CC BY
81
УДК 543.382
СОЗДАНИЕ БИОСЕНСОРА НА ОСНОВЕ БАКТЕРИЙ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ АКТИВНОГО ИЛА, ДЛЯ ЭКСПРЕСС-МОНИТОРИНГА ВОДНЫХ СРЕД
Н.Ю. Юдина, Т.Н. Абрамова, В.А. Арляпов
Проведена разработка биосенсора на основе бактерий Pseudomonas veronii, выделенных из активного ила очистных сооружений. БПК-биосенсор на их основе обладает широким диапазоном детекции БПК5 (0,8-1360 мг/дм3), высокой долговременной стабильностью, широкой субстратной специфичностью и в несколько раз превосходит аналоги по чувствительности и нижней границе определяемых концентраций.
Ключевые слова: биосенсор, биохимическое потребление кислорода, БПК, активный ил, бактерии Pseudomonas veronii
В настоящее время актуальным является разработка методов и аппаратуры для экспресс-анализа природных и сточных вод. Одним из параметров, определяющих интегральную загрязненность воды, является биохимическое потребление кислорода (БПК). Стандартная методика определения БПК требует инкубирования насыщенной кислородом пробы в течение 5 или 20 суток (БПК5 или БПК20). В соответствии с мировой практикой эффективным подходом для экспресс-оценки БПК является разработка биосенсоров на основе микроорганизмов, окисляющих широкий круг органических веществ [1], за рубежом создан ряд коммерческих БПК-биосенсоров на основе биореакторов.
По типу используемого биологического материала БПК-биосенсоры делятся на два вида: биосенсоры на основе микробной популяции (как и в стандартном методе) или индивидуальной культуры. Использование ассоциаций (активный ил, искусственные консорциумы) позволяет расширить спектр окисляемых органических соединений, с одной стороны, а с другой стороны, такие сенсоры обладают низкой воспроизводимостью, операционной и долговременной стабильностью [2-4]. C другой стороны, использование только одного вида микроорганизмов (бактерий или дрожжей) с определенными потребительскими свойствами (стабильность при работе, способность окислять различные классы органических веществ, устойчивость при иммобилизации) улучшает воспроизводимость измерений, но ограничивает биологический потенциал биодеградации [1, 5-6].
Некоторые авторы решают проблему с помощью применения искусственных микробных ассоциаций 2-4 штаммов [7, 8], чтобы получить датчик, сочетающий хорошую воспроизводимость с большой субстратной специфичностью. Однако такие многовидовые смеси трудно
поддерживать в течение длительного времени из-за их конкуренции за субстрат.
Альтернативой может быть использование нескольких отдельных микроорганизмов, что позволит сохранить высокую биодеградационную активность и одновременно упростит процесс поддержания жизнедеятельности [9]. В статье показано использование микробных панелей, состоящих из 7 штаммов (Pseudomonas fluorescens, Aeromonas hydrophila, Pseudomonas putida, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Paenibacillus sp., Microbacterium phyllosphaerae), используемых по отдельности. Данные, представленные для каждого штамма, одновременно анализируются и подвергаются статистической обработке. Полученные значения БПК полностью коррелируют с БПК7, измеренным стандартным методом (R2=1; 30 проб).
Использование суспензированного активного ила водоочистных предприятий в качестве биоматериала для формирования биорецепторных элементов БПК-биосенсоров является более перспективным, поскольку данная естественная ассоциация, которая также применяется как биологическая затравка в стандартном методе определения БПК, адаптирована к химическому составу тестируемых сточных вод, что позволяет эффективно производить оценку индекса БПК. Однако БПК-биосенсоры на основе активного ила нестабильны в работе, поскольку биоценоз активного ила может меняться с течением времени. В связи с этим необходим новый подход, направленный на выделение отдельных штаммов микроорганизмов из активного ила и использование их для формирования биорецепторного элемента БПК-биосенсора. Таким образом, целью данной работы являлось создание и изучение характеристик амперометрического БПК-биосенсора на основе бактерий, выделенных из активного ила.
