CC BY
9
БИОТЕХНОЛОГИЯ
УДК 543.31 DOI: 10.24412/2071-6176-2023-3-43-53
БИОСЕНСОР НА ОСНОВЕ МЕДИАТОРА ФЕРРОЦЕНА И АССОЦИАЦИИ ДРОЖЖЕЙ BLASTOBOTRYS ADENINIVORANS
И OGATEAEPOLYMORPHA ДЛЯ ЭКСПРЕСС-ОЦЕНКИ КОЛИЧЕСТВА ЛЕГКООКИСЛЯЕМЫХ ОРГАНИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ
А.С. Харькова, М.М. Герцен
В работе обсуждается возможность использования ассоциации дрожжей Blastobotrys adeninivorans и Ogateae polymorpha в условиях электрокаталитического окисления субстратов для формирования экспресс-системы оценки одного из основных показателей качества водных сред - индекса биохимического потребления кислорода (БПК). Аналитическая система позволяет зарегистрировать окисление 16 различных субстратов, входящих в индекс БПК. Долговременная стабильность составляет 19 суток. Чувствительность разработанной аналитической системы: 2 мг/дм3 - нижняя граница линейного диапазона БПК, позволяет проводить мониторинг качества поверхностных вод, БПК которых находится на границе предельно-допустимых значений (4 мг/дм3). Рецепторная система апробирована на образцах поверхностных вод, результаты экспресс-определения индекса БПК проб имеют высокую корреляцию к данным стандартного метода анализа.
Ключевые слова: ассоциации, дрожжи Blastobotrys adeninivorans, дрожжи Ogateae polymorpha, медиатор ферроцен, экспресс-мониторинг БПК.
Проблема загрязнения водных ресурсов достаточно актуальна [1-3]. Все больше и больше загрязняющих веществ попадают со сточными водами в природные объекты [4], при этом органические соединения являются доминирующими загрязнителями воды [5]. Одним из способов суммарной оценки уровня органических поллютантов в водных средах [6] является мониторинг индекса биохимического потребления кислорода (БПК), однако данный параметр связан с микробном метаболизмом и связан с содержанием растворенного кислорода, который необходим микроорганизмам для биодеградации органических компонентов. Данный процесс занимает минимум 5 суток (БПК5 - в индексе указывается время инкубации пробы) [6], что ограничивает использование параметра БПК для оценки загрязнения природной воды.
Для экспресс-анализа в России разработан Экспресс-БПК-анализатор компанией ООО "НПФ "Альфа БАССЕНС" [7, 8]. Измерительный блок автоматизированной системы определения БПК включает два кислородных электрода. Первый электрод фиксирует метаболическую активность иммобилизованных микроорганизмов активного ила. Второй обеспечивает измерение растворенного кислорода в
пробе. Дифференциальная схема подключения амперометрических датчиков обеспечивает выделение полезного аналитического сигнала, повышая точность анализа. Недостаток устройств - необходимость периодической замены электролита и мембраны кислородного электрода. Альтернативой может стать изобретение [9]. Биосенсор состоит из цилиндрического корпуса, содержащий анод из углеродного войлока с электрогенными анодофильными бактериями и катод. Недостатком указанного изобретения является высокая длительность единичного измерения - 3-6 часов, а состав используемого биоматериала может изменяться, что приводит к необходимости проводить предварительную калибровку биосенсора перед использованием, что также усложняет процедуру анализа.
Модификация электродов различными медиаторами электронного транспорта, соединениями, обеспечивающими перенос электронов от активных центров ферментных систем микроорганизмов на электрод, позволяет не только существенно сократить время анализа, но и перейти к портативным устройствам [10]. В стандартном методе определения БПК используют микроорганизмы активного ила, а также микроорганизмы аквариумной или речной воды [11], поэтому зачастую в рецепторных системах для оценки БПК применяют различные ассоциации микроорганизмов, что повышает корреляцию результатов стандартного и биосенсорного анализа [12].
Целью настоящей работы являлось исследование стабильности аналитического сигнала биоэлектрода на основе медиатора ферроцена и ассоциации дрожжей Blastobotrys adeninivorans BKM Y-2677 и Ogateae polymorpha BKM Y-2559 и возможности использования указанной системы для экспресс-мониторинга индекса БПК5.
