CC BY
9
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 543.31 DOI: 10.24412/2071-6176-2022-2-3-11
ИССЛЕДОВАНИЕ КИНЕТИКИ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ РЕДОКС-СОЕДИНЕНИЙ С БАКТЕРИЯМИ PSEUDOMONAS VERONII МЕТОДОМ ЦИКЛИЧЕСКОЙ ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИИ
А.С. Харькова, В.А. Арляпов, Т.В. Лаврова
Методом циклической вольтамперометрии было показано, что в системе «графито-пастовый электрод - бактерии Pseudomonas veronii - медиатор» генерируемый ток имеет диффузионную природу. В рамках модели Николсона-Шайна были определены константы скорости взаимодействия медиаторов электронного транспорта: 1,1'-диметилферроцена, ферроцена, ферроценацетонитрила, ферроценкарбок-сальдегида, 2,5-дибром-1,4-бензохинона с бактериями Pseudomonas veronii. Показано, что среди исследуемых систем наиболее эффективным акцептором электронов является медиатор ферроценкарбоксальдегид (константа взаимодействия составила 40±6 см3/ (г* с)).
Ключевые слова: бактерии Pseudomonas veronii, медиаторы электронного транспорта, модель Николсона-Шайна, циклическая вольтамперометрия.
Введение
На сегодняшний день биосенсорные технологии находят широкое применение в таких областях исследований как мониторинг окружающей среды, клиническая диагностика, безопасность пищевых продуктов, геологоразведочные работы, медицина и т. д. В настоящее время широко используют медиаторные биосенсоры, которые относятся ко второму поколению сенсоров, где перенос электронов на электрод осуществляются с помощью медиаторов электронного транспорта различной природы. Использование медиаторов обеспечивает высокую чувствительность методов, короткое время анализа и возможность миниатюризации биосенсорных систем. Функционирование биосенсорного устройства в значительной степени зависит от типа биорецептора. Чаще всего в качестве биоматериала используют ферменты, антитела, ДНК и т. д., так как они обладают высокой специфичностью к анализируемым веществам. Живые клетки микроорганизмов и их ассоциации находят широкое применение при мониторинге интегральных показателей качества водных сред, например, токсичность, БПК.
В целом, механизм передачи электронов в медиаторном биорецепторе можно представить в виде следующей схемы:
S + Eок ^ P + Евос (1)
Евос + Мок^ Мвос + Еок (2)
Мвос ^ Мок + ne (3)
где S - субстрат - глюкоза; Р — продукт; Еок и Евос — окисленная и восстановленная форма фермента бактерий; Мвос и Мок — восстановленная и окисленная форма медиатора электронного транспорта, ne — число электронов, перенесенных на электрод.
Чтобы повысить чувствительность биорецепторов и минимизировать конкуренцию с растворенным кислородом медиатор электронного транспорта должен обладают высокими значениями константы скорости, соответствующей уравнению (2). Для расчета констант взаимодействия биоматериала и медиатора используют метод циклической вольтамперометрии и математическую модель Николсона и Шайна [1-3]. В работе для бактерий Paracoccus yeei по константам взаимодействия выбран медиатор ферроцен, константа скорости составила 0,023±0,001 дм3/(г*с), что позволило использовать систему «Paracoccus yeei - ферроцен» для оценки токсичности [4]. Более эффективное взаимодействие медиатора с клетками было показано в рецепторном элементе «Gluconobacter oxydans — нейтральный красный», константа взаимодействия составила 1,0±0,4 дм3/(г*с) [5]. Следует отметить эффективность использования медиатора нейтрального красного совместно с клетками эукариот — константа скорости взаимодействия с дрожжами Blastobotrys adeninivorans составила 0,681±0.009 дм3/г*с, что позволило сформировать высокочувствительную систему для оценки БПК5 [6].
В данной работе исследуются особенности электрохимического взаимодействия медиаторов 1,1'-диметилферроцена, ферроцена, ферроценацетонитрила, ферроценкарбоксальдегида, 2,5-дибром-1,4-бензохинона с бактериями Pseudomonas veronii, анализ которых позволит сделать вывод о наиболее эффективном акцепторе электронов для системы «микроорганизм — медиатор — электрод».