Материалы и методы
Культивирование клеток микроорганизмов. Клетки бактерий Pseudomonas veronii были выделены из активного ила с очистных сооружений города Тулы. Бактерии Pseudomonas veronii культивировали на богатой минеральной среде (жидкая питательная глюкозо-пептонная среда). Состав жидкой среды: глюкоза - 10 г/дм3 (OOO «Диаэм»), пептон -5 г/дм3 (OOO «Диаэм»), дрожжевой экстракт - 0,5 г/дм3 (OOO «Диаэм»). Среду для культивирования клеток стерилизовали автоклавированием при давлении в 1 атмосферу в течение 45 минут. Клетки культивировали аэробно 18-20 часов в качалочных колбах объемом 750 см3 при температуре 29 оС. Затем полученную биомассу центрифугировали при комнатной температуре при 10000 об/мин 10 минут (центрифуга TG16WS, Поликом LTD, Россия). Далее центрифугат промывали 20 мМ фосфатным буфером рН 6,8. Клетки рассуспендировали буферным раствором,
распределяли в микропробирках типа Eppendorf и центрифугировали на центрифуге «Eppendorf» 5 минут при 10000 об/мин. Промытую биомассу хранили при температуре -25 °С в микропробирках.
Иммобилизация микроорганизмов с применением диализной мембраны. Для иммобилизации с применением диализной мембраны проводили предварительное разбавление биомассы бактерий Pseudomonas veronii фосфатным буферным раствором в соотношении 1:1. 10 мкл полученной суспензии наносили на диализную мембрану D9777 (Sigma, США) и фиксировали на поверхности кислородного электрода с помощью резинового кольца.
Проведение биосенсорных измерений. Электрохимические измерения проводили с использованием анализатора «ЭКСПЕРТ-009» (ООО «Эконикс-Эксперт», Россия), сопряженного с персональным компьютером, работающим под управлением специализированного программного обеспечения EXP2PR (ООО «Эконикс-Эксперт», Россия). Программа позволяла производить регистрацию и обработку сигналов сенсоров. Измеряемым параметром (ответом биосенсора) являлась максимальная скорость изменения концентрации кислорода при добавлении субстратов (мг/дм3сек). Преобразователями являлись кислородные электроды типа Кларка, содержащие иммобилизованные клетки микроорганизмов. Измерения выполнялись в кювете объемом 5 мл. Для измерений использовали натрий-калиевый фосфатный буферный раствор (рН = 6,8), суммарная концентрация солей в котором составляла 20 мМ. Раствор перемешивали магнитной мешалкой (200 об/мин). В качестве модельной использовали смесь глюкозы и глютаминовой кислоты в массовом соотношении 1:1 (ГГС), которую применяют как стандарт в определении БПК5 в Российской Федерации и международной практике [10-11]. В соответствии с нормативной документацией принимали, что БПК5, равное 205 мг/дм3, соответствует раствору, содержащему 150 мг/дм3 глюкозы и 150 мг/дм3 глутаминовой кислоты (БПК5 = 0,68^Сггс).
Определение БПК5 стандартным методом разбавления. В качестве референтного метода для определения БПК5 был использован метод разбавления. Анализ проводили в соответствии с методикой, указанной в ПНДФ [10]. Определение содержания растворенного кислорода в исследуемых пробах выполняли амперометрическим методом в соответствии со стандартной методикой.
Результаты и их обсуждение
Выделение микроорганизмов активного ила и определение их ростовых характеристик. Из ассоциации активного ила очистных сооружений города Тулы посевом методом «газона» была выделена чистая культура микроорганизмов. Методом секвенирования гена 16S рибосомальной РНК установили родовую и видовую принадлежности
выделенных из активного ила бактерий (проведено на базе ВКМ ИБФМ РАН, г. Пущино). Уровень сходства выделенного штамма с типовыми штаммами известных видов составил 99.79 % (Pseudomonas veronii DSM 11331T).
Для разработки биорецепторного элемента биосенсора, обладающего высокой чувствительностью, необходимо использовать микроорганизмы с высокой окислительной активностью. Основным фактором, влияющим на активность микроорганизмов, является время культивирования. Для выбора оптимального времени культивирования бактерий Pseudomonas veronii была проанализирована зависимость окислительной активности клеток, составляющих рецепторный элемент, от времени роста (рис. 1).
Время, ч
Рис. 1. а - Кривая роста бактерий Pseudomonas veronii, полученная турбидиметрическим методом; б - Зависимость окислительной активности бактерий от времени роста (в качестве субстрата использован раствор ГГС в концентрации 500 мг/дм3)
Графическая зависимость оптической плотности культуральной жидкости от времени имеет сигмоидальную форму и является типичной кривой роста бактериальных микроорганизмов. Аппроксимация проводилась в программе Sigma Plot по сигмоидальному уравнению с четырьмя параметрами.
