CC BY
13
УДК 543.31 DOI: 10.24412/2071-6176-2023-2-78-91
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КОМПОЗИТА «УГЛЕРОДНЫЕ НАНОТРУБКИ - МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ФЕРРОЦЕНКАРБОКСАЛЬДЕГИДОМ БЫЧИЙ СЫВОРОТОЧНЫЙ АЛЬБУМИН» ДЛЯ СОЗДАНИЯ БПК-БИОСЕНСОРА НА ОСНОВЕ ДРОЖЖЕЙ BLASTOBOTRYS ADENINIVORANS BKM Y-2677
А.С. Харькова, Т.В. Лаврова, Д.В. Провоторова
Обсуждается возможность использования композитного материала на основе бычьего сывороточного альбумина (БСА), ковалентно связанного с ферроценкарбок-сальдегидом и содержащего углеродные нанотрубки (УНТ), для иммобилизации дрожжей Blastobotrys adeninivorans BKM Y-2677. Оптимальное соотношение ферро-ценкарбальдегида к БСА для синтеза редокс-активного полимера составляет 1:2, так как гетерогенная константа переноса электронов составляет 0,45±0, 01 см/с. При добавлении к этому полимеру углеродных нанотрубок (УНТ) происходит увеличение константы гетерогенного переноса до 0,55±0,01 см/с. Введение УНТ в состав проводящей системы на порядок увеличивает константу скорости взаимодействия редокс-частиц с дрожжами B. adeninivorans: константа скорости взаимодействия дрожжей B. adeninivorans с электроактивными частицами в редокс-активном полимере 0,056±0,005 дм3/г*с и в композитном материале на основе УНТ 0,51±0,02 дм3/г*с. Сформированные на основе гибридных полимеров биосенсоры имеют высокую чувствительность, нижнюю границу определяемых концентраций, составляющую 1,5 мг/дм3, и высокую корреляцию (R=0,9945) с результатами стандартного метода определения биохимического потребления кислорода в образцах поверхностных вод Тульской области.
Ключевые слова: редокс-активный полимер, бычий сывороточный альбумин (БСА), ферроцен, биохимическое потребление кислорода (БПК), биосенсор, дрожжи Blastobotrys adeninivorans.
Введение
На сегодняшний день важной задачей является возможность быстрого и точного анализа природных водных объектов, так как стандартные методики зачастую не являются экспрессными. Для оценки степени загрязнения сточных вод органическими веществами, используют индекс биохимического потребления кислорода (БПК), который определяет количество кислорода, потребляемого микроорганизмами при биодеградации органических веществ в 1 дм3 пробы. Использование медиаторов электронного транспорта позволяет проводить анализ независимо от концентрации растворенного кислорода. Для увеличения срока работы и повышения чувствительности рецепторного элемента используют редокс-активный полимер, синтезированный при помощи сшивкиэлектроактивного вещества с полимерным носителем. При введении в состав рецепторного элемента углеродных нанотрубок
существенно увеличивается проводимость биосенсорной системы. При разработке БПК-биосенсора также важным является выбор подходящего биоматериала, способного к окислению широкого спектра веществ. Наиболее часто для этого используют прокариотические клетки [1, 2].
В данной работе рассматривается возможность использования редокс-активного полимера БСА, модифицированного ферроценкарбокс-альдегидом, для иммобилизации дрожжей Blastobotrys adeninivorans BKM Y-2677.
Реактивы и материалы
В качестве медиатора электронного транспорта использовали ферроценкарбоксальдегид («Sigma-Aldrich», Германия). В качестве основы редокс-активного полимера использовали БСА («Sigma-Aldrich», Германия). Для создания рабочего графито-пастового электрода применяли графитовую пудру с размером частиц 75 микрон с высокой частотой 99,997% («Fluka», Германия), парафиновое масло («Fluka», Германия) и диализную мембрану с пределом пропускания 14 кДа («Roth», Германия). Для проведения биосенсорных измерений использовали натрий-калий фосфатный буферный раствор рН=6,8 (33 мМ KH2PO4 + 33 мМ Na2HPO4, ООО "Диаэм", Россия).
