Научная статья на тему 'Разработка модифицированных печатных электродов на основе глюкозоксидазы для анализа глюкозы'

Разработка модифицированных печатных электродов на основе глюкозоксидазы для анализа глюкозы Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

CC BY
705
233
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
БИОСЕНСОРЫ / ПЕЧАТНЫЕ ЭЛЕКТРОДЫ / ГЛЮКОЗОКСИДАЗА / БЫЧИЙ СЫВОРОТОЧНЫЙ АЛЬБУМИН / СОК

Аннотация научной статьи по промышленным биотехнологиям, автор научной работы — Каманин Станислав Сергеевич, Арляпов Вячеслав Алексеевич

Разработаны одноразовые медиаторные электроды, модифицированные глюкозоксидазой, иммобилизованной в гель поперечно-сшитого бычьего сывороточного альбумина для анализа содержания глюкозы. Диапазон определяемых концентраций полученных модифицированных электродов составил 0,03-1,0 мМ, чувствительность 90 мкАл/моль. Определены лимитирующие стадии процессов, протекающих на разработанных электродах. С использованием разработанных модифицированных электродов было проведено определение содержания глюкозы в образцах соковой продукции. Показано, что результаты анализа с применением разработанных электродов совпадают с результатами, полученными референтным методом (высокоэффективная жидкостная хроматография).

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по промышленным биотехнологиям , автор научной работы — Каманин Станислав Сергеевич, Арляпов Вячеслав Алексеевич

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Текст научной работы на тему «Разработка модифицированных печатных электродов на основе глюкозоксидазы для анализа глюкозы»

Известия Тульского государственного университета Естественные науки. 2012. Вып. 2. С. 226-236

Химия

УДК 543.07:579.22:543.9

Разработка модифицированных печатных электродов на основе глюкозоксидазы

для анализа глюкозы *

С. С. Каманин, В. А. Арляпов

Аннотация. Разработаны одноразовые медиаторные электроды, модифицированные глюкозоксидазой, иммобилизованной в гель поперечно-сшитого бычьего сывороточного альбумина для анализа содержания глюкозы. Диапазон определяемых концентраций полученных модифицированных электродов составил 0,03-1,0 мМ, чувствительность — 90 мкАл/моль. Определены лимитирующие стадии процессов, протекающих на разработанных электродах.

С использованием разработанных модифицированных электродов было проведено определение содержания глюкозы в образцах соковой продукции. Показано, что результаты анализа с применением разработанных электродов совпадают с результатами, полученными референтным методом (высокоэффективная жидкостная хроматография).

Ключевые слова: биосенсоры, печатные электроды, глюкозоксидаза, бычий сывороточный альбумин, сок.

Введение

Одной из главных задач, стоящих сегодня перед аналитической химией, является разработка методов, делающих возможным проведение оперативного анализа in situ. Такие методы должны обладать высокой чувствительностью и точностью, и определять соединения с различными свойствами в реальных образцах. Многие из подобных методов, разработанных в последние годы, основываются на электрохимических принципах вследствие их высокой чувствительности и селективности, портативности и низкой стоимости приборов. Примером системы, отвечающей текущим тенденциям аналитической химии, являются биосенсоры. С момента своего появления в начале 60-х годов, биосенсоры

* Работа выполнена при финансовой поддержке ФЦП «Научные и научнопедагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы», госконтракт № 16.740.11.0766 и гранта РФФИ 12-08-90805-мол_рф_нр.

дали начало широкому спектру аналитических устройств, различающихся по типу биологической составляющей, принципу взаимодействия биоматериала с преобразователем сигнала, способу регистрации сигнала. Одна из недавних революций в биосенсорике состоялась в 90-х годах благодаря приходу в эту область технологии трафаретной печати электродов, ранее применявшейся в микроэлектронной промышленности [1]. Это привело к появлению компактных, дешевых, высокочувствительных электродов. Благодаря своей многофункциональности и миниатюрности данные электроды являются почти идеальной основой для биосенсоров, которые могут использоваться в пищевой промышленности, при выполнении клинических анализов, для решения задач судебно-медицинской экспертизы, и т. д. Одной из областей, в которых широко используются биосенсоры на основе печатных электродов, является определение содержания глюкозы в крови [2].

