CC BY
169
Известия Тульского государственного университета Естественные науки. 2010. Вып. 2. С. 256-264
Химия
УДК 544.6:57
Определение индекса БПК отходов и полупродуктов спиртового брожения с помощью медиаторного биосенсора *
Е.Ю. Инджгия, Ю.С. Хитрова, О.Н. Понаморева, Е.Е. Бабкина
Аннотация. Разработанный макет биосенсора на основе мембранной фракции бактерий GluconoЪacter oxydans и медиатора ферроцена применили для оценки индекса БПК полупродуктов и отходов спиртового брожения. Разработанный биосенсор позволяет получать данные с высокой корреляцией к стандартному методу.
Ключевые слова: биохимическое потребление кислорода (БПК), бактерии GluconoЪacter oxydans, субстратная специфичность, медиа-торный биосенсор.
Введение
Экспресс-оценка загрязнения объектов окружающей среды, в частности, определение органических примесей в поверхностных, грунтовых и сточных водах, является актуальной задачей. Возрастающее внимание уделяется экспресс-методам контроля, ориентированным на оценку совокупного воздействия токсикантов на окружающую среду. Для оценки степени загрязненности воды в настоящее время широко применяется такой параметр как биохимическое потребление кислорода (БПК) — количество растворенного кислорода (мг), необходимое для окисления всех биоразложимых органических отходов находящихся в 1 дм3 воды.
Традиционная методика определения БПК требует инкубирования насыщенной кислородом пробы в течение 5, 10 или 20 суток (БПК5, БПК10 или БПК20, соответственно) [1], что далеко не всегда является приемлемым методом индикации, поскольку сопряжено со значительным затратами времени от начала анализа до получения его результата. Поэтому наиболее перспективным является использование биосенсорных экспресс-анализаторов для определения БПК, например: клеточных биосенсоров на основе кислородного электрода Кларка, принцип функционирования которых основан на измерении скорости дыхания микроорганизмов вблизи поверхности
* Работа выполнена в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы» (гос. контракты № 02.740.11.0296, № П 258).
преобразователя [2-4]. Для того, чтобы измерения не зависели от содержания кислорода, исследователи используют для измерения БПК биосенсоры меди-аторного типа. Медиатор является искусственным акцептором электронов, и взаимодействует непосредственно с ферментными системами бактерий.
Бактерии Gluconobacter oxydans (далее G. oxydans) обладают широкой субстратной специфичностью: утилизируют целый ряд спиртов и углеводов различного строения [5], что определяет их перспективность при использовании в биорецепторном элементе БПК-биосенсора. При выделении мембранной фракции бактерий, ключевые ферменты, с которыми взаимодействуют медиаторы, становятся более доступными для искусственных акцепторов электронов и субстратов, чем при использовании целых клеток. Тем самым, использование мембранной фракции бактерий является перспективным при разработке медиаторного биосенсора.
В качестве медиатора переноса электронов в биосенсорах часто используется ферроцен [6, 7, 8]. Данное вещество быстро реагирует с восстановленным ферментом и малорастворимо в водных средах, что является преимуществом при создании безреагентных биосенсоров.
Целью работы является разработка медиаторного биосенсора на основе ферроцена и мембранной фракции бактерий G. oxydans для экспресс-определения БПК.
Материалы и методы
В работе использовали уксуснокислые бактерии Gluconobacter oxydans sbsp. industrius VKM B-1280 (Всероссийская коллекция микроорганизмов УРАН Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина).
Мембранную фракцию получали разрушением биомассы бактерий G. oxydans на ультразвуковом генераторе УЗГ13-0,1/22 в фосфатно-цитратном буферном растворе рН 6,0, содержащем 1 мМ соли Mg2+ и Ca2+ с последующим центрифугированием полученного лизата бактерий при 4000 g (мембранные дегидрогеназы содержала надосадочная жидкость) и 14 000 g (мембранные дегидрогеназы содержал полученный осадок).