Культивирование клеток микроорганизмов. В работе были использованы дрожжи Blastobotrys adeninivorans BKM Y-2677 (B. adeninivorans). Для выращивания микроорганизмов использовали шейкер-инкубатор ES-20/60 («BioSan», Латвия), центрифуги «TG16WS» (Поликом LTD, Россия) и «MiniSpinplus» (Eppendorf, Россия). Биомассу хранили в микропробирках при температуре -25 °С.
Для культивирования дрожжей B. adeninivorans использовали среду следующего состава: глюкоза - 1%, пептон - 0,5%, дрожжевой экстракт -0,05%. Время культивирования составляло 18-20 часов при температуре 28 °С. Центрифугирование проводили при 7000 об. в течение 10 мин. Для приготовления суспензии клеток использовали фосфатный буферный раствор рН 6,8.
Синтез редокс-активного полимера на основе БСА и медиатора ферроценкарбоксальдегида и формирование рабочего электрода. Для
формирования проводящей матрицы 0,5 г БСА растворяли в 5 мл буферного раствора. Затем 0,05 г ферроценкарбоксальдегида растворяли в 5 мл ацетона, данную смесь приливали к раствору БСА. Полученный раствор доводили до рН=9,3 путём добавления 5% K2CO3. После чего добавляли 0,01 г NaBH4 к смеси, перемешивали в течение 10 минут и выдерживали при комнатной температуре в течение 6 часов. рН полученной смеси доводили до 6,5, чтобы разложить оставшийся NaBH4. Затем рН смеси доводили до 8,5 путём добавления по каплям 0,1 М раствора NaOH. Смесь центрифугировали при 3000 об/мин в течение 20 минут. Полученный супернатантдиализовали фосфатным буферным
раствором в течение нескольких дней при температуре 4 °С для отделения непрореагировавшего ферроценкарбоксальдегида.
Для формирования электрода навеску синтезированной матрицы массой 0,0035 г растворяли в 50 мкл фосфатного буфера (рН=6,8) и добавляли 7,5 мкл глутарового альдегида. На графито-пастовый электрод наносили 10 мкл полученной смеси и оставляли для полного высыхания.
Для модификации редокс-активных полимеров 0,0005 г суспензии (0,5% масс.) одностенных углеродных нанотрубок (ООО «Углерод Чг», Россия) добавляли 100 мкл деионизованной воды и оставляли в ультрозвуковой бане на 15 минут. Полученную суспензию в количестве 10 мкл добавляли к редокс-активному полимеру при приготовлении рабочих электродов. Таким образом, было сформированы электрод БСА-ФЦ-УНТ. Для формирования биоэлектрода 20 мкл суспензии бактерий В. adeninivorans наносили и оставляли до полного высыхания. После высыхания покрывали электрод диализной мембраной.
Биосенсорные измерения. Электрохимические измерения проводили при помощи гальванопотенциостата «ГРС-тюго» (ООО НТФ Вольта, Санкт-Петербург), интегрированного с ПК. Диапазон регистрируемых токов 5 нА - 20 мкА. Ошибка измерения потенциала не больше 0,1 мВ для интервала ±5 мВ. Рабочий потенциал составлял 250 мВ. Температура измерения составляла 20 °С, объем ячейки был равен 5 см3. Измерения велись при непрерывном перемешивании. После установления стабильного уровня тока в ячейку вводили необходимое для получения заданной концентрации количество раствора субстрата. После каждого измерения производили промывку ячейки буферным раствором рН = 6,8. Измеряемым параметром являлось изменение силы тока (мкА), определяемая как разность между конечным и начальным значениями токов до и после введения субстрата.
Вольтамперная характеристика. Вольтамперограммы регистрировали, с помощью вольтамперометрического анализатора Экотест-ВА (ООО «Эконикс-Эксперт», Россия), используя трехэлектродную ячейку. В качестве рабочего электрода использовали модифицированный графито-пастовый электрод, в качестве вспомогательного электрода - платиновый. В качестве электрода сравнения использовали насыщенный хлоридсеребряный электрод (Ag/AgQ). Циклические вольтамперограммы регистрировали при скорости развертки 20-100 мВ/с в калий-натрий-фосфатном буфере (рН=6,8).
Результаты и их обсуждение
Электрохимические свойства полученных проводящих гелей исследовали методом циклической вольтамперометрии. В редокс-активных полимерах могут реализовываться две лимитирующие стадии
передачи электронов: прыжковый механизм и поверхностная реакция. Во всех исследуемых системах лимитирующей стадией является поверхностная реакция, поэтому для нахождения гетерогенных констант скорости переноса электронов использована модель Лавирона [3].