Материалы и методы
Культивирование микроорганизмов. Для культивирования микроорганизмов, предоставленных Всероссийской коллекцией микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук - обособленного подразделения ФИЦ ПНЦБИ РАН (г. Пущино), использовали шейкер-инкубатор ES-20/60 («BioSan», Латвия). В состав среды входили следующие компоненты: глюкоза («Диаэм», Россия) - 1%, пептон («Panreac», Испания) - 0,5%, дрожжевой экстракт («Helicon», Россия) -0,05%. Температура, при которой проводили выращивание микроорганизмов в качалочных колбах в течение 18-20 часов, составляла 28 °С. Осадок клеток отделяли от ростовой среды с помощью центрифуг «TG16WS» (Поликом LTD, Россия) и «MiniSpin plus» (Eppendorf, Россия) при 7000 g в течение 10 мин.
Формирование биоэлектрода. Пастой «графитовая пудра-минеральное масло» следующего состава: 90 мг графитовой пудры («Fluka», Германия), 40 мкл парафинового масла («Fluka», Германия), 10 мг ферроцена («Aldrich», Германия), заполняли пластиковую трубку, площадь поверхности которой 6,3 мм2. Суспензию, содержащую дрожжи O. polymorpha и B. adeninivorans (1:1) с суммарным содержанием 330 мг сырого веса/мл использовали для модификации электрода. На поверхность зачищенной графитовой пасты добавляли 10 мкл суспензии дрожжей, по истечении 15 мин биоматериал фиксировали диализной мембраной с пределом пропускания 14 кДа («Roth», Германия) при помощи пластикового кольца.
Биосенсорные измерения. Рабочий биоэлектрод и насыщенный хлорсеребряный электрод сравнения подключали к гальванопотенциостату «IPC-micro» («НТФ Вольта», Россия). Во время измерений при потенциале 250 мВ электроды погружали в электрохимическую ячейку, заполненную калий-натрий фосфатным буферным раствором с рН = 6,8 (33 мМ KH2P04 + 33 мМ Na2HP04, «Диаэм», Россия). После установления стабильного уровня тока в ячейку вводили раствор анализируемого вещества и фиксировали скорость окисления как амплитуду силы тока. После каждого измерения буферным раствором промывали электрохимическую ячейку. Для калибровки биосенсора использовали модельный раствор с БПК5 205 мг/дм3 на основе глюкозы («Диаэм», Россия) и глутаминовой кислоты («Диаэм», Россия).
Стандартный метод оценки БПК. Инкубацию проб в течение 5 суток проводили в соответствии со стандартной методикой [11]. Изменение концентрации растворенного кислорода измеряли амперометрически с помощью БПК-термооксиметра ЭКСПЕРТ-001-4.0.1 (ООО «Эконикс-эксперт», Россия).
Результаты и их обсуждение
Дрожжи O. polymorpha и B. adeninivorans способны окислять широкий спектр окисляемых органических соединений [16, 17]. Штамм B. adeninivorans BKM Y-2677 относится к солетолерантным микроорганизмам [18]. Дрожжи O. polymorpha способны менять свою субстратную специфичность, что делает их перспективным биоматериалом в составе ассоциации для увеличения окислительной активности биорецепторного элемента [19].
На основе исследуемых культур, а также их комбинации (1:1) были сформированы графито-пастовые электроды, модифицированные ферроценом. Обладая электроактивностью ферроцен позволяет регистрировать окисление различных соединений биоматериалом, а при модификации графито-пастовых электродов обеспечивает высокую
скорость передачи электронов между ферментными системами микроорганизмов и графито-пастовым электродом [20]. Для исследуемых систем проводили оценку селективности по отношению к различным органическим субстратам, входящим в индекс БПЕС (рис. 1).