На кривой роста бактерий Pseudomonas veronii можно выделить несколько фаз роста (табл. 1).
Таблица 1
Фаза роста Время роста, ч
Лаг-фаза 0-6
Экспоненциальная фаза 6-12
Фаза линейного роста 12-20
Переходная фаза (фаза замедления роста) 20-36
Стационарная фаза 36-52
Бактерии P. veronii имеют достаточно короткую лаг-фазу (6 часов), в которой происходит адаптация микроорганизмов к изменившимся условиям среды. Для бактерий P. veronii характерны непродолжительные фазы экспоненциального и линейного роста и уже к 20 часам после посева достигается фаза замедленного роста.
Из представленных данных видно (рис. 1), что наибольшая активность бактерий Pseudomonas наблюдается в середине фазы замедления роста (28 часов). В начале стационарной фазы роста (36 часов) активность снижается более чем на 40 %. Активность бактерий Pseudomonas veronii в середине стационарной фазы не превышает 25% от максимально зафиксированной активности. Таким образом, для получения наиболее активной биомассы бактерий Pseudomonas veronii DSM 11331T время культивирования должно составлять 26-30 часов.
Определение характеристик БПК-биосенсора на основе бактерий Pseudomonas veronii, выделенных из активного ила. Активный ил широко используется для очистки сточных вод на очистных сооружениях. Но БПК-биосенсоры на основе активного ила нестабильны в работе, так как биоценоз активного ила может меняться с течением времени. В связи с этим актуальным является выделение чистых колоний микроорганизмов и использование их для формирования биорецепторного элемента БПК-биосенсора.
Для формирования биочувствительного элемента БПК-биосенсора использовали бактерии Pseudomonas veronii, выделенные из активного ила и иммобилизованные с применением диализной мембраны. Все характеристики определяли с использованием глюкозо-глутаматной смеси (ГГС). Смесь ГГС была выбрана, так как её применение как стандарта при анализе БПК определено в ПНДФ [10].
Важной характеристикой любого анализа является его селективность, т.е. возможность определения каждого компонента независимо от других. В случае биосенсорного анализа селективность определяется субстратной специфичностью биоматериала, используемого
для формирования биорецепторного элемента сенсора. Каждый микроорганизм имеет определенную субстратную специфичность, то есть способен окислять определенный круг субстратов. Чем меньше субстратов способна окислять используемая культура, тем выше селективность анализа.
Для определения только одного компонента системы можно использовать строго специфичные ферменты. Но для определения интегральных характеристик лучше использовать целые клетки, так как они являются неселективными, в силу того что в их состав входит огромное количество разнообразных ферментов. В частности, целые клетки применяются при мониторинге окружающей среды для измерения величины БПК. В этом случае широкая субстратная специфичность используемого биорецепторного элемента является преимуществом, так как приводит к повышению правильности результатов анализа.
В работе проведена оценка субстратной специфичности биорецепторного элемента по 33 субстратам, относящимся к разным классам органических соединений. В качестве субстратов были выбраны органические вещества, наиболее часто встречающиеся в стоках пищевых и технологических производств. Для оценки субстратной специфичности регистрировали отклик биосенсора на введение в измерительную кювету по 100 мкл растворов субстратов концентрацией 1 моль/дм3 (концентрация в кювете 24,39 мМ). Для труднорастворимых веществ применяли насыщенные растворы. Каждое измерение проводилось по 3 раза.
Бактерии Pseudomonas veronii, выделенные из активного ила, обладают наибольшей чувствительностью к глюкозе, ответ на неё был принят за 100 % (рис. 2). Наибольшие ответы на углеводы составили: галактоза - 84 %, сахароза - 46 %.
Исследуемые микроорганизмы плохо окисляют одноосновные и многоосновные спирты: этанол - 5 %, бутанол - 27 %, глицерин - 12 %, сорбит - 15 %. На метанол ответа сенсора не было зафиксировано, что может быть связано с высокой токсичностью этого спирта.
Далее были проанализированы ответы биосенсора на карбоновые кислоты и альдегиды. В связи с высокой токсичностью формальдегид оказывает ингибирующее действие на микроорганизмы, ответа сенсора на данный субстрат зафиксировано не было. Окисление дикарбоновых и одноосновных кислот проходило одинаково эффективно (52-95 %).
