2^, что связано с работой НАДФН-оксидазы ПМЛ) [2]. В кювету хеми-люминометра вносили 0,7 мл пробы после инкубации и 0,15 мл активатора (2мМ). После измерения спонтанной ХЛ добавляли 0,15 мл стимулятора свечения - сульфата бария (2мг/мл) и регистрировали уровень стимулированной ХЛ. Измерение ХЛ крови проводили в режиме постоянного перемешивания при температуре 37С. С помощью компьютерной программы BLM- Obrab определяли следующие параметры ХЛ: интенсивность спонтанной ХЛ, интенсивность максимальной ХЛ, интенсивность стимулированной ХЛ, равной разнице между максимальной и спонтанной ХЛ. При оценке влияния диклофенака на ХЛ крови определяли относительную интенсивность ХЛ, которую рассчитывали как отношение интенсивности стимулированной ХЛ в опыте к интенсивности стимулированной ХЛ в контроле. Статистическую обработку полученных результатов проводили на компьютере с применением программ «STATISTICA» версия 7.0 и Microsoft Excel 2007. Полученные результаты представляли в виде M±m (М -среднее арифметическое, m - ошибка среднего). Статистическую достоверность отличия измеряемых величин определяли, используя критерий Манна-Уитни. Различия считали достоверно значимыми при уровне p< 0,05.
Результаты и обсуждение
В первой серии экспериментов мы исследовали влияние диклофенака на интенсивность СЛХЛ крови доноров и больных с гиперчувствительностью к диклофенаку. Результат представлен в табл. 1.
Таблица1
Зависимость относительной интенсивности СЛХЛ крови от концентрации диклофенака у здоровых доноров и больных с повышенной чувствительностью к диклофенаку, М±т
Концентрация диклофенака, нМ Относительная интенсивность СЛХЛ Достоверность различий между донорами и больными
здоровые больные с гиперчувствительностью к диклофенаку
6 1,68±0,15* 0,84±0,13 p< 0,001
60 1,69±0,17* 0,93±0,06 p<0,001
300 1,28±0,15 0,79±0,09* p<0,01
750 1,02±0,07 0,46±0,10* p<0,001
1500 0,56±0,06* 0,29±0,06* p<0,005
3000 0,19±0,03* 0,13±0,04* p>0,02
*- р<0,05 по сравнению с контролем.
Как видно из табл. 1, имеется зависимость изменений относительной интенсивности СЛХЛ от концентрации диклофенака в
обеих группах исследуемых лиц. У доноров малые концентрации препарата (6 нМ, 60нМ) стимулируют СЛХЛ крови, однако по мере
увеличения концентрации наблюдается подавление СЛХЛ. У больных с повышенной чувствительностью к диклофенаку фаза стимуляции СЛХЛ отсутствовала, а угнетение СЛХЛ наступало при применении меньших концентраций препарата, чем у доноров. Практически на всех исследованных концентрациях препарата (за исключением максимальной 3000нМ) относительная интенсивность СЛХЛ у больных была достоверно меньше, чем у доноров.
Приведенные выше результаты свидетельствуют о том, что диклофенак модифицирует СЛХЛ цельной крови дозозависимо в группе доноров и у больных с непереносимостью диклофенака. Повышение СЛХЛ крови доноров при инкубации проб крови с малыми концентрациями диклофенака, вероятно, обусловлено стимулирующим влиянием на выработку АФК фагоцитами продуктов липоокси-геназного метаболизма арахидоновой кислоты (эйкозатетраеновых метаболитов, лейкотрие-на В4), образующихся в лейкоцитах под влиянием диклофенака [6,7]. Предполагается также, что эйкозатетраеновые метаболиты, являясь оксидантами, могут напрямую взаимодействовать с люминолом, усиливая ХЛ фагоцитов [1]. Кроме того, по литературным данным известно, что простагландины (ПГ), в частности ПГЕ1, снижают генерацию АФК ПМЛ [9]. Поскольку диклофенак угнетает циклоокси-геназный путь метаболизма арахидоновой кислоты, что сопровождается снижением синтеза ПГ, можно предположить, что уменьшение ингибирующего действия ПГЕ1 на образование АФК должно повышать образование последних.
Ингибирующее действие высоких концентраций диклофенака на СЛХЛ крови доноров может быть обусловлено ингибирова-нием активности фосфолипазы А2 [8], снижением синтеза эйкозатетраеновых метаболитов в лейкоцитах периферической крови, усилением его антиокислительной активности, в частности способности ингибировать процессы образования супероксиданионов в активированных фагоцитах [12]. Кроме того, при изучении регуляции оксидантных реакций в ПМЛ было выявлено, что НПВП вызывают скрытую переадаптацию (деактивацию) ПМЛ, ослабляющую чувствительность последних к вторичным стимулам [4].
