CC BY
72
УДК 543.55:579.222.2
РАЗРАБОТКА БИОСЕНСОРА НА ОСНОВЕ БАКТЕРИЙ PARACOCCUS YEEI, ИММОБИЛИЗОВАННЫХ В ЭЛЕКТРОПРОВОДЯЩИЙ ГЕЛЬ БСА С НЕЙТРАЛЬНЫМ КРАСНЫМ
С.К. Курбаналиева, А.С. Харькова, В. А. Арляпов
Исследовали возможность использования проводящего геля на основе бычьего сывороточного альбумина и медиатора нейтрального красного для иммобилизации клеток бактерий Paracoccus yeei ВКМ B-3302. В результате оценки электрохимических свойств матрицы установлено, что лимитирующей стадией процесса переноса электронов является поверхностная реакция, что позволило рассчитать гетерогенную константу скорости переноса электронов на электрод, которая составила 0,0119±0,0006 см/с. Разработанный на основе иммобилизованных бактерий биосенсор обладает линейным диапазоном определяемых значений БПК5 497-4048 мгО2/дм3 и может рассматриваться как перспективная система для экспресс-определения качества загрязненной воды.
Ключевые слова: электропроводящие гели, бычий сывороточный альбумин, нейтральный красный, бактерии Paracoccus yeei, медиаторный биосенсор.
Введение
В настоящее время биосенсоры широко используются во многих областях, в частности в клинической диагностике и экологическом мониторинге. При их разработке предпочтение отдается приборам второго (медиаторный перенос электронов) и третьего (прямой перенос электронов) поколений. Медиатор - это низкомолекулярная окислительно-восстановительная пара, переносящая электроны от активного центра фермента к поверхности индикаторного электрода [1]. Использование медиаторов обеспечивает высокую чувствительность метода, короткое время анализа и возможность миниатюризации биосенсорных систем. Недостатком данного подхода является необходимость физического передвижения заряженной частицы медиатора между электродом и биологическим материалом. Учитывая, что заряженная форма медиатора, как правило, имеет повышенную растворимость в водной среде, данное движение приводит к десорбции медиатора с поверхности электрода, и, как следствие, к снижению и нестабильности аналитического сигнала биосенсора. Ограничение подвижности медиатора традиционными способами (электрополимеризация медиатора на поверхности электрода, или введение в структуру медиатора гидрофобных заместителей) [2] решает эту проблему, однако параллельно снижается доступность медиатора для активных центров фермента, так как медиатор электронного транспорта сконцентрирован у поверхности электрода. Другим подходом к
данной задаче является использование в качестве медиатора электронного транспорта соединений достаточно большой молекулярной массы, чтобы их молекулы одновременно контактировали с поверхностью электрода и биологическим материалом и, таким образом, отпадала необходимость челночного передвижения медиатора в системе. Такие соединения можно получить путем модификации биологических полимеров электроактивными молекулами [3].
Формируя таким образом рецепторные элементы, разрабатываются биосенсоры, в частности, для экспресс-определения биохимического потребления кислорода (БПК) [4]. Биосенсорные анализаторы БПК представляют собой надежные, простые и дешевые аналитические инструменты, которые с успехом используются для контроля водных экосистем за рубежом. В связи с этим целью данной работы является исследование возможности использования рецепторных элементов на основе электропроводящего геля бычьего сывороточного альбумина (БСА) с использованием нейтрального красного (НК) и клеток бактерий Paracoccus yeei ВКМ B-3302 для создания биосенсора. В качестве медиатора использовался нейтральный красный, что обусловлено его нетоксичностью по отношению к микроорганизмам, а также наличием функциональных групп (аминогрупп), необходимых для образования электропроводящего геля [5]. В качестве матрицы для электропроводящих гидрогелей использовали бычий сывороточный альбумин. Этот полимер обладает высокой биосовместимостью, биоразлагаем и нетоксичен [6]. Данные свойства необходимы при использовании разработанных электропроводящих матриц для иммобилизации микроорганизмов при создании биосенсоров и биотопливных элементов. В качестве микроорганизмов были взяты клетки бактерий Paracoccus yeei BKM B-3302, так как данные микроорганизмы выделены из активного ила и при использовании в составе биосенсора показали высокую чувствительность определения БПК5.[7]
Материалы и методы
Культивирование клеток бактерий Paracoccus yeei.