Рис. 1. Изменение селективности биоэлектродов на основе исследуемой ассоциации и биоэлектродов на основе монокультур О. ро1утогрка [21]
и Б. adeninivorans [21]
Биоэлектрод на основе ассоциации дрожжей О. ро!утогрИа и В. adeninivorans позволяет зарегистрировать окисление 16 субстратов (рис. 1), что приблизительно соответствует биосенсорам на основе монокультур О. ро!утогрИа (14 субстратов) [21] и В. adeninivorans (16 субстратов) [21]. Рецепторная система на основе ассоциации дрожжей не чувствительна к следующим субстратам: к фруктозе, метанолу, 3-метилбутанолу-1, аспарагиновой кислоте, тогда как рецепторные системы на основе отдельных штаммов обладают данной способностью, что может быть связано с конкуренцией микроорганизмов в составе ассоциации за указанные субстраты или кинетическими ограничениями массопереноса [17]. Следует отметить, что рецепторный элемент на основе сформированной дрожжевой ассоциации способен окислять субстраты, на которые индивидуальные штаммы, входящие в её состав, не реагировали: глицерин и бензоат калия. Можно предположить, что при создании
консорциума увеличился набор ферментов, с помощью которых и возможно окисление данных веществ, комбинированное действие микроорганизмов, заключающееся в использовании продуктов метаболизма друг друга, обеспечивает эффективность консорциума по сравнению с использованием отдельных штаммов микроорганизмов [17].
Стабильность биоэлектродов на основе ассоциации и индивидуальных культур, из которых она сформирована, оценивали по изменению аналитического сигнала при ежедневном введении модельного раствора глюкозы и глутаминовой кислоты.
4.5
3 4
3 3,5
ее л Си -> О
ё 2.5 ° ?
о -
13 1.5
н
аз -1 я 1
<5 0.5
О
А
Б
{3
{
1 1
1 1 , I
—3- —*--—
£ , 1
10 15 20 25
Время, сут.
В Г
Рис. 2. Долговременная стабильность биоэлектродов на основе: А - дрожжей В. adeninivorans; Б - дрожжей О. Ро1утогрНа; В - ассоциации дрожжей В. adeninivorans и О. polymorpha. Горизонтальной линией отмечено падение ответа биосенсора на 50% от максимального значения. Г - изменение субстратной специфичности биоэлектрода на основе ассоциации дрожжей
Динамика аналитического сигнала биоэлектродов на основе индивидуальных культур постепенно снижается, после 5-го дня (микроорганизмы В. adeninivorans - рис. 2А) и после 9-го дня (микроорганизмы О. ро!утогрИа - рис. 2Б) падает более чем на 50% от первоначального значения. Для биорецептора на основе ассоциации указанных культур характерен период адаптации длительностью сутки (рис. 2В), а после 19 суток ответ биосенсора снижается более, чем на 50%
от максимального значения. Долговременная стабильность биорецептора на основе дрожжевой ассоциации В. adeninivorans и О. ро!утогрка составляет 19 дней, что больше, чем у В. adeninivorans - 5 дней [21] и у О. ро!утогрка - 9 дней. Оценку стабильности биоэлектрода на основе ассоциации проводили по анализу изменения селективности с помощью следующих субстратов: лактоза, сорбит, 2-метилпропанол-1, фруктоза и глицерин. Лактозу и сорбит окисляют дрожжи В. adeninivorans [21], в отличие от дрожжей О. polymorpha. В свою очередь биоэлектрод на основе дрожжей О. polymorpha способен окислять 2-метилпропанол-1, в отличие аналога на основе В. adeninivorans. Фруктоза - субстрат, к которому чувствительны биоэлектроды на основе монокультур дрожжей, однако аналог на основе ассоциации нечувствителен к данному веществу, глицерин - субстрат на который зарегистрирован отклик для ассоциации, но биорецепторные элементы на основе индивидуальных штаммов не способны к его окислению (рис. 2Г). В 1-й день наблюдается ответ только на 3 субстрата - сорбит, 2-метилпропанол-1 и глицерин, что вероятно связано с адаптацией микроорганизмов, причем скорость окисления субстратов ассоциацией падает в следующем ряду: глицерин > 2-метилпропанол-1 > сорбит. На 8-й день появляется небольшой ответ рецепторного элемента на фруктозу, а на 18-й - на лактозу. В целом можно отметить, что скорость окисления субстратов падает в ряду глицерин > 2-метилпропанол-1 > сорбит > фруктоза > лактоза на протяжение всего исследуемого периода.