Глюкометры относятся к биосенсорам второго поколения, т. е., в них для переноса электронов с фермента на электрод используется посредник — медиатор электронного транспорта. Обычно для этой цели используются гексацианоферраты, как эффективные и недорогие медиаторы [3]. С точки зрения применимости в биосенсорном анализе интересна берлинская лазурь (КЕе[Ре(СК)б]). Помимо обладания классическими для медиаторов свойств (низкий редокс-потенциал, не зависящий от pH среды, химическая устойчивость в растворе), она является неорганическим катализатором разложения пероксида водорода при потенциале 0 В [4]. Таким образом, берлинская лазурь может использоваться как медиатор в оксидазных биосенсорах, что подтверждается большим количеством публикаций, посвященных разработке биосенсоров на основе печатных электродов, модифицированных берлинской лазурью. Так, разработаны печатные электроды, модифицированные глюкозоксидазой, включенной в состав графитовой пасты [5], иммобилизованной в полиэтиленимин [6], в мембрану Кайоп для кюветного [7] и проточно-инжекционного [8] режимов анализа. Включение биоматериала в полимерные гели является одним из наиболее эффективных способов иммобилизации. Он обеспечивает мягкие условия иммобилизации с применением нетоксичных реагентов и хорошие диффузионные свойства получаемой матрицы. Примером такой иммобилизации является включение в гель поперечно-сшитого бычьего сывороточного альбумина (БСА) [9]. Получаемая после сшивания молекул БСА глутаровым альдегидом матрица обеспечивает хорошую диффузию субстратов и метаболитов и формирует благоприятное для иммобилизованных объектов белковое окружение.

Таким образом, актуальной представляется разработка модифицированных печатных электродов с ферментом глюкозоксидазой иммобилизованной в гель поперечно-сшитого БСА для определения низких концентраций глюкозы.

Материалы и методы

Определение активности глюкозоксидазы. Определение активности глюкозоксидазы спектрофотометрическим методом проводили на спектрофотометре СФ-103 (ЗАО Аквилон, Россия).

На основе 1М раствора глюкозы готовили 15 растворов с концентрацией глюкозы от 6,7 мМ до 1 М. В измерительную кювету помещали 1700 мкл смеси 0,2 мл 0,5% раствора о-дианизидина в метаноле и 24 мл калий-фосфатного буфера (100 мМ, рН 6,0), 1500 мкл раствора глюкозы, 10 мкл раствора пероксидазы хрена (300 Е/мл). В кювету сравнения помещали 1700 мкл смеси 0,2 мл 0,5% раствора о-дианизидина в метаноле и 24 мл калий-фосфатного буфера (100 мМ, рН 6,0), 1500 мкл деионизированной воды и 10 мкл раствора пероксидазы хрена (300 Е/мл). Содержимое кювет перемешивали и после того, как оптическая плотность раствора стала постоянной, в измерительную кювету добавляли 10 мкл раствора глюкозооксидазы (0,1 мг/мл), а в кювету сравнения — 10 мкл деионизированной воды. Содержимое кювет перемешали и измеряли оптическую плотность раствора при длине волны 460 нм в течение 10 мин.

Биосенсорные измерения. Сигнал регистрировали, используя графитовый печатный электрод, на поверхности которого располагали рецепторный элемент. В качестве преобразователя использовали гальваностат-потенциостат IPC2000 (ЗАО «Кронас», Москва): рабочий потенциал 0 мВ; объем кюветы 4 мл; натрий-калиевый фосфатный буфер рН = 6,8 концентрация солей 33 мМ; перемешивание магнитной мешалкой 200 об/мин; ввод пробы осуществляли автоматическими микропипетками переменного объема (20-200 мкл, 200-1000 мкл) («ЛЕНПИПЕТ», Россия). Измеряемым параметром (ответом биосенсора) являлась амплитуда изменения выходного сигнала биосенсора при добавлении субстрата. После каждого измерения осуществляли промывание электрода буферным раствором в течение 3-4 минут.

Иммобилизация ферментов включением в гель поперечно-сшитого бычьего сывороточного альбумина (БСА). Для получения рецепторного элемента в химический стакан помещали 7 мг БСА (Sigma), 100 мкл фосфатного буфера (рН=6,8, 20 мМ) и перемешивали до полного растворения. К полученному раствору добавляли 5 мг фермента глюкозоксидазы (КФ 1.1.3.4), перемешивали и добавляли 15 мкл 25 %-ного глутарового альдегида (Sigma). Полученную смесь перемешивали ещё раз, отбирали 3 мкл и быстро переносили на графитовый электрод. Время полимеризации составляло от 30 до 60 минут. Полученный рецепторный элемент перед использованием промывали в буферном растворе в течение 5 мин.