Бактериальный штамм Paracoccus yeei BKM B-3302 (микроорганизмы активного ила) (далее P. yeei) были выделены из активного ила с очистных сооружений ТулаГорВодоканал. Клетки выращивали на богатой минеральной среде (жидкая питательная среда LB (Lysogeny broth)). Применяли следующий состав жидкой среды: триптон - 10 г/дм3, хлорид натрия - 10 г/дм3, дрожжевой экстракт - 5 г/дм3. Среду для выращивания клеток стерилизовали автоклавированием при давлении в 1,1 атмосфер в течение 45 минут. Клетки выращивали аэробно 18-20 часов в качалочных колбах объемом 750 см3 при температуре 29 оС. Затем полученную
биомассу центрифугировали при комнатной температуре 10 минут (10000 об/мин). Далее центрифугат промывали 20 мМ фосфатным буфером, рН 6,8. Осевшие клетки переносили в свежие порции буфера, распределяли по порциям и осаждали на центрифуге «Eppendorf» 5 минут при 10000 об/мин. Промытую биомассу взвешивали и хранили в микропробирках при температуре 5°С.
Электрохимические измерения окислительной активности биологического материала. Электрохимические измерения проводили при помощи гальванопотенциостата «IPC-micro» (ООО НТФ Вольта, Санкт-Петербург), интегрированного с ПК. Диапазон регистрируемых токов 5 нА - 20 мкА. Ошибка измерения потенциала не больше 0,1 мВ для интервала ±5 мВ. Рабочий потенциал составлял -380mV. Температура измерения составляла 20 oC, объем ячейки был равен 5 см3. Измерения велись при непрерывном перемешивании раствора, находящегося в электролитической ячейке, при помощи магнитной мешалки (300 об/мин). После установления стабильного уровня тока в ячейку микропипеткой вводили необходимое для получения заданной концентрации количество раствора глюкозо-глутаматной смеси. После каждого измерения производили промывку ячейки калий-натрий-фосфатным буферным раствором. Измеряемым параметром сигнала сенсора явилась амплитуда изменения силы тока (мкА), определяемая как разность между конечным и начальным значениями токов до и после введения субстрата в измерительную кювету.
Электрохимические измерения вольтамперных зависимостей. Циклические вольтамперограммы регистрировали при
вольтамперометрического анализатора «Экотест-ВА» (ООО «Эконикс-Эксперт», Россия) по трехэлектродной схеме. Все измерения проводились при температуре 22 оС. Объем ячейки 30 мл.
Ик-спектроскопия. ИК-спектры исходных веществ (БСА) и продуктов реакции регистрировали с помощью инфракрасного Фурье-спектрометра ФМС 1201 (ООО «Мониторинг», Россия). Для измерения спектров твердых веществ использовали диски с KBr: навеску твердого вещества (1-3 мг) тщательно смешивали в ступке со спектроскопически чистым бромидом калия (150-200 мг) и смесь прессовали при давлении 7,5-10 т/см2 в течение 2-5 мин под вакуумом 2-3 мм рт. ст. Спектр полученного образца снимали относительно воздуха.
Результаты и их обсуждения
Получение электропроводящего геля на основе бычьего сывороточного альбумина проводили по реакции присоединения аминов к альдегидным группам с образованием иминов - оснований Шиффа в соответствии со схемой 1:
Было проведено изучение ИК-спектров, как чистого медиатора нейтрального красного, и полимера БСА, так и полученного электропроводящего гидрогеля. Полученные спектры представлены на рис. 1.
ЕСЛ
Волновое число, 1/см
Рис. 1. ИК-спектр ковалентно связанного БСА-НК и чистых
НК и БСА
На рис. 1 в матрице БСА-НК прослеживается полоса поглощения, соответствующая валентным колебаниям СНз-групп (пик при 2912 см-1), увеличение которой косвенно подтверждает сшивку медиатора с матрицей. Однако подтвердить сшивку нейтрального красного с матрицей по появлению новых ароматических пиков достаточно сложно, так как в структуре БСА содержится большое количество ароматических аминокислот [8].
