CC BY
47
УДК 543.55:579.222.2
ФОРМИРОВАНИЕ РЕЦЕПТОРНОЙ СИСТЕМЫ «МИКРООРГАНИЗМЫ E. COLI - МЕДИАТОР» ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИНДЕКСА БИОХИМИЧЕСКОГО ПОТРЕБЛЕНИЯ
КИСЛОРОДА
А. С. Харькова, А. С. Илюхина, А. А. Афонина, В. А. Арляпов
Медиаторы - ферроцен, 1,1'-диметилферроцен, ферроценкарбоксальдегид, ферроценацетонитрил, нейтральный красный, 2,6-дихлорфенолиндофенол, тионин, метиленовый синий и феррицианид калия в сочетании с иммобилизованными бактериями Escherichia coli использовались в составе рецептора биосенсора. Установлено, что только гексацианоферрат (III) калия был эффективным электронным переносчиком для формирования биоэлектрода. Использование гексацианоферрата (III) калия позволяло формировать биосенсор, характеризующийся высокой долговременной стабильностью (21 сут), широкой субстратной специфичностью, нижней границей определяемых значений БПК5 - 0,4 мгО2/дм3 и временем измерения одной пробы 4 - 5 мин. При измерении проб воды получили высокую степень корреляции с результатами стандартного метода (R = 0,9900).
Ключевые слова: медиаторный биосенсор, индекс БПК5, бактерии Escherichia
coli.
Введение
Показатель биохимического потребления кислорода (БПК) относится к основному индикатору загрязнения водных объектов органическими веществами. По определению, БПК является количеством кислорода, израсходованного на аэробное биохимическое окисление под действием микроорганизмов, входящих в исследуемую пробу, в течение фиксируемого периода (обычно 5 суток, БПК5). Стандартный метод определения БПК, регламентированный в международных стандартах ИСО 5815-1:2003 и Российском ПНДФ 14. 1:2:3:4. 123-97, основан на измерении разности содержания растворенного кислорода до и после инкубации при установленных нормативными документами условиях. Основной недостаток методики - длительность анализа (5 суток), что не позволяет оперативно оценить качество очистки сточных вод. Кроме того, полученные результаты межлабораторных исследований могут расходиться более чем на 20% из-за различного состава активного ила, используемого в БПК-анализе [1]. В настоящее время все промышленные предприятия и водоочистные сооружения РФ используют для повседневного рутинного анализа сточных вод упомянутый метод БПК5.
Востребованность БПК-анализа способствовала возникновению альтернативных экспресс-методов, в частности созданию биосенсорных анализаторов, основанных на применении микроорганизмов, метаболизирующих широкий спектр органических соединений.
К настоящему времени известно несколько лабораторных моделей и промышленно выпускаемых биосенсорных анализаторов БПК. В обзоре [2] суммирована информация по БПК-сенсорам. Для того, чтобы на содержания органических и токсичных соединений, определяемое с помощью микробного биосенсора, не влияло количество растворенного кислорода в образце, используют биосенсоры медиаторного типа [3]. Принцип функционирования медиаторного биосенсора заключается в том, что в процессе окисления субстратов ферментными системами микроорганизмов распознающего элемента увеличивается концентрация восстановленной формы медиатора, которая в дальнейшем окисляется на электроде при наложении соответствующего потенциала, что вызывает прохождение тока через внешнюю нагрузку. Следует отметить, что в медиаторных микробных сенсорах генерируются токи в 100 - 1000 раз большие, чем при использовании кислородного электрода, что обеспечивает возможность дальнейшей миниатюризации биосенсоров [3].
В связи с этим, целью данной работы является формирование наиболее перспективной рецепторной системы «микроорганизм-медиатор» для создания амперометрического биосенсора для экспресс-определения индекса биохимического потребления кислорода.
Материалы и методы
Штамм микроорганизмов. В работе использовали бактерии Escherichia coli K802 предоставленные Лабораторией биологии плазмид ИБФМ РАН имени Г.К Скрябина.