Определение глюкозы в реальных образцах референтным методом. Определение концентрации глюкозы в образцах проводили

методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на хроматографе марки «Стайер» (Аквилон, Россия) с использованием детектора рефрактометрического типа по стандартной методике [10].

Результаты и обсуждение

использовали

Определение активности фермента. В работе глюкозоксидазу, выделенную из дрожжей Aspergillus niger.

Метод определения активности глюкозоксидазы основан на реакции окисления о-дианизидина пероксидом водорода, образующимся при окислении глюкозы под действием глюкозоксидазы (1).

Пероксид водорода разлагается пероксидазой, а выделившийся атомарный кислород окисляет добавленный к реакционной смеси хромоген (2). Окисленную форму о-данизидина регистрируют спектрофотометрически при длине волны 460 нм.

Основываясь на полученных данных строили график зависимости скорости изменения оптической плотности раствора от концентрации глюкозы. Полученную зависимость обрабатывали по уравнению Михаэлиса-Ментен. Удельную активность фермента рассчитывали по формуле:

Д V ДО ■ $ ДБ ■ $ tg а ■ $

А =

Ат • mф At • mф є • l • At • mф є • l • mф

(З)

где tg а — тангенс угла наклона начального линейного участка зависимости оптической плотности от времени при насыщении фермента субстратом, с-1; О — оптическая плотность; її — объем раствора в кювете, л; є — молярный коэффициент экстинкции о-дианизидина (30 л-мМ_1-см-1); С —

концентрация, мМ-л ; I — толщина кюветы, см; Шф — масса фермента, мг;

V — количества вещества, мМ; т — время, с.

Удельная активность глюкозоксидазы составила 248 Е/мг белка, что согласуется с литературными данными [11].

Определение основных характеристик модифицированных электродов. На втором этапе работы была проведена оценка долговременной и операционной стабильности электродов, модифицированных ферментом глюкозоксидазой (ГО), иммобилизованной в гель поперечно-сшитого бычьего сывороточного альбумина (БСА). Долговременную стабильность определяли путём ежедневного измерения величины ответа сенсора на один и тот же объем 0,1 М раствора глюкозы.

Долговременная стабильность сенсора на основе ГО, иммобилизованной в гель поперечно-сшитого БСА, составила 3 суток, причем наблюдалось постепенное падение уровня сигнала (рис.1).

Рис. 1. Долговременная стабильность сенсора на основе ГО, иммобилизованной в БСА

За операционную стабильность электродов принимали относительное стандартное отклонение серии последовательных ответов сенсора на одну и ту же концентрацию глюкозы в кювете (рис.2). Таким образом, операционная стабильность разработанных модифицированных электродов при проведении 15 последовательных измерений составила 3%.

Операционная стабильность полученных модифицированных электродов находится на уровне их аналогов [12].

Следующим этапом работы было определение основных характеристик разработанных модифицированных электродов. Для определения чувствительности и диапазона определяемых концентраций была построена градуировочная зависимость отклика биосенсора от концентрации глюкозы в измерительной кювете (рис.3).

Рис. 2. Операционная стабильность сенсора на основе ГО, иммобилизованной в БСА

Рис. 3. Градуировочная зависимость отклика сенсора с ГО, иммобилизованной в БСА

Градуировочная зависимость полученных модифицированных электродов хорошо описывается уравнением Хилла

К

Ет

кМ + №'

Коэффициент корреляции И составил 0,9966, коэффициент Хилла равен 2 ± 0,1.

Для определения чувствительности сенсора отдельно рассматривали линейный участок градуировочной зависимости (рис.4). За верхнюю границу

П

линейного участка принимали значение константы Михаэлиса, полученную из уравнения Хилла.

0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0,00

0,0002 0,0003 0,0004 0,0005 0,0006 0,0007 0,0008 Концентрация глюкозы в кювете, моль/л

Рис. 4. Линейный участок градуировочной зависимости

Чувствительность разработанных модифицированных электродов составила 90 мкА-М_1.

Нижнюю границу определяемых концентраций рассчитывали статистическим методом [13] исходя из критерия: относительное стандартное отклонение по концентрации меньше 0,33 (Бг(С)<0,33). Характеристики модифицированных электродов на основе ГО, иммобилизованной в БСА, приведены в табл.1.