При действии диклофенака на кровь больных с непереносимостью данного препарата мы отмечали более выраженное ингиби-рование СЛХЛ, проявляющееся при примене-
нии меньших концентраций препарата по сравнению с толерантными к диклофенаку лицами. Мы склонны полагать, что наблюдаемые различия в показателях СЛХЛ крови у больных с непереносимостью диклофенака и здоровых доноров при предынкубации проб крови с диклофенаком связаны с различным содержанием и соотношением в плазме медиаторов, а также взаимодействием медиаторов с различными типами рецепторов на ПМЛ и, возможно, различной экспрессией этих рецепторов у здоровых и больных с непереносимостью диклофенака. В пользу этого предположения говорят ранее полученные Пыцким В.И. и соавторами [10] данные об участии ги-стаминового механизма в подавлении СЛХЛ крови больных с непереносимостью аспирина и/или анальгина при инкубации проб крови с салицилатом натрия или анальгином. По-видимому, медиаторы, воздействуя на фагоцитирующие ПМЛ, способны изменять активность ферментов окислительного метаболизма ПМЛ и, следовательно, модифицировать СЛХЛ крови. В частности, при изучении влияния гистамина, используемого в различных концентрациях, на окислительный метаболизм ПМЛ было выявлено, что гистамин дозозависимо изменяет активность НАДФН-оксидазной и миелопероксидазной ферментных систем ПМЛ [3].
Для того, чтобы оценить вклад НАДФН-оксидазы ПМЛ в выявляемые изменения СЛХЛ крови исследуемых лиц, во второй серии опытов мы исследовали активность НАДФН-оксидазы в образцах крови доноров и больных методом стимулированной сульфатом бария люцигенинзависимой ХЛ. После предварительной инкубации проб крови с диклофенаком в указанных концентрациях регистрировали интенсивность стимулированной люцигенинзависимой ХЛ (СЛЦХЛ) и рассчитывали относительную интенсивность СЛЦХЛ как отношение интенсивности СЛЦХЛ опытной пробы к интенсивности СЛЦХЛ контрольной. Результаты представлены в табл. 2.
Из табл. 2 видно, что воздействие дик-лофенака на кровь доноров и больных сопровождается дозозависимым снижением относительной интенсивности СЛЦХЛ, причем у больных наблюдаемое снижение более выражено. Данный результат свидетельствует, что активность НАДФН-оксидазы ПМЛ у больных снижается в большей степени, чем у доноров.
Таблица 2
Зависимость относительной интенсивности СЛЦХЛ крови от концентрации диклофенака у здоровых доноров и больных с повышенной чувствительностью к диклофенаку, M±m_
Концентрация диклофенака, нМ Относительная интенсивность СЛЦХЛ достоверность различий между донорами и больными
здоровые больные с гиперчувствительностью к диклофенаку
6 0,94±0,08 0,72±0,07* p<0,05
60 0,88±0,04* 0,71±0,06* p<0,05
300 0,82±0,02* 0,67±0,04* p<0,001
750 0,79±0,04* 0,61±0,06* p<0,05
1500 0,74±0,02* 0,53±0,04* p<0,001
3000 0,70±0,06* 0,49±0,07* p<0,05
*- p<0,05 по сравнению с контролем.
Выводы
1. При воздействии диклофенака на кровь больных с непереносимостью диклофенака и доноров выявилось дозозависимое изменение СЛХЛ. Интенсивность СЛХЛ крови у больных была достоверно ниже таковой у доноров практически на всех исследованных концентрациях препарата.
2. Воздействие диклофенака на кровь больных с непереносимостью диклофенака и доноров сопровождается дозозависимым угнетением активности НАДФН-оксидазной
ферментной системы ПМЛ. Активность НАДФН-оксидазы ПМЛ снижается в большей степени у больных с непереносимостью дик-лофенака, чем у доноров.
3. Выявленные достоверные различия показателей СЛХЛ крови под влиянием дик-лофенака у доноров и больных с непереносимостью данного препарата открывают возможность применения хемилюминесценого метода для диагностики повышенной чувствительности к диклофенаку натрия.
Сведения об авторах статьи: Чаусова Светлана Витальевна - к.м.н., доцент кафедры общей патологии медико-биологического факультета ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России. Адрес: 117997, Москва, ул. Островитянова, 1. Тел./факс: (495) 434 8764. Email: svetlana_chau@mail.ru.
