CC BY
60
УДК 615.275
с.м. Николаев, л.н. Шантанова, А.Г. Мондодоев, А.о. Занданов, с.в. Лемза, O.A. Чукаев
свободнорадикальное окисление и скрининг лнтиоксидлнтов, адаптогенов с использованием биотест-систем
Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН (Улан-Удэ) Бурятский государственный университет (Улан-Удэ) Иркутский государственный институт усовершенствования врачей (Иркутск)
В работе рассматриваются вопросы о роли свободных радикалов в развитии болезней, и обосновывается актуальность поиска новых антиоксидантных и. адаптогенных средств из растительного сырья, с использованием, ферментных систем..
Ключевые слова: свободные радикалы, неферментные и ферментные системы, антиоксиданты, биотест-системы, растительные средства
FREE RADicAL oxiDATioN AND scREENiNG oF ANTioxiDANTs,
adaptogens with application of biotest-systems
S.M. Nikolayev, L.N. Shantanova, A.G. Mondodoyev, A.O. Zandanov, S.V. Lemza,
S.A. Chukayev
Institute of general and experimental biology, Ulan-Ude Buryat state university, Ulan-Ude Irkutsk Irkutsk state institute of physicians advanced training, Irkutsk
The article describes the role of free radicals in development of diseases, and the actuality of searching new
antioxidant and adaptogen drugs from herbal material with application of enzyme systems.
Key words: free radicals, nonenzyme and enzyme system, antioxidants, biotest-systems, herbal drugs
Известно, что кислород является одним из наиболее активных и распространенных в аэробном организме е-акцепторов и в 90 % случаев становится конечным звеном всех свободноради-кальных процессов независимо от первичного их происхождения [9, 10]. Образующиеся активные формы кислорода, так называемые свободные радикалы, играют важную роль в биохимических и биофизических процессах в живом организме при его физиологическом и патологическом состояниях. Большинство образующихся радикалов высоко активны и цитотоксичны. Они вызывают повреждения мембранных образований клеток, нуклеиновых кислот, структурных белков, коллагена, влияют на внутриклеточный уровень кальция, запускают каскад, ведущий к апоптозу, некрозу клеток [3, 13, 14]. Свободнорадикальные процессы, как было установлено нами, могут развиваться при резком снижении или прекращении поступления кислорода в орган или ткани. В условиях дефицита кислорода в ишемизированном органе в результате активации свободнорадикального окисления биомакромолекул, в частности, мембранных липидов происходит накопление высокотоксичных перекисей липидов, особенно липидного пероксирадикала и других метаболитов свободнорадикальных реакций, модифицирующих липидный состав мембран и повышающих проницаемость их, в результате которых изменяются функция и структура мембран клеток. Установлено было, что интенсификация свободнорадикальных реакций в мембранных структурах клеток является пусковым механизмом
в развитии ишемических повреждений различных органов (сердца, головного мозга, печени, почек и т.д.). Фундаментальное, научное значение данного открытия состоит в том, что оно раскрыло новый, ранее неизвестный молекулярно-биологический механизм повреждения органов. Эти представления явились стимулирующими для большого количества исследований в последующем как в нашей стране, так и за рубежом и позволили установить значение активации свободнорадикальных процессов в патогенезе многих заболеваний и предложить новый методический подход в фармакотерапии и профилактике распространенных болезней [10].
Практическое значение данного открытия состоит в том, что на основе определения метаболитов свободнорадикальных реакций и состояния антиоксидантной защиты сформулированы были и предложены новые критерии оценки тяжести заболеваний, обратимости повреждений органов, что особенно важно при инфаркте миокарда, инсультах головного мозга, повреждении печени, почек и других органов [9, 10].
Наиболее активными (агрессивными), как известно, свободными радикалами являются упомянутый липидный пероксирадикал, гидрок-сирадикал и алкоксильный радикал (табл. 1). В последние десятилетия в фармакологии появилась новая область, связанная с открытием роли оксида азота. Являясь свободным радикалом, оксид азота играет ключевую роль в контроле и поддержании гомеостаза (состоятельности сердечно-сосудистой системы, дыхания, иммунитета, функциональной
системы пищеварения, участвует в нейропереда-точных механизмах и т.д.), но также в больших концентрациях является цитотоксическим агентом [11]. Целый ряд патологических состоянии также может быть связан с дефицитом или перепродукцией оксида азота и других свободных радикалов.