Культивирование бактерий E. coli. Клетки Escherichia coli выращивали при температуре 28 ° С в течении суток на богатой минеральной среде Lysogeny broth (LB). Состав среды: триптон - 10 г/л, дрожжевой экстракт - 5 г/л, NaCl - 10 г/л, дистиллированная вода - 200 мл. Среду для выращивания клеток стерилизовали автоклавированием при давлении 1,1 атм. в течение 45 минут. Затем полученную биомассу центрифугировали при комнатной температуре при 10000 об/мин 10 минут. Далее центрифугат промывали 20 мМ фосфатном буфером pH 7,2. Осевшие клетки рассуспендировали в свежей порции буфера, распределяли по порциями и осаждали на центрифуге "Eppendorf' 5 минут 10000 об/мин. Промытую биомассу взвешивали и хранили в микропробирках при температуре 4 С.
Формирование рабочего электрода. Рабочий электрод формировали по методике, описанной в работе [4], наполняя приготовленной пастой «графитовая пудра-минеральное масло» пластиковую трубку с площадью рабочей поверхности 6,3 мм . Механически очищали поверхность электрода на которую затем помещали микроорганизмы. Микроорганизмы, иммобилизовали на поверхности электрода следующим образом. На рабочую поверхность электрода
наносили 5 мкл суспензии с содержанием клеток 200 мг сырого веса/мл и подсушивали при комнатной температуре в течение 15 мин. Для удерживания клеток на поверхности электрода применяли диализную мембрану, которую фиксировали при помощи пластикового кольца.
Электрохимические измерения окислительной активности биологического материала. Электрохимические измерения проводили при помощи гальванопотенциостата «IPC-micro» (ООО НТФ Вольта, Россия), интегрированного с ПК. Диапазон регистрируемых токов 5 нА -20 мкА. Ошибка измерения потенциала не больше 0,1 мВ для интервала ±5 мВ.
Регистрацию ответов биосенсоров проводили по двухэлектродной схеме. Рабочим электродом служил угольно-пастовый с иммобилизованными клетками, электродом сравнения - насыщенный хлорсеребряный. Измерения проводили в калий-натрий фосфатном буфере с рН=6,8. Измерения велись при непрерывном перемешивании раствора с медиатором, находящегося в электролитической ячейке, при помощи магнитной мешалки (300 об/мин). Измеряемым параметром сигнала сенсора явилась амплитуда изменения силы тока (мкА), определяемая как разность между конечным и начальным значениями токов до и после введения исследуемого раствора в измерительную кювету.
Электрохимические измерения вольтамперных зависимостей. Циклические вольтамперограммы регистрировали при
вольтамперометрического анализатора «Экотест-ВА» (ООО «Эконикс-Эксперт», Россия) по трехэлектродной схеме. Все измерения проводились при температуре 22 иС. Объем ячейки 30 cм .
Результаты и их обсуждения
Выбор медиаторов электронного транспорта. Одна из основных задач при разработке БПК-биосенсоров заключается в выборе эффективного медиатора переноса электронов от ферментных систем микроорганизмов к электроду. Способность микроорганизмов взаимодействовать с медиаторами электронного транспорта определяется доступностью ферментных систем для этих соединений и зависит как от природы клеток, так и от строения и свойств медиатора. В качестве медиаторов были выбраны следующие соединения: ферроцен, нейтральный красный, 2,6-дихлорфенолиндофенол, метиленовый синий, ферроценацетонитрил, гексацианоферрат (III) калия. При этом рабочий потенциал измерительной системы, при котором производятся измерения, может существенно отличаться от стандартного потенциала медиатора и определяется исходя из результатов циклических вольтамперограмм. В системах, с иммобилизованными бактериями в качестве рабочего потенциала был выбран потенциал анодного пика на вольтамперограмме: 250 мВ для ферроцена, 409 мВ для 1,1'-диметилферроцена, 601 мВ для
ферроценкарбоксальдегида, 338 мВ для ферроценацетонитрила, 335 мВ для нейтрального красного, 416 мВ для 2,6-дихлофенолиндофенола, 401 мВ для метиленового синего, 288 мВ для гексацианоферрат (III) калия. Рабочие потенциалы, найденные для растворимых медиаторов согласуются с полученными ранее.
Сформированные для БПК-биосенсоров системы на основе бактерий E. coli и водорастворимых и малорастворимых медиаторов тестировали на наличие аналитического сигнала при найденных редокс-потенциалах используемых медиаторов. При анализе субстратной специфичности дрожжей E. coli ответ биосенсора был получен при использовании 6 медиаторов из 8. Был проанализирован отклик биосенсоров на добавление 25 субстратов относящимся к различным классам органических соединений (рис. 1). В качестве субстратов были выбраны органические вещества, наиболее часто встречающиеся в стоках различных производств. Попадание таких веществ в водоемы приводит к существенному снижению уровня растворенного кислорода.