Для нахождения коэффициентов переноса строили графики прямолинейной зависимости потенциала анодного пика от логарифма скорости развертки logv, наклон которой равен -2,3RT/anF для катодного пика и 2,3RT/(1-a)nF для анодного пика. На рис. 1 представлен типичный вид вольтамперограммы и расчетный график для нахождения коэффициентов переноса.
Рис. 1. А. Вольтамперные зависимости для графито-пастового электрода с модифицированным феррооценкарбальдегидом БСА с мольным соотношением ферроценкарбальдегида к БСА соотношение 2:7. Б. Расчетный график для нахождения коэффициентов переноса
электронов по модели Лавирона
Найденные значения коэффициентов переноса приведены в табл. 1.
Процессы окисления для всех электродов протекают с гораздо большей
скоростью, чем процессы восстановления, так как значения
коэффициентов для анодных процессов значительно превосходят значения
для катодных процессов. Следовательно, все системы не обратимы.
Гетерогенную константу скорости определяли по формуле (1).
Значения констант представлены в табл. 1.
, ,, ч , ^ ч ^ Ч1 , .ИТ. а(1-а)пРДЕ
\ogiks) = а 1оё(1 -а) + (1 -а)^а -М—)- --(1)
пру 2,3ИТ
где к^ - гетерогенная константа скорости электрохимической системы (с-1-см);
п - число участвующих электронов; Б - число Фарадея (Кл/моль);
V - скорость развертки потенциала (В/с); Я - универсальная газовая постоянная (Джмоль/К); Т - температура (К);
а - коэффициент переноса катодного процесса;
(1-а) - коэффициент переноса анодного процесса;
ДЕ - разность потенциалов анодного и катодного пиков (В).
Таблица 1
Выбор соотношения ферроценкарбоксальдегид - БСА для формирования редокс-активного полимера с учетом электрохимии
процессов переноса электронов
Соотношение ферроценкарбоксальдегид БСА Коэффициент переноса (а) Гетерогенная константа скорости переноса электронов к^, см/с
Анодный процесс Катодный процесс
1:8 0,9835±0,0001 0,0163±0,0002 0,42±0,02
2:7 0,9796±0,0003 0,0147±0,0004 0,43±0,03
1:2 0,9827±0,0003 0,0114±0,0003 0,45±0,01
Наибольшая константа скорости переноса электронов соответствует матрице с соотношением ферроценкарбальдегида к БСА 1:2. Следовательно, данное соотношение наиболее оптимальное, поэтому оно было выбрано для проведения дальнейшего изучения влияния наноматериалов на электрохимические свойства проводящей матрицы.
Выбор оптимального количества УНТ. При модификации электрода редокс-активным полимером с использованием УНТ увеличивается эффективная площадь поверхности электрода. Помимо этого, нанотрубки выполняют роль мостика между ковалентно-связанными с биополимером молекулами медиатора, что способствует увеличению скорости переноса электронов.
В присутствие УНТ константа гетерогенного переноса электронов увеличиваетсядо определенного момента, после чего начинает снижаться. Это объясняется тем, что количество медиатора ограничено, и после того, как все возможные мостики уже созданы, УНТ нарушают структуру матрицы.
При введении различного количество УНТ характер лимитирующей стадии не меняется, что позволило применить модель Лавирона для расчета коэффициентов переноса и гетерогенной константы скорости по формуле 1. Полученные значения представлены в табл. 2.
Таблица 2
Выбор оптимального количества УНТ для формирования композитного материала на основередокс-активного полимера и наночастиц с учетом электрохимии процессов переноса электронов
Удельная плотность УНТ мкг/мм2 Коэффициент переноса (а) Гетерогенная константа скорости переноса электронов к8, см/с
Анодный процесс Катодный процесс
0,2 0,9798±0,0001 0,0225±0,0002 0,49±0,02
1,2 0,9810±0,0002 0,0174±0,0001 0,51±0,04
2,5 0,9837±0,0003 0,0119±0,0001 0,55±0,01
3,7 0,9826±0,0004 0,0154±0,0001 0,43±0,02
5,0 0,9855±0,0003 0,0144±0,0001 0,42±0,02
Наибольшее значение гетерогенной константы скорости переноса электронов наблюдается при удельной плотности УНТ 2,5 мкг/мм2. Следовательно, такое количество является наиболее оптимальным для иммобилизации микроорганизмов при создании микробных биосенсоров.