Для определения электрохимических свойств матрицы были исследованы циклические вольтамперные зависимости. Типичный вид изучаемых циклических зависимостей представлен на рис. 2
Рис. 2. Циклическая вольтамперная зависимость для электропроводящей системы БСА-НК при скоростях
развертки 40-150 мВ/с На полученной циклической вольтамперограмме на рис. 2 наблюдается два анодных пика, один из которых связан с окислением феназиновой группой медиатора, а второй пик относится к процессу окисления аминно-группы до нитрогруппы. Наиболее простым критерием обратимости/необратимости изучаемой системы является расположение катодного и анодного пиков, которая в случае обратимых систем должна удовлетворять уравнению:
Е - Е,,
0,059
n
(2)
где Еа - потенциал на аноде; Ек - потенциал на катоде; n - число электронов.
На циклической вольтамперограмме при увеличении скорости развертки происходит смещение катодного и анодного пиков, следовательно перенос электронов является необратимым. Для оценки лимитирующей стадии используется Критерий Семерано в соответствии с уравнением:
lg ia = х lg v + const, (3)
где ia - анодный ток (А); х - критерий Семерано; v - скорость развертки (В/с).
Если х=1, то лимирующей стадией является поверхностная реакция, а если х=0,5, то реализуется прыжковый механизм. Полученную вольтамперограмму (рис. 2) использовали для построения зависимости lgi от lgv (рис. 3), в соответствие с уравнением (3).
Рис. 3. График зависимости от для электропроводящей
мембраны БСА-НК
Для матрицы БСА-НК критерий Семерано составил 0,8±0,3 для анодного процесса и 0,8±0,3 для катодного процесса. Следовательно, лимитирующей стадией процесса переноса электронов является поверхностная реакция переноса электронов на электрод. Расчет гетерогенной константы скорости переноса можно произвести с помощью уравнения Лавирона [9]. Полученная константа составила 0,0119±0,0006 (см/с).
Полученный проводящий гель использовали для иммобилизации бактерий Р. уее1 с целью создания безреагентного биосенсора для экспресс-определения биохимического потребления кислорода. Биосенсор калибровали с помощью раствора глюкозо-глутаматной смеси, используемой в стандартном методе БПК5. Полученная градуировочная зависимость ответа сенсора от концентрации медиатора представлена на рис. 4.
Ы11С мг/дм3
Рис. 4. Градуировочная зависимость ответа сенсора от концентрации БПК для матрицы БСА-НК и бактерий Р. уввЬ
Представленная на рис. 4 зависимость ответа сенсора от концентрации ГГС имеет гиперболический вид и была апроксимирована по уравнению Михаэлиса-Ментен:
r = r max [ s ] , (4),
km + [ S ]
где Rmax - максимальная скорость ферментативной реакции, достигаемая при [S]—►го, Км - эффективная константа Михаэлиса, т.е. концентрация субстрата, при которой R—Rmax/2.
Для более точного анализа оставляют линейный участок градуировочной зависимости, который ограничивается полученной ранее константой Михаэлиса. Нижнюю границу линейного участка рассчитывали статистическим методом, основываясь на значении относительного стандартного отклонения результатов измерения Sr(C)) < <0,33. Полученный диапазон определяемых концентраций БПК5, а также диапазоны определяемых концентраций других систем представлены в таблице.
При сравнении разработанного медиаторного БПК-биосенсора с известными аналогами самым чувствительным оказался биосенсор на основе клеток дрожжей Pseudomonas aeruginosa и медиатора гексацианоферрата (III) калия [13]. Разработанный в данной работе медиаторный БПК-биосенсор на основе элктропроводящих гелей по чувствительности уступает известным аналогам.
Однако о целесообразности использования электропроводящего геля БСА-НК можно судить по таким критериям, как субстратная специфичность и долговременная стабильность. Долговременная стабильность характеризует длительность работы сенсора. Матрица бычьего сывороточного альбумина с нейтральным красным оказалась достаточно стабильной. Данная матрица с клетками P. yeei продолжала давать ответ в течение 22 дней.