Для оценки диапазона определяемых БПК5 получены градуировочные зависимости аналитического сигнала от индекса БПК5 модельного раствора на основе глюкозы и глутаминовой кислоты (табл. 1.)
Таблица 1
Параметры работы рецепторных элементов на основе ассоциации микроорганизмов и индивидуальных культур
Биоматериал Медиатор Стабильность, сут. Диапазон измеряемых БПК5, мг/дм3 Ссылка
O. polymorpha, B. adeninivorans Ферроцен 19 2-140 Данная работа
O. polymorpha Ферроцен 9 —* [21]
B. adeninivorans Ферроцен 5 2,5-21 [21]
Saccharomyces cerevisiae Гексацианноферрат (III) калия, менадион —* 10-220 [22]
Консорциум на основе Shewanella loihica PV-4 - —* 49-723 [23]
P. yeei, B. adeninivorans Ферроцен 5 49-290 [24]
Примечание: -* не определено.
Таким образом, предлагаемый в данной работе биоэлектрод на основе дрожжей О. ро!утогрИа и В. adeninivorans обладает более высоким биотехнологическим потенциалом, чем система на основе ассоциации бактерий Р. yeei и дрожжей В. adeninivorans^. стабильность аналитического сигнала (рис. 2), высокая чувствительность (табл. 1) позволяет проводить анализ вод, БПК которых находится в пределах ПДК. Следует отметить, что нижняя граница определяемых концентраций не уступает биорецепторным элементам на основе индивидуальных культур [10]. Благодаря стабильному составу, отсутствию конкуренции между микроорганизмами, рецепторный элемент на основе сформированной ассоциации более предпочтителен биорецептору на основе активного ила, так как упрощается процесс стандартизации при формировании аналитических систем.
Анализ образцов воды природного происхождения проведён с использованием разработанной экспресс-системы на основе комбинации дрожжей В. adeninivorans и О. polymorpha и стандартным методом [11]. Результаты полученных измерений представлены в табл. 2.
Таблица 2
Результаты апробации БПК-биосенсора
Место отбора БПК5, мг/дм3
биосенсор ПНД Ф[11]
г.\- > 8,8±0,4 8,4±0,2
Средний пруд в ЦПКиО им. П.П. Белоусова
Ручей Латинка (пос. Косая Гора) 6,3±0,8 6,1±0,1
В результате статистической обработки полученных разными методами результатов подтверждено незначимое различие полученных значений БПК5 исследуемых образцов. Следует отметить, что значения
БПК5 проб превышают установленный ПДК [25], что может быть связано с сезонностью пробоотбора (ранняя весна).
Заключение
Сформирован биоэлектрод на основе ассоциации двух штаммов дрожжей для экспресс-оценки БПК5. Оценена динамика аналитического сигнала и характера окисления субстратов в ходе эксплуатации системы. Оценена чувствительность: нижняя граница БПК5 биосенсора составляет 2 мг/дм3, что позволяет проводить экспресс-анализ проб, значения которых находятся в пределах установленных ПДК (4 мг/дм3). Проведенный анализ проб с помощью разработанной лабораторной модели биосенсора и стандартным методом показал, что полученные разными методами результаты анализа статистически незначимо различаются. Предложенный биоэлектрод может быть использован для экспресс-мониторинга БПК5 образцов поверхностных вод.
Работа выполнена в рамках гранта Президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых российских ученых -кандидатов наук, номер гранта № МК-4815.2022.1.4.
Список литературы
1. A comprehensive review on water pollution, South Asia Region: Pakistan / R. Noor, A. Maqsood, A. Baig [et al.] // Urban Climate. 2023. V. 48. N. 101413.
2. R. Saberifar. Climate Change and Water Crisis (Case Study, Mashhad in Northeastern Iran) // Polish Journal of Environmental Studies. 2023. V. 32. N. 1.
3. A. du Plessis. Water resources from a global perspective // South Africa's Water Predicament: Freshwater's Unceasing Decline. Cham : Springer International Publishing, 2023. P. 1-25.