Наблюдалось окисление этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), что является важным с практической точки зрения. Величина отклика биосенсора на аминокислоты составила от 27 до 74 %.
Рис. 2. Субстратная специфичность биорецепторного элемента на основе бактерий Pseudomonas veronii
Таким образом, бактерии Pseudomonas veronii, выделенные из активного ила, способны окислять широкий спектр субстратов, которые могут быть обнаружены в сточных водах, что является перспективным с точки зрения возможности их использования для оценки БПК.
Для получения количественной информации о содержании анализируемых веществ в образце необходимо знать калибровочные характеристики биосенсора, то есть зависимость аналитического сигнала от концентрации. Поэтому градуировочная зависимость ответа биосенсора от концентрации определяемого вещества является важнейшей метрологической характеристикой. По экспериментальным данным построена зависимость отклика биосенсора от БПК5 в измерительной кювете (рис. 3).
о
*
т s
С\1
о
2,0
1,5 -
о 1,0 -о
ш о о
ю 0,5 -
0,0
1000 2000 3000
БПК5, мг/дм3
4000
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 БПК5, мг/дм3
Рис.3. Зависимость ответа биосенсоров от БПК5
Биорецепторы на основе целых клеток микроорганизмов являются биорецепторами каталитического типа, т.е. биологический ответ в таких системах обеспечивается ферментативными реакциями микроорганизмов. Поэтому зависимость, приведенная на рис. 3, хорошо аппроксимируется уравнением типа Михаэлиса-Ментен:
R = R max [ S ]
Km + [ S ] '
где Rmax - максимальная скорость потребления кислорода иммобилизованными микроорганизмами, достигаемая при [S]^», Км -эффективная константа Михаэлиса, т.е. концентрация субстрата, при которой R=Rmax/2.
Для снижения ошибок анализа, как правило, ограничиваются использованием линейного участка градуировочной зависимости, ограниченного сверху константой KM (2600± 500 мг/дм3), однако для получения коэффициента корреляции близкого к 0,99 (R=0,9950) линейный диапазон был сокращен с 2600 до 1360 мг/дм3. Нижняя граница линейного участка соответствует нижней границе определяемых содержаний и рассчитывалась статистическим методом, исходя из критерия значения относительного стандартного отклонения результатов измерения (Sr(C)) < 0,33 [12]. Значение нижней границы определяемых содержаний БПК5 составило 0,8 мг/дм3. Таким образом, линейный диапазон зависимости ответа биосенсора от БПК5 лежит в пределах 0,8 - 1360 мг/дм3.
Долговременная стабильность характеризует устойчивость работы сенсора в течение длительного периода времени. За время стабильной работы биорецепторного элемента принимается время, в течение которого величина сигнала составляла не менее 25 % от максимальной активности. Долговременную стабильность определяли путём ежедневного измерения величины ответа биосенсора на одну и ту же концентрацию раствора глюкозо-глутаматной смеси. Долговременная стабильность для БПК-биосенсора на основе бактерий Pseudomonas veronii, иммобилизованных в диализную мембрану составила 32 дня (уменьшение окислительной активности на 75 % от максимальной)
В табл. 2 представлены основные аналитические и метрологические характеристики биосенсора на основе бактерий Pseudomonas veronii.
БПК-биосенсор на основе бактерий Pseudomonas veronii, по сравнению с аналогами, характеризуются очень широким диапазоном определения БПК5 (0,8-1360 мг/дм3), что даёт возможность анализировать пробы воды без дополнительного разбавления, повышая точность измерений. По сравнению с БПК-биосенсором на основе активного ила, разработанный биосенсор обладает высоким коэффициентом чувствительности (в 30 раз выше) и обладает более низкой (в 3 раза)
нижней границей определяемых содержаний БПК, что позволит анализировать образцы воды категории «очень чистая». Разработанный биосенсор на основе индивидуальной культуры бактерий P.veronii , выделенной из активного ила, превосходят известные аналоги на основе активного ила по времени функционирования биосенсора без замены рецепторного элемента. Операционная стабильность и время единичного измерения сопоставимы для всех рассматриваемых биосенсоров.