Анализ субстратной специфичности бактерий P. yeei позволяет сделать вывод о том, что характер окисления субстратов меняется в зависимости от используемой матрицы. На графике зависимости ответа сенсора от используемого субстрата на рис. 5 можно отметить, что максимальные ответы медиаторного биосенсора достигались при введении спиртов.
Характеристики разработанного медиаторного _биосенсора и аналогов_
Биоматериал/ иммобилизац ия1 Медиатор Электрод2 Диапазон определяемых концентраций БПК, мгО2/дм3 Ссылка
Pseudomonas aeruginosa/ пП Гексацианофе ррат (III) калия З 5-100 [11]
Chromobacter ium violaceum/ А Гексацианофе ррат (III) калия П 20-225 [10]
E.coli / ПВС-4-ВП Нейтральный красный СУ 50-1000 [12]
P. yeei БСА - НК УП 497-4048 Данная работа
1 иммобилизация: пП - включение клеток в полипиррольную матрицу А - адсорбция ПВС-4-ВП - включение в сополимер поливинилового спирта и 4-винилпиридином С - суспензия
электрод: З - золотой электрод УП -углеродопастовый электрод
П - платиновый электрод СУ - стеклоуглеродный электрод
2,50
2,00
а 1,50 о
е о,5о
о А
та та к та es f м г:
О
У 3
с
г-Ь:
М-1 7Г 2 Ö
и и
и и
еч ^
И О
О о
« S
L- Ю
а &
3 Q
в и
о g
й и й sog
К Щ Ё
ю ©
и
11
В ¡5 а s 8 g
Ё?
Ш та
к я
и н
К й
ь ■&
га [=1
5
rt
Рис. 5. Субстратная специфичность клеток бактерий Р. увв1 и
матрицы БСА-НК
Широкий спектр окисляемых субстратов разработанного биосенсора позволяет предположить, что полученные с его
использованием результаты анализа воды будут коррелировать с результатами стандартного метода.
Заключение
Был сформирован биосенсор на основе электропроводящего гидрогеля БСА с использованием клеток бактерий P. yeei и нейтрального красного в качестве медиатора. Лимитирующей стадией переноса электронов явилась поверхностная реакция. Вследствие чего была посчитана гетерогенная константа скорости электрохимической реакции, которая составила 0,0119±0,0006 (см/с).
Были определены основные характеристики созданного биосенсора. Диапазон определяемых концентраций БПК5 составил 497-4048 мг 02/дм3, что ниже чем у литературных значений аналогов. Однако такие характеристики, как субстратная специфичность и долговременная стабильность говорят о возможности эффективного применения разработанного проводящего гидрогеля в составе БПК-биосенсора.
Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект №17-74-10078).
Список литературы
1. Понаморева О.Н., Решетилов А.Н., Алферов В.А. Биосенсоры. Принципы функционирования и практическое примененение. Тула: Изд-во ТулГУ, 2007. 255 с.
2. Efficiency of bioelectrocatalytic oxidation of ethanol by whole cells and membrane fractions of Gluconobacter oxydans bacteria in the presence of mediators of ferrocene series / O.N. Ponamoreva, E.Yu. Indzhgiya, V.A. Alferov [et al.] // Russian Journal Electrochemistry. 2010. V. 46. № 12. P. 1408-1413.
3. Chitosan-ferrocene film as a platform for flow injection analysis applications of glucose oxidase and Gluconobacter oxydans biosensors / O. Yilmaz, D. O. Demirkol, S. Gulcemal [et al.] // Colloids Surfaces B Biointerfaces. 2012. V. 100. P. 62-68.
4. Nakamura H. A new BOD estimation method employing a doublemediator system by ferricyanide and menadione using the eukaryote Saccharomyces cerevisiae // Talanta. 2007. V. 72. №. 1. P. 210-216.
5. Jouanneau S. Methods for assessing biochemical oxygen demand (BOD): A review // Water research. 2014. V. 49. P. 62-82.
6. Chen C., Gao Y. Electrosyntheses of poly (neutral red), a polyaniline derivative // Electrochimica acta. 2007. V. 52. №. 9. P. 3143-3148.