Иммобилизация дрожжей в разработанный композитный материал. Для выявления общих закономерностей эффективности переноса заряда с помощью редокс-активных частиц на рабочую поверхность индикаторного электрода проводили сравнительную оценку эффективности биоэлектрокаталитического окисления глюкозы микроорганизмами В. adeninivorans в присутствие медиатора ферроцена, редокс-активного полимера и композитного материала. При регистрации циклической вольтамперограммы в присутствии глюкозы происходит увеличение анодного тока (рис. 2А) за счет электрокаталитического окисления субстрата бактериями, протекающего по следующей схеме:
Б + Еок(В. adeninivorans) ^ Р + Евос (В. adeninivorans) (2)
^вз
Евос (В. adeninivorans) + Мок=> Мвос+ Еок(В. adeninivorans) (3) Мвос^Мок+ иё, (4)
где Б - субстрат - глюкоза; Р - продукт;
Еок(В. adeninivorans) и Евос(В. adeninivorans) - окисленная и
восстановленная форма фермента дрожжей В. adeninivorans;
Мвос и Мок - восстановленная и окисленная форма медиатора электронного
транспорта;
иё - число электронов, перенесенных на электрод;
квз- константа скорости взаимодействия медиатора и биоматериала.
V1'2, мВ/с
Рис. 2. Определение константы взаимодействия медиатора с дрожжевыми клетками В. айепШуогатметодом циклической вольтамперометрии. А. Вольтамперограмма электрода с иммобилизованными в композитный материал «редокс-полимер - БСА - ферроцен - УНТ» дрожжами В. айептюогат в присутствии (1) и отсутствии (2) глюкозы. Б. Установление лимитирующей стадии по
зависимости предельного тока от корня скорости развертки у1/2 в системе «дрожжи В. айептыогат - «редокс-полимер БСА-ферроцен -
УНТ» - глюкоза»
Для того, чтобы медиатор был эффективным акцептором электронов для исследуемого биоматериала необходимо, чтобы константа скорости квз в уравнении (3) имела наибольшее значение. Полное описание использования метода циклической вольтамперометрии для определения константы взаимодействия представлено в работах Николсона и Шайна [4]. Для того, чтобы реакция (3) стала скоростьопределяющей, требуется создать определенные условия. Во-первых, для того, чтобы реакция (2) не являлась лимитирующей, требуется использовать субстрат в концентрации, превышающей константу Михаэлиса. В этой связи все эксперименты осуществляли в условиях избытка концентрации субстрата; при этом конечная концентрация глюкозы составляла 50 мМ. Во-вторых, чтобы реакция (4) не являлась скоростьопределяющей - перенос электронов должен быть достаточно быстрым, а фиксируемый ток был диффузионно ограниченным. Диффузионный характер лимитирующей стадии проверяли по зависимости предельного тока от корня скорости развертки у1/2 в системе «электрод - композитный материал/редокс-активный полимер - микроорганизмы - субстрат». Во всех исследуемых системах наблюдалась линейная зависимость, типичный вид которой представлен на рис. 2Б, таким образом, скорость переноса электронов определяется диффузией окисляемого субстрата - глюкозы. Таким образом, при условии избытка окисляемого субстрата и концентрации медиатора ниже константы Михаэлиса к исследуемым системам применима модель Николсона-Шайна. Предполагая, что ферментные
системы бактерий B. adeninivorans находятся в восстановленном состоянии из-за высокой концентрации субстрата найдена константа взаимодействия бактериями с исследуемыми медиаторами с помощью уравнения (5).
Для определения констант скорости были получены зависимости отношения предельных анодных токов в присутствии и в отсутствии субстрата (Ik/Id) от величины 1/v1/2; по тангенсу угла наклона линейной регрессии находили квз.
lkB3[E]RT
Id \ nFv ( )
где Ik- предельный ток в присутствии субстрата; Id- предельный ток в отсутствии субстрата (А); квз- константа скорости взаимодействия медиатора и биоматериала (дм3/мг*с);
R - универсальная газовая постоянная, Дж/моль*К;
T - температура, град. Кельвина К;
[E] - титр клеток (мг/дм3);
v - скорость развертки (В/с);
n - количество перенесенных электронов;
F - постоянная Фарадея (Кл/моль).