В организме животных и человека свободно-радикальные реакции, как известно, находятся под контролем системы антиоксидантной защиты [3], включающей ферментные и неферментные механизмы. Неферментная система антиокси-дантной защиты включает низкомолекулярные гидрофобные, гидрофильные вещества (витамины, белки, хелатирующие двухвалентные ионы железа или меди), локализованных в цитоплазме клеток, крови, биомембранах [3, 8, 10, 13]. Они выполняют, в основном, роль ловушек (перехватчиков) свободных радикалов. Они «тушат» свободные радикалы, забирают избыток энергии, тормозят развитие цепной реакции образования новых радикалов. Иной механизм лежит в основе ферментной защиты. Ферменты превращают активные формы кислорода в перекись водорода и менее агрессивные радикалы, а затем уже их превращают в воду и обычный, полезный кислород. Первая линия защиты при этом регулируется супероксиддисмутазой [8, 11], которая является ключевым ферментом собственно антиоксидантной системы, катализируя реакцию дисмутации супероксидного аниона
(•О2")
• О2- + ^О2- + 2Н+ ^ Н2О2 + О2
Далее, в уменьшении свободных радикалов участвуют глутатионпероксидаза и каталаза [4, 5]. Глутатионпероксидаза (КФ 1.11.1.9) катализирует окисление восстановленной формы глутатиона (Г^Н) в присутствии Н2О2 или липидного перок-сида ^ООН).
Н2О2 + 2r-SH ^ r-SS-r + 2Н2О LOOH + 2r-SH ^ r-SS-r + LOH + Н2О Каталаза (КФ 1.11.1.6) расщепляет перекись водорода [5].
2Н2О2 ^ 2Н2О + О2 Фермент глутатионредуктаза (КФ 1.6.4.2.) катализирует восстановление дисульфида глутатиона (окисленного глутатиона — r-SS-Г) в глутатион (восстановленный Г-SH). Эта реакция является лимитирующим звеном восстановительного внутриклеточного глутатионового цикла, играющего важную роль в защите клеток.
Таким образом, свободнорадикальные механизмы лежат в основе развития многих заболеваний и актуальными представляются в настоящее время работы по поиску эффективных и безопасных антиоксидантных и противоишемических препаратов.
Основываясь на фундаментальных представлениях фармакологии, биохимии, а также о специфических фармакофорных группах, которые представляют собой элементы активных веществ, комплементарные структуре соответствующих мишеней, были разработаны тест-системы [2, 6, 7]. На Западе тестирование различных веществ in vitro с применением тест-систем проводится активно в последние десятилетия. Каждая фирма имеет свою, защищенную коммерческими правами, программу. Для проведения такого тестирования достаточно иметь соответствующие ферменты, выпускаемые современной промышленностью. В частности, в биотест-системах in vitro, как правило, в качестве объектов используют ключевые лимитирующие ферменты. Например, для тестирования на нейролептики используется ключевой фермент синтеза катехоламинов — тирозингидроксилаза. Известно также, что усиление действия ацетилхолина, на-
Таблица 1
Перечень активных форм кислорода
Наименование Химическая формула Относительная активность
Радикалы
Супероксид* •о2~ 0
Гидроксипероксидный радикал ноо 1
Гидроксильный радикал* нет 107
Алкоксильный радикал LO 104
Липидный пероксирадикал* LOO 1
Оксид азота NO -
Диоксид азота NO2 -
Не радикалы
Перекись водорода Н2О2 0
Синглетный кислород О2 0
Гипохлорная кислота HOCl 0
Пероксинитрит ONOO
Липидный гидропероксид* LOOH
Примечание: * - наиболее активные (агрессивные) формы.