4. Non-point source pollution risks in a drinking water protection zone based on remote sensing data embedded within a nutrient budget model / G. Wang, J. Li, W. Sun [et al.] // Water research. 2019. V. 157. P. 238-246.
5. A. Sharma, M. Chhabra. The versatility of microbial fuel cells as tools for organic matter monitoring // Bioresource Technology. 2023. N. 128949.
6. Column adsorption of biological oxygen demand, chemical oxygen demand and total organic carbon from wastewater by magnetite nanoparticles-zeolite A composite / Kovo A.S., Alaya-Ibrahim S., Abdulkareem A.S. [et al.] // Heliyon. 2023. V. 9. N. 2.
7. Устройство для экспресс-анализа биохимического потребления кислорода: пат. ПМ № 161 808 Рос. Федерация: МПК G01N 33/18, G01N 27/26 / Д.А. Албантов, М.В. Гришин; заявитель ООО "НПФ "Альфа БАССЕНС" - № 2015121811/15; заявл. 08.06.2015; опубл. 10.05.2016, бюл. № 13, патентообладатель ООО "НПФ "Альфа БАССЕНС".
8. Способ экспресс-анализа биохимического потребления кислорода и устройство для его осуществления: пат. изобретение № 2 608 443 Рос. Федерация: МПК G01N 33/18, G01N 27/26 / Д.А. Албантов, М.В. Гришин; заявитель ООО "НПФ "Альфа БАССЕНС" - № 2015120235; заявл. 28.05.2015; опубл. 18.01.2017, бюл. № 2, патентообладатель ООО "НПФ "Альфа БАССЕНС".
9. Биосенсор для определения наличия органических веществ в воде: пат. изобретение № 2 650 634 C1 Рос. Федерация: МПК G01N 33/18, G01N 27/26 / Н.Н. Волченко, А.А. Самков, А.А. Лазукин, А.А. Худокомов; заявитель Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный университет" (ФГБОУ ВО "КубГУ") - № 2017121716; заявл. 20.06.2017; опубл. 16.04.2018, бюл. № 11, патентообладатель ФГБОУ ВО "КубГУ".
10. Microbial biosensors for rapid determination of biochemical oxygen demand: Approaches, Tendencies and Development Prospects / V.A. Arlyapov, Y.V. Plekhanova, O.A. Kamanina [et al.] // Biosensors. 2022. V. 12. I. 10. N. 842.
11. ПНДФ 14. 1:2:3:4. 123-97. Количественный химический анализ вод. Методика выполнения измерений биохимической потребности в кислороде после n-дней инкубации (БПКполн) в поверхностных пресных, подземных (грунтовых), питьевых, сточных и очищенных сточных водах. -М.: 1997. 25 с.
12. Comparative analysis of microbial fuel cell based biosensors developed with a mixed culture and Shewanella loihica PV-4 and underlying biological mechanism / Y. Yi, B.Xie, T. Zhao, H. Liu [et al.] //Bioresource technology. 2018. V. 265. P. 415-421.
13. Anode surface modification regulates biofilm community population and the performance of micro-MFC based biochemical oxygen demand sensor / N. Xiao, R. Wu, J.J. Huang [et al.] // Chemical Engineering Science. 2020. V. 221. N. 115691.
14. Зайцева А.С., Арляпов В.А., Решетилов А.Н. Медиаторный биосенсор на основе микроорганизмов активного ила для экспресс-определения низких значений БПК5 // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии им. Ю.А. Овчинникова. 2017. Т. 13. № 1. С. 50-57.
15. Design, optimization and application of a highly sensitive microbial electrolytic cell-based BOD biosensor / Z. Wang, C. Liao, Z. Zhong [et al.] // Environmental Research. 2023. Т. 216. С. 114533.
16. Yeast-based self-organized hybrid bio-silica sol-gels for the design of biosensors / O.N. Ponamoreva, T.V. Kamanina, V.A. Alferov [et al.] // Biosensors and Bioelectronics. 2015. V. 67. P. 321-326.
17. A yeast co-culture-based biosensor for determination of waste water contamination levels / N. Y. Yudina, V.A. Arlyapov, M.A. Chepurnova [et al.] // Enzyme and microbial technology. 2015. V. 78. P. 46-53.