Таблица 2
Характеристики эиосенсоров на основе бакте1 рий P. veronii и аналогов
^^^^^ Аналоги характернстики-^^^ Разработанный биосенсор Аналог 1 [13] Аналог 2 [1] Аналог 3 [14]
Микроорганизмы Активный ил Активный ил P.fluorescens
Способ иммобилизации Иммобилизация с применением диализной мембраны Включение в ПВС Включение в агарозу
Операционная стабильность Относительное стандартное отклонение по 15 последовательным измерениям, %
8,2 7,6 - 7,7
Долговременная стабильность Время, в течение которого величина ответа биосенсора на одну и ту же концентрацию ГГС составляло не менее 25 % от максимальной, сутки
32 7 20 -
Чувствительность Тангенс угла наклона линейного участка зависимости -5 -1 ответа биосенсора от БПК5, *10 , с
90 ± 2 3 ± 1 4,8 мВ • дм3 мг -
Длительность единичного измерения Время развития ответа и время восстановления активности биосенсора
5-8 5-7 15 10-15
Диапазон определяемых содержаний бпк5 мг/дм3
0,8 - 1360 2,5-14 1-10 5-40
Таким образом, выделенные из активного ила бактерии Pseudomonas veronii DSM 11331T обладают высокой активностью и окисляют широкий спектр органических веществ, что позволяет создавать
на их основе высокоэффективные биорецепторные элементы для анализа качества воды.
Анализ образцов воды. Проведен анализ образцов воды с использованием разработанного биосенсора и стандартным методом разбавления. Пробы представляли собой сточные воды городских очистных сооружений, отобранные на разных стадиях очистки, сточные воды пищевого комбината, природные воды, в том числе вода из пруда, загрязненная горюче-смазочными материалами. Отбор проб и определение БПК5 стандартным методом разбавления проводилось согласно действующим в РФ нормативным документам [10]. На рис. 4 показана корреляция между значениями БПК, определенными с помощью биосенсора, и значениями БПК, определенными стандартным методом разбавления.
70
О 10 20 30 40 50 60 70 80
БПК, измеренное с помощью биосенсора, мг/дм3
Рис. 4. Корреляция данных, полученных стандартным методом и с помощью биосенсора на основе бактерий Pseudomonas veronii
Таким образом, значения БПК5, определенные с помощью биосенсора на основе микроорганизмов P. veronii, совпадают со значениями БПК5, полученными по стандартной методике с учетом доверительных интервалов. Корреляция со стандартным методом для биосенсора на основе бактерий Pseudomonas veronii, иммобилизованных с применением диализной мембраны, составила R=0,9956, что больше описанных ранее аналогов [1,13-14].
Заключение
Для создания высокочувствительного биорецепторного элемента БПК-биосенсора проведено выделение индивидуальных культур микроорганизмов из активного ила очистных сооружений города Тула. С использованием метода секвенирования гена 16S рРНК установлена родовая и видовая принадлежности бактерий, выделенных из активного ила - Pseudomonas veronii DSM 11331T. Бактерии Pseudomonas veronii обладают высокой активностью и окисляют широкий спектр органических веществ. При сравнении основных характеристик показано, что разработанный БПК-биосенсор на основе бактерий P. veronii, иммобилизованных методом капсулирования в диализную мембрану, превосходит аналоги на основе активного ила по диапазону определяемых содержаний БПК5 (0,8-1360 мг/дм3), долговременной стабильности (32 дня) и по чувствительности. Сформированный биосенсор на основе бактерий P. veronii позволяет определять содержание органических веществ с высокой точностью (коэффициент корреляции R=0,9956) и в очень чистых образцах воды.
Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект №17-74-10078)
Список литературы
1. Methods for assessing biochemical oxygen demand (BOD): A review / S. Jouanneau, L. Recoules, M. J. Durand [et al.] // Water research. 2014. V. 49. P. 62-82.
2. Микробные биосенсоры для определения биологического потребления кислорода / О.Н. Понаморева, В.А. Арляпов, В.А. Алферов [и др.]// Прикладная биохимия и микробиология. 2011. Т.47. №1. С. 5-15.
3. Liu J., Bjornsson L., Mattiasson B. Immobilised activated sludge based biosensor for biochemical oxygen demand measurement //Biosensors and Bioelectronics. 2000. V. 14. №. 12. P. 883-893
4. M. A. Jordan, D. T. Welsh, Peter R. A ferricyanide-mediated activated sludge bioassay for fast determination of the biochemical oxygen demand of wastewaters// Water Research. 2010. V. 44. № 20. P. 5981-5988.