Материалы и методы
Реактивы и материалы. Все требуемые реактивы имели степень чистоты х.ч. или ч.д.а.. Для приготовления среды и культивировании бактерий использовали триптон («Sigma», США), дрожжевой экстракт («Oxoid Ltd.», Великобритания), хлорид натрия («Диаэм», Россия). Для изготовления графито-пастовых электродов использовали графитовую пудру («Fluka», Германия), минеральное масло («Fluka», Германия), ацетон («Диаэм», Россия), диализную мембрану («Roth», Германия) (предел пропускания 12 кДа). Для анализа применяли следующие медиаторы: ферроцен («Sigma-Aldrich», Германия), 1,1'-диметилферроцен («Sigma-Aldrich», Германия), ферроценацетонитрил («Sigma-Aldrich», Германия), ферроценкарбальдегид («Sigma-Aldrich», Германия), 2,5-дибром-1,4-бензохинон («Диаэм», Россия). В качестве рабочего электролита
применяли фосфатный калий-натриевый буферный раствор (рН 6,8) (концентрация солей 33 мМ). В роли субстрата использовали глюкозу («AppliChem», Германия).
Культивирование микроорганизмов. В работе использовали бактерии Pseudomonas veronii DSM 11331T (P. veronii) выделены ранее из активного ила [7]. Микроорганизмы выращивали на среде следующего состава: триптон — 10 г/дм3, дрожжевой экстракт — 5 г/дм3, NaCl — 10 г/дм3, дистиллированная вода — 200 см3. Среду для выращивания клеток стерилизовали автоклавированием при давлении в 1,1 атмосфера в течение 45 минут. Клетки выращивали аэробно 18-20 часов при температуре 29 °С. Затем полученную биомассу центрифугировали при комнатной температуре при 10000 об/мин 10 минут. Далее центрифугат промывали 20 мМ фосфатным буфером рН 7,2. Осевшие клетки рассуспендировали в свежей порции буфера, распределяли по порциям и осаждали на центрифуге «Eppendorf» 5 минут при 10000 об/мин. Промытую биомассу взвешивали и хранили в микропробирках при температуре + 4 0С.
Формирование рабочего медиаторного электрода. При использовании растворимых медиаторов рабочий электрод формировали, наполняя приготовленной пастой «графитовая пудра-минеральное масло» пластиковую трубку. Навеску медиатора, равную 0,09 г, растворяли в 500 мкл ацетона. Далее смешивали с 0,1 г графитовой пудры и 40 мкл парафинового масла и заполняли пластиковую трубку. Клетки микроорганизмов смешивали с фосфатным буфером с рН=6,8 в отношении 1:1. Полученную смесь встряхивали в течение 5 минут, затем наносили по 10 мкм два раза на зачищенный графито-пастовый электрод и ждали полного высыхания. В качестве удерживающего материала была использована диализная мембрана, которую закрепляли на конце электрода с помощью пластикового кольца.
Электрохимические измерения. Кинетические измерения проводили на вольтамперометрическом анализаторе «Экотест-ВА» («Эконикс-Эксперт», Москва, Россия): пределы измерения тока 0,2 мкА; 2 мкА; 20 мкА; 200 мкА; 2 мА; скорости развертки от 10 до 50 мВ/сек; поляризующее напряжение от -3 В до +3 В. Управление прибором проводилось с помощью встроенной программы «Экотест-ВА». В качестве вспомогательного использовали платиновый ЭПЛ-02 («Эконикс-эксперт», Россия), а электродом сравнения стал насыщенный хлорид серебряный электрод ЭВЛ-1М4 («Эконикс-эксперт», Россия).