Полученные значения констант взаимодействия медиатора ферроцена, редокс-активного полимера БСА-ферроцен, композитного материала БСА-ферроцен-УНТ с дрожжами B. adeninivorans представлены в табл. 3.
Таблица 3
Константы скорости взаимодействия медиаторов электронного транспорта с бактериями Р. уввЬ и константы взаимодействия медиаторов с дрожжами Е.айвпШуогат, найденные в данной работе
Проводящая система Константа взаимодействия медиаторов с микроорганизмами, дм3/(гс)
Дрожжи B. adeninivorans Бактерий P. yeei
БСА-ферроцен 0,056±0,005 0,051±0,004 [5]
БСА-ферроцен-УНТ 0,51±0,02 0,055±0,001 [5]
Ферроцен 0,011±0,005 [7] 0,023±0,001 [6]
На основе полученных констант следует отметить, что иммобилизация дрожжей В. adeninivorans в редокс-активный полимер и композитный материал являются перспективной для дальнейшего использования в медиаторном биоэлектрокатализе. Полученные константы взаимодействия не уступают системам на основе прокариот - бактерий Р. yeei [5], а при добавлении наноматериалов увеличение константы взаимодействия происходит на порядок, вероятно, это связано со
способностью УНТ проникать внутрь клетки [8, 9] в результате чего увеличивается эффективность переноса электронов в рецепторном элементе. Таким образом, для формирования рецепторной системы БПК-биосенсора был выбран композитный материал «БСА-ферроцен-УНТ» так как он обладает высокой скоростью взаимодействия с эукариотами и высокой скоростью взаимодействия с электродом.
Определение аналитических и метрологических характеристик биосенсора на основе композитного материала. Для количественного определения содержания анализируемых веществ в образце была получена гиперболическая зависимость ответа сенсора от БПК5 (рис. 3), которая была аппроксимирована по уравнению Михаэлиса-Ментен (уравнение 6).
30 „э
40
0 10 20
БПК5(ГГС), мгО2/дм3
Рис. 3. Градуировочная зависимость ответа биосенсора на основе дрожжей В. adeninivorans, иммобилизованных в композитный материал, от концентрации БПК5.
Л1 =
Л1тах*[Б]
(6)
КМ + [Б]
где Л1 - скорость ферментативной реакции или ответ биосенсора, мкА;
максимальная скорость ферментативной реакции, мкА; Км - кажущаяся константа Михаэлиса, мг/дм3;
[5] - начальная концентрация модельного субстрата - глюкозо-глутаматной смеси, мг/дм3.
По градуировочной зависимости аналитического сигнала от БПК5 (рис. 3) определяли метрологические характеристики. Константа Михаэлиса составила 19±1 мг 02/дм3, нижняя граница определяемых концентраций - 1,5 мг 02/дм3. В табл. 4 представлены все характеристики разработанного биосенсора на основе дрожжей В. adeninivorans, иммобилизованного в композитный материал, и аналогов.
Таблица 4
Сравнительные характеристики аналитических и метрологических характеристик медиаторных биосенсоров
Биоматериал Проводящая система Линейный диапазон БПК5, мг/дм3 Время анализа, мин Ссылка
B. adeninivorans БСА-ферроцен-УНТ 1,5 - 19 5 Данная работа
P. yeei БСА-ферроцен-УНТ 0,1 - 2 5 [5]
B. adeninivorans Ферроцен - нейтральный красный 0,16-2,7 12 [7]
S. cerevisiae Гексацианоферрат (III) калия - витамин КЗ 20 - 225 20 [10]
B. subtilis Гексацианоферрат (III) калия - графен -полипирол 4-60 15 [11]
P. aeruginosa Гексацианоферрат (III) калия -полипирол 5-100 10 [12]
По полученным данным можно отметить, что нижняя граница определяемых концентраций БПК5 разработанного биосенсора на основе редокс-активного полимера БСА, модифицированного ферроценкарбокс-альдегидом и УНТ превосходит многие известные аналоги. Несмотря на то, что нижняя граница разработанного биосенсора выше некоторых разработок, чувствительность предлагаемого устройства позволяет проводить анализ в пределах ПДК. УНТ позволяют увеличить эффективность переноса электронов за счет повышения константы гетерогенного переноса электронов на электрод и константы взаимодействия, обеспечивая лучшие акцепторные свойства от клеток эукариот, при этом применение второго медиатора не требуется, что существенно упрощает анализ.