копление его в органах и тканях может быть достигнуто путем блокирования основного фермента, разрушающего ацетилхолин — ацетилхолинэсте-разы. Этот фермент широко используется для поиска препаратов широкого спектра действия, в том числе для лечения болезни Альцгеймера и других нейродегенеративных заболеваний [1, 12]. При первичном скрининге антидепрессантов используют моноаминооксидазу — специфический фермент, катализирующий окислительное дезаминирование моноаминов.
Особенно важен скрининг веществ растительного происхождения, содержащих смесь нескольких соединений, и вследствие этого они оказывают многостороннее действие, благодаря наличию неферментной и ферментной систем защиты. Ферментным системам антиоксидантной защиты отводится основная роль [2, 3, 9, 10].
С учетом ключевой роли ферментов в анти-оксидантной защите, а также исходя из данных о том, что многие лекарственные средства могут оказывать про- и антиоксидантное действие, разработаны тест-системы на основе использования ферментов антиоксидантной защиты для выявления специфической фармакологической активности — антиоксидантной, адаптогенной, противомикробной, а также тест-система на основе НАДФН-оксидазы, позволяющая выявлять вещества с потенциальной иммуномодулирующей
активностью. В частности, для скрининга растительных средств на наличие антиоксидантной активности использованы специфические ферментные системы антиоксидантной защиты: глута-тионредуктаза, каталаза и глутатионпероксидаза. Известно, что для адаптогенных, антиоксидантных лекарственных средств характерны активация супероксиддисмутазы (СОД) и глутатионредук-тазы (ГР) [4]. Вещества с противовирусной, антимикробной активностью угнетают эти ферменты антиоксидантной защиты. Для адаптогенов характерна активация ГР и угнетение активности каталазы [5]. Фермент пируваткиназа (ПК) (КФ 2.7.1.40) является одним из ключевых ферментов углеводного обмена, участвующего в образовании АТФ при переносе фосфатного остатка от фосфое-нолпирувата на АДФ.
СООН ПК СООН
i + i
С-О~Р03Н2 + АДФ ^ С + АТФ
СН2 СН2
Активация этого фермента характерна для адаптогенов и антиоксидантов.
Исходя из этого, можно заключить, что на первом этапе вполне можно ограничиться этим набором ферментов для определения потенциальной антиоксидантной активности раститель-
Таблица 2
Влияние сбора «Байкальский-6» на биотест-системы in vitro
Скорость ферментативных реакций
№ п/п Условия опыта ГР КАТ ГП ПК
Мкмоль/ МГ'МИН % отн. Мкмоль/ МГ'МИН % отн. Мкмоль/ МГ'МИН % отн. Мкмоль/ МГ'МИН % отн.
1. Контроль без сбора 13,43 ± 0,17 100 10,70 ± 0,91 100 3,53 ± 0,03 100 3,85 ± 0,30 100
Байкальский-6 (отвар): 5 мкг/мл 13,36 ± 1,05 99,5 10,61 ± 0,72 99,2 3,48 ± 0,32 98,3 4,98 ± 0,38 129,4
10 мкг/мл 15,50 ± 0,38 100,5 9,63 ± 0,47 90,0 3,61 ± 0,12 102,3 5,12 ± 0,30 133,0
2. 50 мкг/мл 15,10 ± 0,09 112,4 7,88 ± 0,62 73,7 4,04 ±0,29 114,4 2,72 ± 0,24 70,6
100 мкг/мл 14,66 ± 0,39 109,1 7,68 ± 0,61 71,8 4,64 ± 0,39 131,5 1,48 ± 0,09 38,4
1 мг/мл 14,52 ± 0,90 108,8 7,23 ± 0,19 67,8 2,05 ± 0,15 58,0 0,44 ± 0,04 11,3
Таблица 3
Влияние гранул «Фитопроста» на биотест-системы in vitro
№ п/п Условия опыта Скорость ферментативных реакций
ГР КАТ ГП ПК
Мкмоль/ МГ'МИН % отн. Мкмоль/ МГ'МИН % отн. Мкмоль/ МГ'МИН % отн. Мкмоль/ МГ'МИН % отн.