При исследовании применяли высокочувствительный электрохимический метод регистрации окислительной активности биологического материала с помощью медиаторных биосенсоров. Медиаторный биосенсор представлял собой двухэлектродную систему, в которой электродом сравнения служил хлорсеребряный электрод, а рабочим электродом — графитово-па-стовый электрод (площадь поверхности 7,1 мм2) с иммобилизованным биоматериалом. Биоматериал у поверхности рабочего электрода удерживали диализной мембраной (Sigma, размер пор 14 кДа), которую закрепляли на поверхности электрода при помощи пластикового кольца. Используемый в работе медиатор ферроцен входил в состав графитовой пасты (10 мг ферроцена на 90 мг графитовой пудры с добавлением 40 мкл минерального масла),
из которой формировали рабочий электрод. Электрохимические измерения проводили с помощью гальванопотенциостата IPC2000 («Кронас», Москва), интегрированного с компьютером. Амперометрические измерения проводили в цитратно-фосфатном буфере при непрерывном перемешивании раствора при помощи магнитной мешалки (300 об/мин). Зависимость силы тока рабочего электрода от времени регистрировали при фиксированном потенциале (E = 250 мВ относительно хлорсеребряного электрода). Измеряемым параметром сигнала сенсора в процессе каталитического окисления субстратов являлась амплитуда изменения тока, определяемая как разность между конечным и начальным значениями токов до и после введения субстрата в измерительную кювету.
Результаты и обсуждение
Субстратная специфичность мембранной фракции бактерий G. oxydans в условиях электрокаталитического окисления субстратов. Биоматериал, используемый в биорецепторном элементе биосенсора для определения БПК, должен обладать широкой субстратной специфичностью. Известно, что бактерии G. oxydans благодаря своей биохимической активности по отношению к целому ряду углеводов и спиртов могут быть использованы для определения суммарного содержания этих веществ в анализируемых образцах.
Ранее была определена субстратная специфичность целых клеток бактерий G. oxydans в условиях электрокаталитического окисления субстратов в присутствии медиатора [9]. Однако мембранная фракция может иметь другие биокаталитические свойства в связи с изменением доступности мембранных дегидрогеназ или другими факторами, изменяющими особенности биоматериала.
Изучена субстратная специфичность мембранной фракции бактерий G. oxydans в присутствии медиатора — ферроцена. В качестве модельных субстратов выбрали одноатомные спирты с разветвленным и неразветв-ленным углеродным скелетом и длиной цепи от 1 до 4 атомов углерода (этанол, метанол, 1-пропанол, 2-пропанол, 1-бутанол, 2-метил-1-пропанол, 2-метил-2-пропанол), многоатомный спирт (глицерин), моносахариды ряда альдоз (пентоза — ксилоза; гексозы — глюкоза, манноза, галактоза и кетоз — фруктоза), а также наиболее часто встречающиеся в природе дисахариды (сахароза, мальтоза, лактоза). Все субстраты использовали в концентрации 50 мМ, которая является насыщающей для глюкозы и этанола в условиях эксперимента.
Из всех применявшихся в исследовании субстратов наиболее эффективно мембранная фракция бактерий G. oxydans окисляет глюкозу. Из диаграммы (рис. 1) видно, что ответы сенсоров на фруктозу не наблюдались. Это можно объяснить разным строением субстратов (глюкоза, манноза, галактоза — альдозы; фруктоза — кетоза), а, следовательно, различным сродством
данных субстратов к ферменту. Из использовавшихся дисахаридов ответы наблюдались только на мальтозу. Вероятно, ферментная фракция из бактерий О. охусЫив содержит специфическую гидролазу, способную катализировать только окисление дисахарида мальтозы. Высокие ответы биосенсора наблюдались при окислении одноатомных спиртов нормального строения: 1-пропанола, 1-бутанола, этанола. Окисление разветвленных спиртов проходило менее эффективно, причем по мере уменьшения степени разветвления и удаления разветвленного конца от атома углерода с гидроксильной группой, ответы сенсора увеличивались.
Полученная в работе субстратная специфичность мембранной фракции бактерий хорошо согласуется с субстратной специфичностью целых клеток
О. охуйаив. Это позволяет предположить, что в биосенсорах на основе целых клеток бактерий с медиатором электронного транспорта взаимодействуют преимущественно мембранлокализованные ферменты.
Рис. 1. Профиль субстратной специфичности бактерий 01исопоЪасЬвт охуйапв и выделенной из них мембранной фракции в условиях электрокаталитического окисления субстратов в присутствии ферроцена как медиатора электронного транспорта (за 100% принимают ответ биосенсора на глюкозу)
Однако, при использовании мембранной фракции в качестве биокатализатора ответы биосенсора на спирты становятся соизмеримыми с ответами на глюкозу, в отличие от клеток, где ответ на глюкозу и другие углеводы выше ответов на спирты. Возможно, это связано с тем, что активные центры
алкогольдегидрогеназ становятся более доступными для медиатора после их выделения в виде мембранной фракции.