Таблица 1

Характеристики полученных рецепторных элементов

Параметр Значение

Долговременная стабильность, сутки 3

Операционная стабильность, % 3

Чувствительность, мкА-М-1 90

Диапазон определяемых концентраций, мкМ 30-1000

Полученные модифицированные электроды характеризуются хорошей операционной стабильностью, высокой (для графитовых печатных электродов) чувствительностью по сравнению с аналогами [14, 15], диапазон определяемых концентраций лежит в микромолярной области. Из-за низкой долговременной стабильности полученные электроды могут использоваться как одноразовые.

Определение лимитирующих стадий процессов, происходящих на электродах. Каталитическое поведение микроорганизмов, как биорецепторного элемента микробного сенсора, можно представить в виде модели, в которой ферментные системы находятся за мембраной клетки.

В этом случае необходимо учитывать диффузию субстрата к активным центрам ферментов наряду с ферментативной реакцией [16].

В электродах регенерация фермента осуществляется при помощи кислорода, который одновременно является участником процесса окисления и веществом, концентрация которого измеряется с помощью электрода Кларка.

Математический анализ модели ферментного электрода, проведенный Элбери У. Дж. и Крестоном Д. Х., основанный на равенстве потоков веществ через каждую стадию процесса в стационарном состоянии и при условии, что ферментативная реакция протекает в рамках кинетики Михаэлиса-Ментен, приводит к уравнению зависимости потока генерируемых в электрокаталитическом процессе электронов от концентрации субстрата, аналогичному уравнению Хэйнеса (4).

где ] — поток, рассчитываемый по формуле

I — сила тока, протекающего через электрод; п — число электронов; ^ — постоянная Фарадея; А — площадь электрода; 5 - концентрация субстрата в кювете; к'МЕ — эффективная константа скорости электрохимической реакции на микробном электроде; к'3 — константа скорости массопереноса субстрата; Кме — константа, эквивалентная константе Михаэлиса для ферментного электрода.

Для определения лимитирующих стадий процессов используются параметры р и у, которые не имеют конкретного физического смысла, но позволяют представить экспериментальные данные в необходимом для анализа виде (рис.5).

Таким образом, в области низких концентраций от 0,25 до 0,74 ммоль/л лимитирующей стадией процесса является диффузия субстрата через мембрану к активным центрам ферментов (соответствует точкам на графике, аппроксимируемым прямой, пересекающую ось абсцисс в точке р = 1). В диапазоне концентраций глюкозы от 0,74 до 2,44 ммоль/л в протекающие на ферментном электроде процессы вносят соизмеримый вклад и диффузия субстрата, и ферментативные реакции (диапазон соответствует прямой на графике, проходящей под углом к оси абсцисс).

Анализ реальных образцов. Для проверки работы разработанных модифицированных электродов в реальных условиях, с их использованием было проведено определение содержания глюкозы в образцах соковой продукции. Для анализа были выбраны соки марки «Любимый сад»: апельсиновый сок и яблочный сок. В качестве референтного метода

2,0 1,6 1,2

р*~ 1

у— —----

л 5 0,8

0,4 0,0

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

V

Рис. 5. Зависимость у от р для фермента глюкозоксидазы, иммобилизованной в БСА

анализа применяли метод высокоэффективной жидкостной хроматографии. Полученные результаты приведены в табл. 2.

Таблица 2

Анализ реальных образцов

Образец Концентрация глюкозы, М

Биосенсорный метод Референтный метод

Апельсиновый сок 0,320±0,01 0,332±0,002

Яблочный сок 0,4020±0,008 0,408±0,002

Статистическими методами показано, что концентрации глюкозы, определенные с помощью разработанных электродов незначимо отличаются от результатов, полученных референтным методом анализа.

Выводы

Разработаны модифицированные печатные электроды на основе медиатора берлинской лазури и фермента ГО, иммобилизованной в гель поперечно-сшитого БСА. Определены основные аналитические и метрологические характеристики полученных модифицированных печатных электродов. Показано, что долговременная стабильность полученных модифицированных печатных электродов — 3 суток, диапазон определяемых концентраций составил 0,03-1,0 мМ, чувствительность равна 90 мкА-М_1. В ходе работы выявлено, что в диапазоне концентраций 0,25-0,74 мМ лимитирующей стадией процесса является диффузия субстрата через мембрану к активным центрам ферментов, а в диапазоне 0,74-2,44 мМ в протекающие в ферментном электроде процессы вносят соизмеримый вклад и диффузия субстрата, и ферментативные реакции.

С использованием разработанных электродов был проведен анализ

реальных образцов. Полученные значения являются близкими к значениям,

полученным референтным методом анализа.