Апробация разработанного биосенсора. Апробация биосенсора на основе дрожжей B. adeninivorans и проводящей системы БСА-ферроцен-УНТ была проведена на девяти образцах поверхностных вод Тульской области (рис. 4). Отбор проб и определение БПК5 стандартным методом проводилось согласно действующим нормативным документам.
12
О -I-т-,-,-,-,-,-
О 2 4 6 8 10 12 14
г>
БПК5, измеренное стандартным методом, мг/дм
Рис. 4. Линейная зависимость результатов определения БПК5, полученных стандартным методом и с помощью разработанного
биосенсора
Статистическая обработка (модифицированный тест Стьюдента) полученных результатов показала, что данные, полученные обоими методами, отличаются незначимо. Разработанный биосенсор можно использовать в качестве альтернативы стандартному анализу.
Заключение
В работе предложен композитный материал на основе БСА, модифицированного ферроценкарбоксальдегидом для иммобилизации дрожжей В. adeninivorans. На основе электрохимических исследований были найдены оптимальные соотношения для получения редокс-активного полимера - соотношение ферроценкарбальдегида к БСА 1:2, так как гетерогенная константа переноса электронов составляет 0,45±0,01 см/с. При добавлении к этому полимеру углеродных нанотрубок происходит увеличение константы гетерогенного переноса электронов за счет того, что нанотрубки выполняют роль мостика между ковалентно связанными с полимером молекулами медиатора. Наибольшая константа соответствует удельной плотности УНТ 2,5 мкг/мм2 и составляет 0,55±0,01 см/с. Введение наноматериалов не только увеличивает скорость передачи электронов на электрод, но и скорость взаимодействия с эукариотами (константа взаимодействия с биоматериалом составляет 0,51±0,02 дм3/(гс)), что позволяет эффективно использовать указанный биоматериал в одномедиаторной системе.
Показано эффективное использование разработанного рецепторного элемента для определения БПК5: диапазон определяемых концентраций составляет 1,5 - 19 мг/дм3, что позволяет проводить анализ в пределах ПДК. Результаты анализа природных вод с помощью биосенсора
на основе иммобилизованных в композитный материал дрожжей и стандартным методом статистически незначимо различаются и имеют высокую корреляцию (R=0,9945). Предлагаемая комбинация микроорганизмов и проводящей системы может использоваться в дальнейшем для создания прототипа БПК-биосенсора, чувствительность которого не будет уступать известным аналогам.
Работа выполнена в рамках гранта Президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых российских ученых -кандидатов наук, номер гранта № МК-4815.2022.1.4.
Список литературы
1. MICREDOX —development of a ferricyanide-mediated rapid biochemical oxygen demand method using an immobilised Proteus vulgarisbiocomponent / Pasco N., Baronian K., Jeffries C. [et al.] // Biosens. Bioelectron. 2004. V. 20. № 3. P. 524-532.
2. Improvement of a mediator-type biochemical oxygen demand sensor for on-site measurement / Yoshida N., Hoashi J., Morita T. [et al.] // J. Biotechnol. 2001, V. 88.№3. P. 269-275.
3. Laviron E. General expression of the linear potential sweep voltammogram in the case of diffusionless electrochemical systems. // J. Electroanal. Chem. 1979. V. 101. № 1. P. 19-28.
4. A Label-Free Amperometriclmmunosensor Based on RedoxActiveFerrocene-Branched Chitosan/Multiwalled Carbon Nanotubes Conductive Composite and Gold Nanoparticles /Liang R.P., Fan L.X., Huang D.M. [et al.] // Electroanalysis. 2011. V. 23. № 3. P. 719-727.
5. Use of biocompatible redox-active polymers based on carbon nanotubes and modified organic matrices for development of a highly sensitive BOD biosensor / Arlyapov V.A., Kharkova A.S., Kurbanaliyeva S.K. [et al.] // Enzyme Microb. Technol. 2021. V. 143. № 109706.