7. Задымова Н. М., Ямполъская Г. П., Филатова Л. Ю. Взаимодействие бычьего сывороточного альбумина с неионогенным ПАВ
Твин-80 в водных растворах: комплексообразование и ассоциация // Коллоидный журнал. 2006. Т. 68. №. 2. C. 187-197.
8. Зайцева А. С., Арляпов В. А., Решетилов А. Н. Медиаторный биосенсор на основе микроорганизмов активного ила для экспресс-определения низких значений БПК5 // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии им. Ю.А. Овчинникова. 2017. Т. 13. №. 1. C. 50-57.
9. Инфракрасная спектроскопия органических и природных соединений: учебное пособие. / А. В. Васильев [и др.] СПб.: СПбГЛТА, 2007. 54 с.
10. Будников Г.К. Майстренко В.Н., Вяселев М.Р. Основы современного электрохимического анализа. М.: Мир, 2003. 592с.
11. Khor B. H. A redox mediated UME biosensor using immobilized Chromobacterium violaceum strain R1 for rapid biochemical oxygen demand measurement //Electrochimica Acta. 2015. V. 176. P. 777-783.
12. Hu J., Gao G., Xia S. Development of a mediator-mype bioelectrochemical sensor based on polypyrrole immobilized ferricyanide and microorganisms for biochemical oxygen demand fast detection // Int J Electrochem Sci. 2015. V. 10. P. 9695-9705.
13. Liu L. A co-immobilized mediator and microorganism mediated method combined pretreatment by TiO2 nanotubes used for BOD measurement // Talanta. 2012. V. 93. P. 314-319.
14. Laviron E. General expression of the linear potential sweep voltammogram in the case of diffusionless electrochemical systems // Journal of Electroanalytical Chemistry and Interfacial Electrochemistry. 1979. V. 101. №. 1. P. 19-28.
15. Si J., Li X.C., Cui B.K. Decolorization of heterocycle dye Neutral Red by white-rot fungus Perenniporia subacida // Desalination and Water Treatment. 2014. V. 52. № 28-30. P. 5594-5604.
16. Степанова В. Б. Электрохимические ДНК-сенсоры на основе полиэлектролитных комплексов и наноразмерных медиаторов электронного переноса: автореф. дис. ... канд. хим. наук. Казань, 2013. 23с.
Курбаналиева Саният Курбановна, студент, saniyatkyrbanalieva@yandex.ru, Россия, Тула, Тульский государственный университет,
Харькова Анна Сергеевна, аспирант, Anyuta_Zaytseva@mail.ru, Россия, Тула, Тульский государственный университет,
Арляпов Вячеслав Алексеевич, канд. хим. наук, доцент, v.a.arlyapov@gmail.com, Россия, Тула, Тульский государственный университет
DEVELOPMENT OF A BIOSENSOR BASED ON BACTERIA PARACOCCUS YEEI IMMOBILIZED IN THE CONDUCTIVE GEL OF BSA WITH NEUTRAL RED
S. K. Kurbanalieva, S. A. Kharkova, V. A. Arlyapov
The possibility of using a conductive gel based on bovine serum albumin and a neutral red mediator to immobilize the cells of bacteria Paracoccus yeei ВКМ B-3302 was investigated. As a result of the evaluation of the electrochemical properties of the matrix, it was found that the limiting stage of the electron transfer process is the surface reaction, which made it possible to calculate the heterogeneous constant of the electron transfer rate to the electrode, which was 0.0119 ± 0.0006 cm/s. Developed on the basis of immobilized bacteria biosensor has a linear range of defined values of BOD5 497-4048 mgO2/ dm3 and can be considered as a promising system for rapid determination of the quality of contaminated water.
Key words: conductive gels, bovine serum albumin, neutral red, bacteria Paracoccus yeei, mediator biosensor
Kurbanalieva Saniyat Kurbanovna, student, saniyatkyrbanalieva@yandex.ru, Russia, Tula, Tula state University,
Kharkova Anna Sergeevna, post-graduate student, Anyuta_Zaytseva@mail. ru, Russia, Tula, Tula state University,
Arlyapov Vyacheslav Alekseevich, candidate of chemical sciences, associate professor, v.a.arlyapov@gmail.com, Russia, Tula, Tula State University