Перед непосредственным измерением в трехэлектродной системе, включающей рабочий углеродно-пастовый электрод, хлорид-серебряный электрод сравнения и вспомогательный платиновый электрод меняли калий-натрий фосфатный буферный раствор с рН = 6,8. Скорость развертки выбирали в диапазоне 10 до 50 мВ/сек. После окончания измерений в систему добавлялось раствора 20 мл глюкозы и при той же
скорости развёртки снимали вольтамперограмму. После снятия двух зависимостей до и после введения глюкозы ячейку перезаполняли буферным раствором и медиатором. Операции повторяли при новой скорости развертки. Для обработки результатов эксперимента пользовались SigmaPlot12.5.
Результаты и их обсуждения
В данной работе исследовали электрохимическое поведение бактерий P. veronii при биокаталитическом окислении глюкозы в присутствии медиаторов электронного транспорта. Бактерии рода Pseudomonas используются для обнаружения фенольных соединений [8], для оценки БПК [7], что определило выбор данного биоматериала для анализа. При определенной скорости развертки фиксировали вольтамперопрограммы для каждого из медиаторов, где был зафиксирован ток в присутствии и отсутствии глюкозы. На рис. 1 представлен пример такой циклической вольтамперограммы биоэлектрода на основе бактерий P. veronii и медиатора 2,5-дибром-1,4-бензохинона. Циклические вольтамперограммы остальных исследуемых электродов имели аналогичный вид.
70 60 50 40 30
1 20 а Ю
£ 0 -10
-20 -30 -40 -50 -60
-100 0 100 200 300 400 500 600
Потенциал, мВ
Рис. 1. Циклическая вольтамперограмма биоэлектрода на основе бактерий P. veronii с медиатором 2,5-дибром-1,4-бензохиноном: 1 - вольтамперограмма с добавлением глюкозы;
2 - вольтамперограмма без глюкозы
Сила предельного анодного тока при добавлении глюкозы увеличивается, что вызвано регенерацией восстановленной формы медиатора через каталитический цикл, что связано с протеканием в присутствии биоматериала и субстрата электрокаталитического процесса, в ходе которого окисленная форма медиатора взаимодействует с восстановленными ферментами, переходя при этом в восстановленную форму. Увеличение концентрации восстановленной формы и уменьшение концентрации окисленной формы вызывает наблюдаемый рост анодного пика.
Согласно схематической модели процесса окисления субстрата ферментами микроорганизмов в присутствии переносчиков электронов, субстрат проникает через мембрану к ферменту и взаимодействует с ним. В результате фермент восстанавливается, и, в свою очередь, отдает электроны молекуле медиатора непосредственно или через определенный сайт дыхательной цепи. Медиатор окисляется на электроде и вступает в новый цикл взаимодействия с ферментными системами биоматериала. Для того, чтобы рассчитать константу скорости взаимодействия медиатора с биоматериалом с использованием модели Николсона-Шайна [1]. Согласно данной модели, предполагается, что циклическая вольтамперограмма биоэлектрода математически можно описать как классическую вольтамперограмму для электрохимического процесса (уравнение 3), осложненного химическими реакциями (уравнение 1-2), а соотношение предельных токов в присутствие и отсутствие глюкозы зависит от константы скорости взаимодействия медиатора и биоматериала (уравнение 2). Указанная модель применима для микробных [4-6] и ферментных электродов [2-3].
Для использования модели Николсона и Шайна необходимо удостовериться, что электрохимический процесс контролируется диффузией [1]. В исследуемых системах зависимость предельного тока от корня скорости развертки линейна, что подтверждает диффузионный характер. При избытке концентрации субстрата и низкой концентрации медиатора (в данном случае скорость биохимической стадии взаимодействия медиатора с биоматериалом имеет псевдопервый порядок) можно использовать уравнение Николсона и Шайна (уравнение 4).
= \к взаим [Е]ЯТ (4)
1Л ^ (4Л
где 1к -предельный ток в присутствие субстрата, ¡а - предельный ток в отсутствие субстрата, кв3аим - константа скорости взаимодействия медиатора и биоматериала, [Е] - концентрация фермента, Я -универсальная газовая постоянная; Т - температура; п - число электронов; ^ - число Фарадея; V - скорость развертки.