Список литературы

1. Hilditch P.I., Green M.J. Disposable electrochemical biosensors // Analyst. 1991. V.116, № 12. P.1217-1220.

2. Newman J.D., Turner A.P.F. Home blood glucose biosensors: a commercial perspective // Biosensors and Bioelectronics. 2005. V.20, № 12. P.2435-2453.

3. Hill B. Accu-Chek® Advantage: Electrochemistry for Diabetes Management // Current Separations. 2005. V.21, № 2. P.45-48.

4. Karyakin A.A., Karyakina E.E. Prussian Blue-based «artificial peroxidase» as a transducer for hydrogen peroxide detection. Application to biosensors // Sensors and Actuators B: Chemical. 1999. V.57, № 1-3. P.268-273.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

5. Composite glucose biosensor based on screen-printed electrodes bulk modified with prussian blue and glucose oxidase / M. Pravda [et al.] // Analytical Letters. 2002. V.35, №.6. P.959-970.

6. Lupu A., Compagnone D, Palleschi G. Screen-printed enzyme electrodes for the detection of marker analytes during winemaking // Analytica Chimica Acta. 2004. V.513, № 1. P.67-72.

7. de Mattos I. L., Gorton L., Ruzgas T. Sensor and biosensor based on Prussian Blue modified gold and platinum screen printed electrodes // Biosensors and Bioelectronics. 2003. V.18, № 2-3. P.193-200.

8. Novel planar glucose biosensors for continuous monitoring use / F. Ricci [et al.] // Biosensors and Bioelectronics. 2005. V.20, № 10. P.1993-2000.

9. Immobilization of enzymes and cells. ed. by Guisan Jose M. 2nd ed. Totowa (N.J.): Humana press, 2006. V.XIV. 449 p.

10. Association of Official Analytical Chemists. Official methods of analysis, 15th edition / book auth. Kenneth Helrich. Arlington, Virginia: Association of Official Analytical Chemists, 1990. Chapter 982.14.

11. Pazur J.H. Glucose oxidase from Aspergillus niger // Methods in Enzymology edition / book auth. A. Wood Willis: Academic Press, 1966. V.9.

12. Liang R., Jiang J., Qiu J. An Amperometric Glucose Biosensor Based on Ti-tania Sol-gel/Prussian Blue Composite Film // Analytical Sciences. 2008. V.24. P.1425-1430.

13. Дёрффель К. Статистика в аналитической химии. М.: Мир, 1994. 268 с.

14. Optimal environment for glucose oxidase in perfluorosulfonated ionomer membranes: improvement of first-generation biosensors / A.A. Karyakin [et al.] // Analytical Chemistry. 2002. V.74, № 7. P.1597-1603.

15. Disposable amperometric glucose sensor electrode with enzyme-immobilized nitrocellulose strip / G. Cui [et al.] // Talanta. 2001. V.54, № 6. P.1105-1111.

16. Albery W.J., Bartlett P.N. Amperometric enzyme electrodes: Part I. Theory // J. of Electroanalytical Chemistry and Interfacial Electrochemistry. 1985. V.194, № 2. P.211-222.

Каманин Станислав Сергеевич (s.s.kamanin@gmail.com), аспирант, кафедра химии, Тульский государственный университет.

Арляпов Вячеслав Алексеевич (v.a.arlyapov@gmail.com), к.х.н., доцент, кафедра химии, Тульский государственный университет.

Development of modified screen-printed electrodes based on glucose oxidase for the analysis of glucose

S. S. Kamanin, V. A. Arlyapov

Abstract. Disposable mediated screen-printed electrodes modified with glucose oxidase immobilized in a bovine serum albumin cross-linked gel were developed for glucose analysis. The range determinable concentrations for obtained modified electrodes was 0,03-1,0 mM; sensitivity of developed electrodes was 90 mA-M_1. Limiting stages of processes taking place on the surface of developed electrodes were defined. Determination of glucose in samples of juice products was carried out using the developed electrodes. It is shown that the results of analysis using the developed electrodes coincide with the results obtained by the reference method (HPLC).

Keywords: biosensors, screen-printed electrodes, glucose oxidase, bovine serum albumin, juice.

Kamanin Stanislav (s.s.kamanin@gmail.com), postgraduate student, department of chemistry, Tula State University.

Arlyapov Vyacheslav (v.a.arlyapov@gmail.com), candidate of chemical sciences, assistant professor, department of chemistry, Tula State University.

Поступила 23.06.2012

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.