5. Analytical applications of microbial fuel cells. Part I: Biochemical oxygen demand / X. C. Abrevaya, N. J. Sacco, M. C. Bonetto[et al.] //Biosensors and Bioelectronics. 2014. V. 63. P. 580-590.
6. Pseudomonas putida P67. 2 and Pseudomonas flourescens P75 based microbial sensors for biochemical oxygen demand (BOD) measurements in phenolic wastewaters of oil shale industry/ K.Raudkivi, M. Tutt, E.Talpsep[et al.] //Oil Shale. 2008. V. 25. №. 3. P. 376-387.
7. Novel BOD optical fiber biosensor based on co-immobilized microorganisms in ormosils matrix / L. Lin, L. L. Xiao, S. Huang [et al.] //Biosensors and bioelectronics. 2006. V. 21. №. 9. P. 1703-1709.
8. A yeast co-culture-based biosensor for determination of waste water contamination levels / N.Yu. Yudina, V.A. Arlyapov, M.A. Chepurnova [et al.] // Enzyme and Microbial Technology. 2015. №78. P.46-53.
9. Raud M., Kikas T. Bioelectronic tongue and multivariate analysis: A next step in BOD measurements //Water research. 2013. V. 47. №. 7. P. 25552562.
10. ПНДФ 14. 1:2:3:4. 123-97. Количественный химический анализ вод. Методика выполнения измерений биохимической потребности в кислороде после n-дней инкубации (БПКполн) в поверхностных пресных, подземных (грунтовых), питьевых, сточных и очищенных сточных водах. -М.: 1997. 25 c.
11. ISO 5815-1:2003, 2003. Water Quality - Determination of Biochemical Oxygen Demand after N Days (BODn), Part 1: Dilution and Seeding Method with Allylthiourea Addition.
12. Гармаш А.В., Сорокина Н.М. Метрологические основы аналитической химии. М.: Московский государственный университет, 2005. 34 с.
13. BOD biosensor based on the association of yeast and bacterial microorganisms / V.A.Arlyapov, N.Yu.Yudina, I.E. Ermilin [et al]// Materialy IX Mi^dzynarodowej naukowi-praktycznej konferencji «Aktualne problemy nowoczesnych nauk - 2013». V. 27. P. 32-33.
14. Comparative study of semi-specific Aeromonas hydrophila and universal Pseudomonas fluorescens biosensors for BOD measurements in meat industry wastewaters/ M. Raud, T. Tenno, E. Jogi [et al.] // Enzyme and Microbial Technology. 2012. V. 50. P. 221-226.
Юдина Наталья Юрьевна, канд. хим. наук, ассистент, tysia21-05-90@mail.ru, Россия, Тула, Тульский государственный университет,
Абрамова Татьяна Николаевна, студент, tanechka2576ayandex.ru, Россия, Тула, Тульский государственный университет,
Арляпов Вячеслав Алексеевич, канд. хим. наук, доц., v.a.arlyapov@gmail.com, Россия, Тула, Тульский государственный университет
DEVELOPMENT OF BIOSENSOR BASED ON BACTERIA PSEUDOMONAS VERONII, ISOLATED FROM ACTIVE SLUDGE, FOR RAPID WATER
MONITORING
N. Yu. Yudina, T. N. Abramova, V. A. Arlyapov
The development of a biosensor based on bacteria Pseudomonas veronii isolated from active sludge treatment plants has been carried out. BOD-biosensor based on them has
a wide range of detection of BOD5 (0.8-1360 mg/dm3), high long-term stability, broad substrate specificity and several times higher than analogues for sensitivity and lower limit of determined concentrations.
Key words: biosensor, biochemical oxygen consumption, BOD, activated sludge, bacteria Pseudomonas veronii
Yudina Natalia Yurevna, candidate of chemical sciences, assistant, tysia21-05-90@mail.ru, Russia, Tula, Tula State University,
Abramova Tatyana Nikolaevna, student, tanechka2576@yandex.ru, Russia, Tula, Tula State University,
Arlyapov Vyacheslav Alekseevich, candidate of chemical sciences, docent, v. a. arlyapov@gmail. com, Russia, Tula, Tula State University.