1. Контроль (без гранул) 12,52 ± 0,31 100 11,48 ± 1,17 100 3,68 ± 0,32 100 2,45 ± 0,31 100
2. Гранулы «Фито-прост»: 1 мкг/мл 5 мкг/мл 10 мкг/мл 50 мкг/мл 100 мкг/мл 11,98 ± 0,87 95,7 11,10 ± 0,68 96,7 - - - -
12,88 ± 0,19 102,9 10,47 ± 0,29 91,2 3,16 ± 0,29 85,9 2,03 ± 0,20 82,8
13,07 ± 1,20 104,4 10,05 ± 0,93 87,5 2,44 ± 0,21 66,3 1,83 ± 0,23 84,6
13,29 ± 0,46 106,1 7,24 ± 0,18 63,1 1,87 ± 0,23 50,8 2,11 ± 0,20 86,1
12,11 ± 1,11 96,7 5,68 ± 0,48 49,5 1,69 ±0,13 45,9 2,07 ± 0,18 84,5
Таблица 4
Влияние таблеток «Нефрофит» на биотест-системы in vitro
№ п/п Условия опыта Скорость ферментативных реакций
ГР КАТ ГП ПК
Мкмоль/ МГ'МИН % отн. Мкмоль/ МГ'МИН % отн. Мкмоль/ МГ'МИН % отн. Мкмоль/ МГ'МИН % отн.
1. Контроль (без таблеток) 12,35 ± 0,07 100 13,03 ± 1,61 100 2,57 ± 0,09 100 2,24 ± 0,06 100
2. Таблетки «Нефрофит»: 5 мкг/мл 10 мкг/мл 50 мкг/мл 100 мкг/мл 12,37 ± 0,12 100,2 9,72 ± 0,69 74,6 2,30 ± 0,19 89,7 2,35 ± 0,11 105,1
12,95 ± 0,70 104,8 9,89 ± 0,82 75,9 2,48 ± 0,09 96,5 4,76 ± 0,28 212,5
13,14 ± 0,46 106,4 9,33 ± 0,85 70,2 2,97 ± 0,27 129,4 4,14 ± 0,17 184,8
12,49 ± 1,00 101,1 7,08 ± 0,40 54,3 1,21 ± 0,03 52,6 3,14 ± 0,07 140,1
ных средств. Изучению были подвергнуты сбор «Байкальский-6», гранулы «Фитопроста» и таблетки «Нефрофита» с использованием биотест-систем (глутатионредуктаза, глутатионпероксидаза, ката-лаза и пируваткиназа).
Установлено (табл. 2), что отвар «Байкальского-6» в концентрациях 5 мкг/мл — 1 мкг/мл уменьшает активность каталазы и одновременно повышает активность глутатионредук-тазы, что свидетельствует о наличии адаптогенной и противомикробной активности. Кроме того, этот сбор содержит вещества, стимулирующие углеводный обмен, судя по активации пируватки-назы. Активация ГП и ГР одновременно на фоне введения «Байкальского-6» свидетельствует о наличии антиоксидантной активности. В целом, «Байкальский-6» обладает широким спектром действия: антиоксидантным, адаптогенным и противомикробным действием.
Гранулы «Фитопроста» ингибируют (табл. 3) активность каталазы, ГП и ПК. Причем с увеличением концентрации активность ПК снижается, что характерно для антибактериальных средств.
Таблетки «Нефрофита» (табл. 4) проявляют себя как адаптогены и антиоксиданты, т.к. на фоне их повышается активность ГР и ГП. Снижение каталазной реакции свидетельствует о противомикробной активности (или противовирусной) активности. Повышение ПК на фоне введения в тест-систему «Нефрофита» может свидетельствовать о стимуляции энергетических процессов в клетках.
Дальнейшие исследования по полной программе доклинических испытаний подтвердили выявленные виды активности, данный подход целесообразен, экономически выгоден для первичного скрининга растительных препаратов. Результатами этого скрининга и других исследований явились регистрация и получение регистрационных удостоверений на их производство и применение в клинической практике как вспомогательных средств. Таблетки «Нефрофита» также представлены в ФК Росздравнадзора для получения разрешения на клиническое изучение в качестве нефрозащитного лекарственного препарата.