Рис.1. Субстратная специфичность клеток бактерий E. СоИ в присутствии медиаторов электронного транспорта
В целом, по полученным данным можно сделать вывод о том, что для анализа БПК наиболее перспективным биоматериалом являются клетки бактерий E. coli с медиатором гексацианоферрат (III) калия, так как в условиях электрокаталитического окисления субстратов они способны окислять наибольшее количество субстратов (16 субстратов), в отличие от других медиаторов ферроцен (9 субстратов), 2,6-дихлорфенолиндофенол (14 субстратов), метиленовый синий (15 субстратов), нейтральный красный (9 субстратов), ферроценацетонитрил (4 субстрата).
Аналитические и метрологические характеристики разработанного медиаторного БПК-биосенсора на основе гексацианоферрат (III) калия. В ходе работы был создан безреагентный биосенсор для экспресс-анализа БПК на основе медиатора гексацианоферрата (III) калия и бактерий E. coli. С помощью модельного раствора глюкозо-глутаматной смеси (ГГС) была получена градуировочная зависимость отклика биосенсора от БПК5, имеющая гиперболический характер и аппроксимированная по уравнению Михаэлиса-Ментен. Для повешения чувствительности был выделен линейный участок градуировочной кривой, представленный на рис. 2.
Нижнюю границу линейного участка рассчитывали статистически, исходя из критерия относительного стандартного отклонения результатов измерения. Помимо калибровочных кривых при разработке биосенсоров необходимо учитывать такую характеристику, как долговременная стабильность, которая характеризует период времени (сут), в течение которого рекомендуется проводить исследования с одним рецепторным элементом и определяется временем функционирования после формирования рабочего электрода, при котором значение аналитического сигнала составляет не менее 50% от первоначального. В табл. 1 представлены основные характеристики медиаторного биосенсора на основе бактерий Е. coli.
0.52 -0.48 -
<
н
пГ 0.44 -
Гц
С
0
В
■D
1 0.40 -
i5
С
0.36 -0.32 -
012345678 БПК^ (ГГС - модельный р-р); мгСИ-'Дм
Рис. 2. Линейная зависимость ответа биосенсора на основе бактерий E. coli и медиатора гексацианоферрат (III) калия от БПК5 (мг О/дм )
в измерительной кювете
На основании анализа метрологических и аналитических характеристик, приведенных в табл. 1, можно сделать вывод о том, что разработанный безреагентный медиаторный биосенсор основе клеток бактерий E. coli и медиатора гексацианоферрата (III) калия позволил получить стабильный аналитический сигнал, так как относительное
I
стандартное отклонение не превышало 5%. Гексацианоферрат (III) калия, как более биосовместимый медиатор, позволил формировать рабочий электрод с высокой долговременной стабильностью. Важно также отметить, что разработанный биосенсор по своим характеристикам не уступает аналогу [6].
Таблица 1
Характеристики разработанного безреагентного медиаторного
биосенсора на основе E. coli и медиатора гексацианоферрата (III) калия
Показатель E. соН / Гексацианофер рат (III) калия P. yeei / Гексацианоферрат (III) калия [5]
Операционная стабильность, % 2 3,1
Долговременная стабильность, сутки 21 17
Длительность единичного измерения, мин 4-5 8-15
Диапазон определяемых значений БПК5, мг О2/дм3 0,7 - 11 2,1-18
Анализ образцов воды с использованием разработанного биосенсора. На основе разработанного биосенсора с использованием медиатора гексацианоферрата (III) калия была проведена апробация на 7 образцах речной воды. Были отобраны пробы воды из прудов ЦПКиО им. Белоусова г.Тула и образец речной воды из р. Упы. Определение БПК5 отобранных проб проводили стандартным методом разбавления согласно действующим нормативным документам [6]. На рис. 3 показана корреляция между значениями БПК5 образцов воды, определенными с помощью медиаторного биосенсора, и значениями БПК5, определенными стандартным методом разбавления.