Таким образом, при использовании в качестве биокатализатора мембранной фракции селективность биосенсора меняется незначительно, но при этом величины генерируемых ответов возрастают, что свидетельствует о более эффективном взаимодействии субстрата с биоматериалом. Кроме того, при использовании в биосенсорах целых клеток может происходить их десорбция с электродной поверхности и даже гибель, а мембранная фракция является более стабильным биокатализатором, поэтому является наиболее перспективной при создании биосенсоров.
Экспресс-определение индекса БПК медиаторным биосенсором на основе мембранной фракции бактерий Gluconobacter oxydans.
Биосенсор на основе мембранной фракции бактерий и медиатора ферроцена применили для определения индекса БПК. Для построения градуировочной зависимости ответа биосенсора от концентрации аналита использовалась смесь глюкозы и глутаминовой кислоты (ГГС) с концентрацией 20 г/ дм3 — стандарта для определения индекса БПК [10]. На рис. 2 представлен линейный участок градуировочной зависимости ответов медиаторного биосенсора от концентрации ГГС в измерительной кювете.
<
X
GS
а
е
и
и
а»
и
о
я
ю
н
а»
я
н
О
3000
2500
2000
1500
1000
500 -
Концентрация ГГС, мг/дм
Рис. 2. Зависимость ответов медиаторного биосенсора на основе мембранной фракции бактерий от концентрации глюкозо-глутаматной
смеси
Пересчет концентрации ГГС в значения БПК проводили исходя из теоретического соотношения БПК = 0, 68 х С [10], где С — концентрация ГГС, осуществляли. Полученная зависимость ответов биосенсора от БПК представлена на рис. 3.
БПК, мг/дм3
Рис. 3. Зависимость ответов медиаторного биосенсора на основе мембранной фракции бактерий от значений индекса БПК
Линейный диапазон градуировочной зависимости ответов сенсора от концентрации глюкозо-глутаматной смеси составил 0,05-0,65 г/дм3, что соответствует значениям БПК 34-442 мг/дм3.
В качестве реальных образцов для определения индекса БПК с помощью медиаторного биосенсора использовали отходы спиртового производства (ржаную барду), а также полупродукты брожения пшеничной и ржаной муки, имитирующий состав сточных вод бродильных производств. Определение индекса БПК реальных образцов стандартным методом разбавления проводили согласно действующим в РФ нормативным документам, согласно которым содержание растворенного кислорода до и после пятидневной инкубации определяется иодометрическим методом Винклера [10].
Полученные результаты определения индекса БПК в реальных образцах с помощью биосенсора согласуются с данными, полученными стандартным методом разбавления (табл.1).
В процессе брожения при производстве спирта на основе пшеничной муки БПК изменяется от 2,9 до 490 г/дм3 в зависимости от времени брожения. После добавления первого фермента а-амилазы происходит разрушение
Таблица 1
Результаты определения БПК реальных образцов с помощью медиаторного биосенсора и стандартным методом разбавления
№ образца Название образца Значение БПК, определенное с помощью биосенсора, г/дм3 Значение БПК, определенное стандартным методом, г/дм3
1 Бродильная смесь на основе пшеничной муки после добавления 1-го фермента а-амилазы 3,1±0,2 2,9±0,2
2 Бродильная смесь на основе пшеничной муки после добавления 2-го фермента глюкоамилазы 33±2 35±2
3 Бродильная смесь на основе пшеничной муки после процесса брожения 480±50 490±50
4 Разваренная масса на основе ржаной муки 2,0±0,3 2,2±0,3
5 Бродильная смесь на основе ржаной муки после добавления 2-ух ферментов (глюкоамилазы и а-амилазы) 29±4 26±4
6 Бродильная смесь на основе ржаной муки после 65 ч брожения 45±5 47±5
7 Барда ржаная 3,0±0,6 2,8±0,6
крахмала на фрагменты — декстрины. При добавлении второго фермента глюкоамилазы происходит отщепление глюкозы от декстринов, и тем самым увеличивается количество глюкозы в пробе, поэтому значение индекса БПК резко увеличивается до 35 г/дм3. Смесь после длительного процесса брожения содержит большое количества спирта, который является легкоутилизи-руемым субстратом для бактерий, поэтому индекс БПК увеличился в 14 раз. При производстве спирта на основе ржаной муки после осахаривания разваренной массы происходит резкое увеличение индекса БПК, что определяется увеличение содержания в пробе глюкозы. После 65 часов брожения значение индекса БПК увеличивается в 2 раза, что связано с увеличением содержания спиртов в бродильной массе. Значение БПК для ржаной барды составило 2,8 г/дм3, данное значение БПК определяется содержанием веществ, оставшихся в пробе после отгонки спирта. Все исследуемые образцы относятся к седьмому классу загрязнения воды и являются чрезвычайно грязными.