18. Measurement of biodegradable substances using the salt-tolerant yeast Arxula adeninivorans for a microbial sensor immobilized with poly(carbamoyl)sulfonate (PCS). Part II: Application of the novel biosensor to real samples from coastal and island regions. / C. Chan, M. Lehmann, K. Tag [et al.] // Biosens Bioelectron. 1999. V.14. I. 3. P. 295-302.
19. Silica sol-gel encapsulated methylotrophic yeast as filling of biofiltersfor the removal of methanol from industrial wastewater / O.A. Kamanina, D.G. Lavrova, V.A. Arlyapov [et al.] //Enzyme and Microbial Technology. 2016. V. 92. P. 94-98.
20. A mediator microbial biosensor for assaying general toxicity / A.S. Kharkova, V.A. Arlyapov, A.D. Turovskaya [et al.] // Enzyme and microbial technology. 2020. V. 132. N. 109435.
21. A kinetic approach to the formation of two-mediator systems for developing microbial biosensors as exemplified by a rapid biochemical oxygen demand assay / A.S. Kharkova, V.A. Arlyapov, A. Ilyukhina [et al.] // 3 Biotech. 2021. V. 11. I. 5. P. 1-13.
22. Bacterial cellulose immobilized S. cerevisiae as microbial sensor for rapid BOD detection / C. Zhao, G. Wang, M. Sun [et al.] // Fibers and Polymers. 2021. V. 22. I. 5. P. 1208-1217.
23. Comparative analysis of microbial fuel cell based biosensors developed with a mixed culture and Shewanella loihica PV-4 and underlying biological mechanism / Y. Yi, B. Xie, T. Zhao [et al.] // Bioresource technology. 2018. V. 265. P. 415-421.
24. Харькова А. С., Арляпов В. А. Потенциал ассоциации дрожжей Blastobotrys adeninivorans и бактерий Paracoccus yeei для экспресс-мониторинга биохимического потребления кислорода // Известия ТулГУ. Естественные науки. 2023. № 1. С. 92-102.
25. СанПиН 2.1.5.980—00. Водоотведение населенных мест, санитарная охрана водных объектов. Гигиенические требования к охране поверхностных вод. Утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 22 июня 2000 г. М., 2000.
Харькова Анна Сергеевна, канд. хим. наук, доцент, Anyuta_Zaytseva@mail.ru, Россия, Тула, Тульский государственный университет,
Герцен Мария Михайловна, млад. науч. сотр. лаборатории химии и экологии почв, mani.gertsen@gmail.com, Россия, Тула, Тульский государственный педагогический университет им. Л. Н. Толстого
A BIOSENSOR BASED ON THE FERROCENE MEDIATOR AND ASSOCIATION OF BLASTOBOTRYS ADENINIVORANS AND OGATEAE POLYMORPHA YEAST FOR RAPID EASILY OXIDIZABLE ORGANIC
SUBSTANCES ASSESSMENT
A.S. Kharkova, M.M. Gertsen
The possibility of using the association of the yeast Blastobotrys adeninivorans and Ogateae polymorpha under the conditions of electrocatalytic oxidation of substrates for rapid monitoring of the biochemical oxygen demand (BOD) index was discussed. The analytical system makes it possible to detect the oxidation of 16 different substrates included in the BOD index. The sensitivity of the developed analytical system (the lower limit of the determined BOD is 2 mg/dm3) makes it possible to analyze the water samples with BOD of maximum permissible values range (4 mg/dm3). The receptor system has been tested on surface water samples; the results of express determination of the BOD index of samples have a high correlation with the data of the standard analysis method.
Keywords: associations, Blastobotrys adeninivorans yeast, Ogateae Polymorpha yeast, ferrocene mediator, rapid BOD monitoring.
Kharkova Anna Sergeevna, candidate of Chemistry, docent, Anyuta_Zaytseva@mail.ru, Tula, Russia, Tula State University,
Gertsen Maria Mikhailovna, Junior Researcher, Laboratory of Soil Chemistry and Ecology, mani.gertsen@gmail.com, Tula, Russia, Tula State Lev Tolstoy Pedagogical University
