ПОТЕНЦИАЛ АССОЦИАЦИИ ДРОЖЖЕЙ BLASTOBOTRYS ADENINIVORANS И БАКТЕРИЙ PARACOCCUS YEEI ДЛЯ ЭКСПРЕСС-МОНИТОРИНГА БИОХИМИЧЕСКОГО ПОТРЕБЛЕНИЯ КИСЛОРОДА Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

УДК 543.31 DOI: 10.24412/2071-6176-2023-1-92-102

ПОТЕНЦИАЛ АССОЦИАЦИИ ДРОЖЖЕЙ BLASTOBOTRYS ADENINIVORANS И БАКТЕРИЙ PARACOCCUS YEEI ДЛЯ ЭКСПРЕСС-МОНИТОРИНГА БИОХИМИЧЕСКОГО ПОТРЕБЛЕНИЯ КИСЛОРОДА

А.С. Харькова, В.А. Арляпов

В работе обсуждается возможность использования ассоциации дрожжей Blastobotrys adeninivorans и бактерий Paracoccus yeei для экспресс-мониторинга индекса биохимического потребления кислорода (БПК). В медиаторной системе на основе ферроцена количество окисляемых субстратов ассоциацией микроорганизмов составляет 12 соединений. Долговременная стабильность - 5 суток, а линейный диапазон измерения БПК5 - от 49 до 290 мг/дм3. Рецепторная система уступает по чувствительности биорецепторам на основе индивидуальных культур и может быть использована для экспресс-мониторинга сточных вод до очистки.

Ключевые слова: бактерии Paracoccus yeei, дрожжи Blastobotrys adeninivorans, медиатор ферроцен, экспресс-мониторинг БПК.

Введение

Для оценки степени загрязнения сточных вод органическими веществами используют индекс биохимического потребления кислорода (БПК) - это количество кислорода, потребляемого микроорганизмами в процессе биодеградации органических веществ, находящихся в 1 дм3 пробы [1]. Стандартный метод определения БПК основан на инкубации пробы в течение 5 суток (БПК5) и измерении разности концентрации растворенного кислорода до и после инкубации. Стандартный анализ не дает возможности оперативно оценить степень загрязненности сточных вод. Для экспресс-мониторинга параметра используют подход, регистрирующий зависимость начальной скорости окисления модельных растворов (например, глюкозы и глутаминовой кислоты) [2-8] от значения БПК5, взятого для анализа раствора.

В качестве инокулята в стандартном методе анализа используют активный ил, речную воду, аквариумную воду [1], поэтому для формирования биорецепторов применяют различные ассоциации микроорганизмов, что позволяет расширить круг окисляемых субстратов, улучшить корреляцию со стандартным методом, увеличить чувствительность биорецепторного элемента [4, 5, 7]. Так в работе [4] биоматериал для биорецептора культивировали из сточной воды (микробный состав не описан, но указано, что 5,65% консорциума составляет бактерии Shewanella loihica PV-4). Диапазон определяемых концентраций БПК5 для биорецептора на основе консорциума составил 0 -65,25 мг02/дм3. Формирование консорциума позволило повысить долю

живых метаболически активных микроорганизмов с 75,2 ± 4,9% (биорецептор на основе индивидуальных бактерий Shewanella loihica PV-4) до 88,0 ± 2,4% в консорциуме. В исследовании [5] разработан биоанод на основе 35 различных видов микроорганизмов. Диапазон определяемых концентраций БПК5 составляет 49 - 723 мг/л.

Проблемы использования популяций с большим числом микроорганизмов для формирования рецепторных элементов связаны с изменением микробного состава рецепторного элемента при воздействии внешних факторов (изменения рН, температуры, контакте с компонентами пробы). В связи с этим классическим подходом к созданию микробных биосенсоров для определения БПК, описанным в целом ряде исследований [2, 3, 6, 8], является использование иммобилизованных клеточных суспензий, микроорганизмы которых обладают широкой субстратной специфичностью. С другой стороны, подход, основанный на использовании искусственно сформированных ассоциаций упрощает процесс стандартизации систем и контроля микробного состава биорецепторов.

Целью настоящей работы являлось исследование возможности совместного использования микроорганизмов Blastobotrys adeninivorans BKM Y-2677 и бактерий Paracoccus yeei ВКМ B-3302 в составе рецепторной системы на основе графито-пастового электрода и медиатора ферроцена для экспресс-оценки индекса БПК5.