Таким образом, разработанный макет медиаторного биосенсора на основе мембранной фракции бактерий С. охусЫив и медиатора ферроцена можно использовать для определения индекса БПК стоков бродильных производств,
предприятий пищевой и биотехнологической промышленности, содержащих углеводы и спирты.
Список литературы
1. Фомин Г.С. ВОДА. Контроль химической, бактериальной и радиационной безопасности по международным стандартам. Энциклопедический справочник. М.: 2000. 848 с.
2. Hikuma M., Suzuki H, Yasuda T, Karube I., Suzuki S. Amperometric estimation of BOD by using living immobilized yeasts // European J. of Applied Microbiology and Biotechnology. 1979. №8. P.289-297.
3. Nomura Y, Chee G. J., Karube I. Biosensor technology for determination of BOD // Field Analytical Chemistry and Technology. 1998. №2. P.333-340.
4. Riedel K., Kunze G, Konig A. Microbial sensors on a respiratory basis for wastewater monitoring // Advances in biochemical engineering/biotechnology. 2002. №75. P.81-118.
5. The genus Gluconobacter oxydans: Comprehensive overview of biochemistry and biotechnological applications / C. Muynsk [et al.] // Critical Rev. in Biotechnology. 2007. №27. P.147.
6. Allen P.M., Hill H.A.O. Watron N.J. Surfase modifiers for the promotion of direct electrochemistry of cytocrome c // J. Electroanal. Chem. 1984. V.178. P.69-86.
7. Smolander M, Livio H, Rasanen L. Mediated amperometric determination of xylose and glucose with an immobilized aldose dehydrogenase electrode // Biosens. Bioelectron. 1992. V.7. P.637-643.
8. Li C. X, Zeng Y. L, Tang C. R. Glucose Biosensor Based on Carbon/PVC-COOH/ Ferrocene Composite with Covalently Immobilized Enzyme // Chinese Chemical Letters. 2005. V.16, №10. P.1357-1360.
9. Чигринова Е.Ю., Бабкина Е.Е., Алферов В.А. Безреагентный медиаторный биосенсор на основе бактерий Gluconobacter oxydans для определения БПК сточных вод // Изв. ТулГУ. Сер. Химия. 2006. Вып.6. С.153-161.
10. ПНД Ф 14. 1:2:3:4.1 23-97. Количественный химический анализ вод. Методика выполнения измерений биохимической потребности в кислороде после п-дней инкубации (БПКполн.) в поверхностных пресных, подземных (грунтовых), питьевых, сточных и очищенных сточных водах. М.: 1997. 25 с.
Инджгия Екатерина Юрьевна (enot_kat@rambler.ru), аспирант, кафедра химии, Тульский государственный университет.
Хитрова Юлия Сергеевна, студент, кафедра химии, Тульский государственный университет.
Понаморева Ольга Николаевна, к.х.н., доцент, кафедра химии, Тульский государственный университет.
Бабкина Елена Евгеньевна, к.х.н., доцент, кафедра химии, Тульский государственный университет.
Detection of bod index of the waste and semiproducts of ethanol fermentation by mediator biosensor
E.Yu. Indzhgiya, Yu.S. Hitrova, O.N. Ponamoreva, E.E. Babkina
Abstract. The developed model of a biosensor based on the membrane fractions of bacteria Gluconobacter oxydans and ferrocene mediator have applied to an estimation of BOD index of semiproducts and a waste of ethanol fermentation. The developed biosensor allows obtaining data with high correlation to a standard method.
Keywords: biochemical oxygen demand (BOD), Gluconobacter oxydans, substrate specificity, mediator biosensor.
Indzhgiya Ekaterina (enot_kat@rambler.ru), postgraduate student, department of chemistry, Tula State University.
Hitrova Yulia, student, department of chemistry, Tula State University.
Ponamoreva Olga, candidate of chemical sciences, associate professor, department of chemistry, Tula State University.
Babkina Elena, candidate of chemical sciences, associate professor, department of chemistry, Tula State University.
Поступила 10.04.2010