6. Measurements of oxidoreductase-like activity of intact bacterial cells by an amperometric method using a membrane-coated electrode / Ikeda T., Kurosaki T., Takayama K. [et al.] //Anal. Chem. 1996. V. 68. №1. P. 192-198.
7. A kinetic approach to the formation of two-mediator systems for developing microbial biosensors as exemplified by a rapid biochemical oxygen demand assay / Kharkova A., Arlyapov V., Ilyukhina A. [et al.] // 3 Biotech. 2021. V. 11. №. 5. P. 1-13.
8. Maksimova Y. G. Microorganisms and carbon nanotubes: interaction and applications // Applied Biochemistry and Microbiology. 2019. V. 55. p. 112.
9. Immobilisation of yeast cells on carbon nanotubes / Mamvura T. A., Iyuke S. E., Sibanda V. [et al.] // South African Journal of Science. 2012. V. 108. № 7. p. 1-7.
10. Bacterial cellulose immobilized S. cerevisiae as microbial sensor for rapid BOD detection / Zhao C., Wang G., Sun M. [et al.] // Fibers and Polymers. 2021. V. 22. № 5. P. 1208-1217.
11. A Mediated BOD Biosensor Based on Immobilized B. Subtilis on Three-Dimensional PorousGraphene-Polypyrrole Composite/ Hu J., Li Y., Gao G., Xia S. [et al.] // Sensors. 2017. V. 17. № 11. P. 2594.
12. Development of a mediator-type bioelectrochemical sensor based on polypyrrole immobilized ferricyanide and microorganisms for biochemical oxygen demand fast detection / Hu J., Gao G., Xia S. [et al.] // Int. J. Electrochem. Sci. 2015. V. 10. P. 9695-9705.
Харькова Анна Сергеевна, канд. хим. наук, доцент, [email protected], Россия, Тула, Тульский государственный университет,
Лаврова Татьяна Валерьевна, [email protected], студент, Россия, Тульский государственный университет,
Провоторова Дарья Владимировна, [email protected], аспирант, Россия, Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН
USE OF THE COMPOSITE ""CARBON NANOTUBES - BOW SERUM ALBUMIN MODIFIED WITH FERROCENKARBOXALDEHYDE" TO CREATE
A BOD-BIOSENSOR BASED ON THE YEAST BLASTOBOTRYS ADENINIVORANS BKM Y-2677
A.S. Kharkova, T.V. Lavrova, D.V. Provotorova
The possibility of using a BSA-based composite material covalently bound to ferro-cenecarboxaldehyde and containing carbon nanotubes (CNTs) for the immobilization of the yeast Blastobotrys adeninivorans BKM Y-2677 is discussed. The optimal ratio of ferro-cenecarbaldehyde to BSA for the synthesis of a redox-active polymer is 1:2, since the heterogeneous electron transfer constant is 0,45±0,01 cm/s. When carbon nanotubes (CNTs) are added to this polymer, the heterogeneous transfer constant increases to 0,55±0,01 cm/s. The introduction of CNTs into the composition of the conducting system increases the rate constant of the interaction of redox particles with yeast B. adeninivorans by an order of magnitude: the rate constant of interaction between yeast B. adeninivorans and electroactive particles in a redox-active polymer is 0,056±0,005 dm3/g*s and in a composite material based on CNT 0,51±0,02 dm3/g*s. . The biosensors formed on the basis of hybrid polymers have a high sensitivity with a lower limit of determined concentrations of 1.5 mg/dm3 and a high correlation (R=0,9945) with the results of the standard methodfor determining biochemical oxygen demand in surface water samples of the Tula region.
Keywords: redox-active polymer, bovine serum albumin (BSA), ferrocene, biochemical oxygen demand (BOD), biosensor yeast Blastobotrys adeninivorans.
Kharkova Anna Sergeevna, Candidate of Chemical Sciences, Associate Professor, [email protected], Russia, Tula, Tula State University,
Lavrova Tatyana Valerievna, [email protected], student, Russia, Tula State University,
Provotorova Daria Vladimirovna, [email protected], post-graduate student of the Institute of Organic Chemistry named after N.D.Zelinsky RAS