Таким образом, тангенс угла наклона линейной регрессии (рис. 2) определяется по формуле (5), что позволяет рассчитать константу скорости взаимодействия бактерий с исследуемым медиатором - квзаим.
1,16 -1,14 -1,12 -1,10 -1,08 -1,06 -1,04 -1,02 -
4 5 6 7 8 9
(1/у)1'2
Рис. 2. Зависимость отношения анодного тока с глюкозой и без глюкозы от обратной величины корня из скорости взаимодействия. Медиатор 2,5-дибром-1,4-бензохинон
Для этого в рамках данной модели полученные отношения предельных анодных токов в присутствие и в отсутствие субстрата линейно зависят от обратной величины корня скорости развертки (рис. 2), зависимость описывается уравнением (4).
к взаим[Е]ю (5)
Была произведена статистическая обработка результатов и найдены константы скорости взаимодействия с исследуемыми медиаторами, результаты представлены в таблице.
Следует отметить, что для медиатора ферроценкарбоксальдегида в рамках данной модели рассматривать нельзя, ввиду низкого коэффициента корреляции анализируемых зависимостей (0,9559) и высокой погрешностью нахождения константы скорости. В целом, можно отметить следующий ряд эффективности медиаторов: 1,1'-диметилферроцен ^ ферроцен ^ ферроценацетонитрил ^ 2,5-дибром-1,4-бензохинон, который подтвердил, что электроноакцепторные заместители повышают активность ферроценового ядра, а электронодонорные снижают их активность. Производные ферроцена из-за своего значения редокс-потенциала, могут забирать электроны на разных стадиях дыхательной цепи микроорганизмов. Заместители циклопентадие-нильного кольца в производных ферроцена могут смещать значения потенциала, и как
следствие активность медиатора. Так, 1,1'-диметилферроцен оказался самым неэффективным медиатором для исследуемых бактерий, что подтверждает, что электродонорные заместители снижают активность медиаторов ферроценнового ядра. Таким образом, наиболее эффективно процесс окисления глюкозы протекает с использованием 2,5-дибром-1,4-бензохинона. В рецепторных системах на основе данного медиатора предполагаются высокие ответы сенсора, а следовательно, высокая чувствительность.
Статистическая обработка результатов анализа и константы взаимодействия медиаторов электронного транспорта с бактериями
Р. уегопи
Медиатор Уравнение линейной зависимости у=ах+Ь Коэффициент корреляции Тангенс угла наклона линейной регрессии Константа, см3/ (г*с)
1,1'- Диметилферроцен у=0,0022х+ 0,9476 0,9790 0,0022± 0,0005 0,20±0,04
Ферроцен у=0,0023х+ 0,9978 0,9880 0,0023± 0,0002 0,20±0,02
Ферроценацето-нитрил у=0,0194х+ 0,9441 0,9759 0,019± 0,004 20±3
2,5-Дибром-1,4-бензохинон у=0,0299х+ 0,9047 0,9883 0,030± 0,005 40±6
Ферроценкарбок-сальдегид у=0,0595х+ 0,7078 0,9559 0,06±0,02 100±50
Работа выполнена в рамках гранта Президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых российских ученых -кандидатов наук, номер гранта № МК-4815.2022.1.4.
Заключение
Определены константы скорости взаимодействия бактерий Р. уегопи с медиаторами электронного транспорта различной природы. В результате наиболее эффективно процесс окисления глюкозы протекает в присутствии 2,5-дибром-1,4-бензохинон (константа взаимодействия составила 40±6 см3/ (г-с)). Полученный ряд значений констант скорости взаимодействия бактерий с исследуемыми медиаторами определяется строением медиатора электронного транспорта, от способности редокс-соединения проникать через клеточные мембраны, значения окислительно-восстановительного потенциала медиаторов и от структуры дыхательных путей микроорганизмов.
Список литературы
1. Nicholson R. S., Sham I. Theory of stationary electrode polarography. Single scan and cyclic methods applied to reversible, irreversible, and kinetic systems //Analytical Chemistry. 1964. V. 36. I. 4. P. 706-723.