Бондарева Галина Петровна - д.м.н., профессор кафедры иммунологии ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России. Адрес: 117997, Москва, ул. Островитянова, 1. Тел./факс: (499) 618 2526. E-mail: bondarev-galina@yandex.ru. Усанова Елена Алексеевна - ассистент кафедры общей патологии медико-биологического факультета ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России. Адрес: 117997, Москва, ул. Островитянова, 1. Тел./факс: (495) 434 8764. Email: usanova.alena@bk.ru.
Евстратова Виктория Сергеевна - студентка медико-биологического факультета ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России. Адрес: 117997, Москва, ул. Островитянова, 1.
Малышев Игорь Юрьевич - д.м.н., профессор, зав. кафедрой патофизиологии лечебного факультета ГБОУ ВПО МГМСУ Минздрава России. Адрес: 105275, Москва, ул. Бориса Жигуленкова, 23/1. E-mail: Iymalyshev1@mail.
Дмитриева Екатерина Александровна - к.м.н., доцент кафедры ЮНЕСКО «Здоровый образ жизни - залог успешного развития» ГБОУ ВПО МГМСУ Минздрава России. Адрес: 127473, Москва, ул. Делегатская 20/1. Тел./факс (495)6818831
ЛИТЕРАТУРА
1. Бизунок, Н.А. Влияние противовоспалительных средств на фагоцитарную генерацию оксидантов // Белорусский медицинский журнал. - 2002. - № 2. - С. 56-58.
2. Владимиров, Ю.А. Хемилюминесценция клеток животных/ Ю.А. Владимиров, М.П. Шерстнев // Итоги науки и техники, сер. Биофизика. - Т. 24. - М.: ВИНИТИ, 1989. - 176 с.
3. Влияние гистамина на функциональные свойства нейтрофилов и интенсивность процесса пероксидного окисления нейтрофи-лов в крови доноров /А. Ю. Искусных, О. В. Башарина, В. Г. Артюхов, В. В. Алабовский // Вестник ВГУ. Серия: Химия. Биология. Фармация. - 2008. - №1. - С.93-96.
4. Маянский, А.Н. НАДФН - оксидаза нейтрофилов: активация и регуляция/А.Н. Маянский //Цитокины и воспаление - 2007. -№3. - С.10-12.
5. Пыцкий, В.И. Способ выявления сенсибилизации организма при аллергических заболеваниях/ В.И. Пыцкий, Ю.П. Сюсюкин, О.Ю. Филатов, М.П. Шерстнев: Авторское свидетельство №»1436643; Приоритет 13.12.85; зарегистрир. 8.07.88.
6. Сала, А. Лейкотриены: липидные биоэффекторы воспалительных реакций./ А.Сала, С. Зарини, М. Болла // Биохимия. - 1998. -Т. 63. Вып. 1. - С. 101-110.
7. Czech, W. Chemotactic 5-oxo-eicosatetraenoic acidsinduce oxygen radical production, Ca2+-mobilization, and actin reorganization in human eosinophils via a pertussis toxin-sensitive G-protein. / W. Czech, M. Barbisch, K. Tenscher // J. Invest. Dermatol. - 1997. -Vol.108, № 1. - P. 108-112.
8. Dai H.-F., Wang X.-W., Zhao K. Role of nonsteroidal anti-inflammatory drugs in the prevention of post-ERCP pancreatitis: a metaanalysis // Hepatobiliary Pacreat. Dis. Int. - 2009. - V. 8. - P.
9. Kitsis, E.A. The prostaglandin paradox: additive inhibition of neutrophil function by aspirin-like drugs and the prostaglandin El analog misoprostol/ E.A Kitsis, G. Weissmann, S.B. Abramson //J.Rheumatol. - 1991. - V.18, N10. - P.1461-1465.
10. Pytsky, V.I. Role of histamine in inhibition of stimulated luminol-depended chemiluminescence of blood leucosytes induced by salicylate sodium or metamizole sodium (analgin) in aspirin or/and analgin sensitive patients./ V.I. Pytsky, O.Ju. Filatov, S.V. Chausova//Eur.J. of Clin. Che.& Clin.Biochem. -1997. - V.35,N9. - P.94.
11. Pytsky, V.I. In vitro diagnosis of pseudoallergic reaction to salicylate sodium and metamizole sodium(analgin)/ V.I. Pytsky, O.Ju. Filatov, S.V. Chausova // XYI Intern. Congr. Allergol. And Clin. Immunol., Cancum, Mexico, 1997. - P. 46.
12. Takayama, F. Effect of diclofenak, a nonsteroidal anti-inflammatory drug, on lipid peroxidation caused by ischemia-reperfusion in rat liver/ F. Takayama, T. Egashira, Y. Yamanaka // Jap. J. Pharmacol. - 1994. - 64, N. 1. - P. 71-78.