ЛИТЕРАТУРА
1. Андреева Н.И. Новое в изучении антидепрессантов-ингибиторов МАО / Н.И. Андреева, В.З. Горкин, М.Д. Машковский // Химико-фармацевтический журнал. — 1985. — № 6. — С. 650-657.
2. Бродова М.С. Применение специфических ферментных систем in vitro для выявления целевой биологической активности фармакологически активных веществ / М.С. Бродова, М.В. Минеева, Н.Б. Дороничева // Биомед. технологии и радиоэлектроника. — 2004. — № 1-2. — С. 24 — 30.
3. Дюмаев К.М. Антиоксиданты в патологии и терапии заболеваний ЦНС / К.М. Дюмаев, Т.А. Воронина, Л.Д. Смирнов. — М., 1995. — 145 с.
4. Кулинский В.И. Биологическая роль глута-тиона / В.И. Кулинский, Л.С. Колесниченко // Успехи совр. биологии. — 1990. — Т. 110, № 1 (4). — С. 20 — 28.
5. Метод определения активности каталазы / М.А. Королюк [и др.] // Лабор. дело. — 1988. — № 1. — С. 16—19.
6. Минеева М.Ф. Программа скрининга биологически активных веществ растительного происхождения / М.Ф. Минеева, В.К. Колхир, В.А. Быков // Фундаментальные исследования как основа создания лекарственных средств. — М., 1995. — С. 281.
7. Способ выявления веществ, обладающих антиоксидантными свойствами, in vitro : пат. Рос. Федерации 2181892 от 06.06.2001 / В.А. Быков, В.А. Дубинская, М.Ф. Минеева, Л.Б. Ребров, В.К. Колхир — 1 с.
8. Турпаев К.Т. Активные формы кислорода и регуляция экспрессии генов / К.Т. Турпаев // Биохимия. — 2002. — Т. 67, № 3. — С. 339 — 352.
9. Экспериментальная фитотерапия повреждений почек / С.М. Николаев [и др.]. — Улан-Удэ, 2003. — 184 с.
10. Явления изменения интенсивности пере-кисного окисления липидов (ПОЛ) в ишемизиро-ванных тканях (миокарда и почки) : дипл. за научное открытие № 393 от 13.12.1990 г. / С.М. Николаев [и др.]. — 1 с.
11. Dinitrosyl-dithiol-iron complezes, NO carries in vivo, as potent inhibitors of human glutation reductase and glutation-S-transferase / M.A. Keese [et al.] // Biochem. Pharmacol. - 1997. - Vol. 54. -P. 1307-1313.
12. Forette F. Alzheimer's disease and related disorders / F. Forette, E. Boller. - New-York, 1999. -631 p.
сведения об авторах
13. Nagaxawa H. Pathological aspects of active oxygens/free radicals / H. Nagaxawa, C. Genka, M. Fujishima // Jap. J. Physiol. - 1996. - Vol. 46, N 1. - P. 15-32.
14. Nassan H.M. Superoxide dismutases: detoxi-cation of a free radicals / H.M. Nassan, I. Fridovich // In: Ensimatic basis of detoxication. - 1980. -P. 311 -332.
Николаев Сергей Матвеевич - д.м.н., профессор, руководитель ЛЭФ Института общей и экспериментальной биологии СО РАН
Шантанова Лариса Николаевна - д.б.н., руководитель лаборатории безопасности биологически активных веществ Института общей и экспериментальной биологии СО РАН
Мондодоев Александр Гаврилович - к.м.н., с.н.с. лаборатории экспериментальной фармакологии (ЛЭФ) Института общей и экспериментальной биологии СО РАН (670047 Улан-Удэ, ул. Столбовая 60, кв. 113)
Занданов Александр Октябрьевич - декан медицинского факультета БГУ, к.м.н., доцент, заслуженный врач РФ и РБ, зам. министра здравоохранения РБ
Лемза Сергей Васильевич - к.б.н., с.н.с. лаборатории экспериментальной фармакологии (ЛЭФ) Института общей и экспериментальной биологии СО РАН (670047, г Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6)
Чукаев С.А. - кафедра фармакологии и традиционной медицины Бурятского государственного университета, г. Улан-Удэ, 67000, ул. Смолина, д. 24а.