2. The Role of the n Acceptor Character of Polypyridine Ligands on the Electrochemical Response of Co (II) Complexes and its Effect on the Homogenous Electron Transfer Rate Constant with the Enzyme Glucose Oxidase / V. Ramrez-Delgado, M. Cruz-Ramirez, L. F. Hernandez-Ayala [et al.] //Journal of the Mexican Chemical Society. 2015. V. 59. I. 4. P. 282-293.
3. Unsubstituted phenothiazine as a superior water-insoluble mediator for oxidases / A. N. Sekretaryova, M. Yu. Vagin, V. Beni [et al.] //Biosensors and Bioelectronics. 2014. V. 53. P. 275-282.
4. A mediator microbial biosensor for assaying general toxicity / A.S. Kharkova, V.A. Arlyapov, A.D. Turovskaya [et al.] // Enzyme and Microbial Technology. 2020. V. 132. № 109435.
5. Исследование переноса заряда в биоэлектрохимических системах на основе бактерий Gluconobacter oxydans методом циклической вольтамперометрии / О.А. Елисеева, А.С. Харькова, В.А. Арляпов [и др.] // Известия Тульского государственного университета. Естественные науки. 2021. Вып. 1. С. 3-12.
6. A kinetic approach to the formation of two-mediator systems for developing microbial biosensors as exemplified by a rapid biochemical oxygen demand assay / A. S. Kharkova, V. A. Arlyapov, A. S. Ilyukhina [et al.] // 3 Biotech. 2021. V. 11. I. 5. P. 1-13.
7. Мeдиаторный БПК-биосенсор на основе клеток микроорганизмов, выделенных из активного ила / А. С. Харькова, В. А. Арляпов, А.Д. Туровская [и др.] // Прикладная биохимия и микробиология. 2019. Т. 55. №. 2. С. 199-208.
8. Screen printed graphite biosensors based on bacterial cells / S. Timur, L. Della Seta, N. Pazarlioglu [et al.] // Process Biochemistry. 2004. V. 39. I. 11. P. 1325-1329.
Харькова Анна Сергеевна, канд. хим. наук, доц., Anyuta_Zaytseva@mail.ru, Россия, Тула, Тульский государственный университет,
Арляпов Вячеслав Алексеевич, канд. хим. наук, доц., ведущий научный сотрудник лаборатории биологически активных соединений и биокомпозитов, v.a.arlyapov@gmail.com, Россия, Тула, Тульский государственный университет,
Лаврова Татьяна Валерьевна, студент, lavrova0000@yandex.ru, Россия, Тульский государственный университет
KINETIC RESEARCH OF THE INTERACTION OF RED-OX COMPOUNDS WITH PSEUDOMONAS VERONII BACTERIA BY
CYCLIC VOLTAMMETRY
A. S. Kharkova, V.A. Arlyapov, T.V. Lavrova
It was shown that in the system "carbon-paste electrode - Pseudomonas veronii bacteria - mediator", the generated current is of a diffusion nature by cyclic voltammetry. Rate constants of interaction 1,1'-dimethylferrocene, ferrocene, ferroceneacetonitrile, ferro-cenecarboxaldehyde, 2,5-dibromo-1,4-benzoquinone mediators with Pseudomonas veronii bacteria were determined by Nicholson-Schein model. It was shown that 2,5-dibromo-1,4-benzoquinone mediator is the most efficient electron acceptor among the studied systems (interaction constant was 40±6 cm3/(g*s)).
Key words: Pseudomonas veronii bacteria, electron transport mediators, Nicholson-Shine model, cyclic voltammetry.
Kharkova Anna Sergeevna, candidate of Chemistry, docent, Anyuta_Zaytseva@mail.ru, Tula, Russia, Tula State University,
Arlyapov Vyacheslav Alekseevich, candidate of Chemistry, docent, leading researcher of Bioactive Compounds and Biocomposites Laboratory, v.a.arlyapov@gmail.com, Tula, Russia, Tula State University,
Lavrova Tatyana Valerievna, lavrova0000@yandex.ru, student, Russia, Tula State University