Статистическая обработка полученных данных показала, что результаты анализа, полученные стандартным методом разбавления, и биосенсорным методом незначимо различались между собой. Таким образом, разработанный медиаторный биосенсор на основе бактерий E. coli и медиатора гексацианоферрат (III) калия можно эффективно использовать для анализа различных образцов воды.
is
о -I-1-1-1-1-1-1-1-
О 2 4 е а 10 12 14 16
БПХ.мгО-./дн3
?
Рис. 3. Корреляция между значениями БПК5 (мг О/дм ), определенными с помощью разработанного медиаторного биосенсора на основе гексацианоферрата (III) калия и дрожжей E. соИ, и БПК5, определенными стандартным методом
Работа выполнена при поддержке гранта Правительства Тульской области, договор № ДС/122.
Список литературы
1. Guyard C. BOD 5: a rising parameter // L'Eau, l'industrie, les nuisances. 2010. V. 334. P. 51-58.
2. Methods for assessing biochemical oxygen demand (BOD): A review / S. Jouanneau, L. Recoules, M.J. Durand [at al.] // Water research. 2014. V. 49. P. 62-82.
3. Основы функционирования биосенсоров: учебное пособие для студентов / О. Н. Понаморева [и др.]. Тула: Изд-во Тульского государственного университета. 2011. 206с.
4. Use of one-and two-mediator systems for developing a BOD biosensor based on the yeast Debaryomyces hansenii / A.S. Zaitseva, V.A. Arlyapov, N.Yu.Y udina [at al.] // Enzyme and Microbial Technology. 2016. V. 98. P. 43-51.
5. Мeдиаторный БПК-биосенсор на основе клеток микроорганизмов, выделенных из активного ила / А.С. Харькова, В.А. Арляпов, А.Д. Туровская [и др.] // Прикладная биохимия и микробиология. 2019. Т. 55. № 1. С. 1-10
6. Количественный химический анализ вод. Методика выполнения измерений биохимической потребности в кислороде после n-дней инкубации (БПК полн.) в поверхностных пресных, подземных
(грунтовых), питьевых, сточных и очищенных сточных водах. М.: 2004. 25с.
Харькова Анна Сергеевна, ассистент, [email protected], Россия, Тула, Тульский государственный университет,
Илюхина Анастасия Сергеевна, студент, ilyuhina.nastyaamail.ru, Россия, Тула, Тульский государственный университет,
Афонина Анна Андреевна, студент, annaaliumievaamaiLru, Россия, Тула, Тульский государственный университет,
Арляпов Вячеслав Алексеевич, канд. хим. наук, доцент, v. a. arlyapov@gmail. com, Россия, Тула, Тульский государственный университет
DEVELOPMENT OF RECEPTOR SYSTEM "MICROORGANISME. COLI -MEDIATOR." FOR BIOCHEMICAL OXYGEN DEMAND DETERMINATION
A.S. Kharkova, A.S. Ilyuhina, A. A. Afonina, V.A. Arlyapov
The mediators ferrocene, 1,1'-dimethylferrocene, ferrocenecarboxylic, ferienzentrum, neutral red, 2,6-dichlorphenolindophenol, thionin, methylene blue and potassium ferricyanide in combination with immobilized bacteria Escherichia coli were used in the composition of the receptor of the biosensor. It was found that only potassium hexacyanofer-rate (III) was an effective electron Transporter for the formation of bioelectrodes. The use of potassium hexacyanoferrate (III) allowed to form a biosensor characterized by high long-term stability (21 days), wide substrate specificity, the lower limit of the determined concentrations of 0.4 mgO2/dm3. The measurement time of one sample ranged from 4 to 5 min when measuring BOD (biochemical oxygen consumption) in the range of 0.7 to 11 mgO2/dm3. When measuring water samples, a high degree of correlation with the results of the standard method (R = 0.9900) was obtained.
Key words: mediator biosensor, index, BOD5, bacteria Escherichia coli.
Kharkova Anna Sergeevna, assistant, Anyuta Zaytseva a mail.ru, Russia, Tula, Tula State University,
Ilyuhina Anastasia Sergeevna, student, ilyuhina.nastyaamail.ru, Russia, Tula, Tula State University,
Afonina Anna andreeva, student, annaaliiimieva amail.ru, Russia, Tula, Tula State University,
Arlyapov Vyacheslav Alekseevich, candidate of chemical sciences, associate professor, v.a.arlyapov a gmail. com, Russia, Tula, Tula State University