Материалы и методы

Реактивы и материалы. Триптон («Panreac», Испания), Пептон («Panreac», Испания), дрожжевой экстракт («Helicon», Россия), хлорид натрия («Диаэм», Россия) использовали для выращивания микроорганизмов. Для создания рабочего графито-пастового электрода применяли графитовую пудру с размером частиц 75 микрон с высокой чистотой 99,997% («Fluka», Германия), парафиновое масло («Fluka», Германия) и диализную мембрану с пределом пропускания 14 кДа («Roth», Германия). В качестве медиатора электронного транспорта использовали ферроцен («Aldrich», Германия). Калий-натрий фосфатный буферный раствор с рН = 6,8 (33 мМ KH2PO4 + 33 mM N2HPO4, «Диаэм», Россия) использовали для работы с микроорганизмами. Глюкозу («Диаэм», Россия) и глутаминовую кислоту («Диаэм», Россия) использовали для приготовления модельного раствора с БПК5 205 мг/дм3.

Микроорганизмы. Бактерии Paracoccus yeei ВКМ В-3302 (P. yeei) и дрожжи Blastobotrys adeninivorans BKM Y-2677 (B. adeninivorans) предоставлены Всероссийской коллекцией микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук - обособленного подразделения ФИЦ ПНЦБИ РАН (г. Пущино).

Культивирование микроорганизмов. Для выращивания микроорганизмов использовали шейкер-инкубатор ES-20/60 («BioSan», Латвия), центрифуги «TG16WS» (Поликом LTD, Россия) и «MiniSpin plus» (Eppendorf, Россия). Для культивирования дрожжей B. adeninivorans использовали среду следующего состава: глюкоза - 1%, пептон - 0,5%, дрожжевой экстракт - 0,05%. Время культивирования составляло 18-20 часов при температуре 28 оС. Центрифугирование проводили при 7000 g в течение 10 мин. Для приготовления суспензии клеток использовали фосфатный буферный раствор рН 6,8. Бактерии P. yeei выращивали в среде Луриа-Бертани: триптон - 1%, NaCl - 1%, дрожжевой экстракт - 0,5%, в течение 24 ч при температуре 28 оС, время центрифугирования 15 мин (9000 g). Для приготовления суспензии клеток использовали фосфатный буферный раствор рН 6,8. Выращенную биомассу индивидуальных культур хранили в микропробирках при температуре минус 25 оС.

Формирование биорецепторного элемента. Пластиковую трубку с площадью рабочей поверхности 6,3 мм2 заполняли пастой «графитовая пудра-минеральное масло» следующего состава: 90 мг графитовой пудры смешивали с 500 мкл раствора ферроцена в ацетоне, 0,02 мг/мкл. После испарения ацетона добавляли 40 мкл парафинового масла и замешивали пасту, затем заполняли пластиковую трубку.

Для иммобилизации ассоциации на рабочем электроде готовили суспензию бактерий P. yeei и B. adeninivorans с суммарным содержанием 330 мг сырого веса/мл соотношение клеток 1:1. Полученную ассоциацию иммобилизовали следующим образом: на рабочую поверхность электрода наносили 10 мкл суспензии и подсушивали при комнатной температуре в течение 15 мин. Для удерживания клеток на поверхности электрода применяли закрепляющую диализную мембрану, которую фиксировали при помощи пластикового кольца.

Биосенсорные измерения. Измерения выполняли с использованием гальванопотенциостата «IPC-micro» («НТФ Вольта», Россия). Для регистрации ответов биосенсора применяли двухэлектродную схему. Рабочим электродом служил графито-пастовый с иммобилизованными клетками бактерий, электродом сравнения - насыщенный хлорсеребряный. Электроды во время измерения погружали в ячейку с раствором рН 6,8. Все измерения проводили при постоянном потенциале 250 мВ. Температура измерения составляла 20 °C, объем ячейки - 5 мл. После установления стабильного уровня тока в ячейку микропипеткой вводили необходимое для получения заданной концентрации количество раствора анализируемого вещества. После каждого измерения производили промывку ячейки буферным раствором.

Обсуждение результатов

Индивидуальные микроорганизмы широко используются при формировании медиаторных биосенсоров для мониторинга БПК5 [2, 3, 6, 8]. Для создания рецепторного элемента на основе ассоциаций были выбраны дрожжи В\а81оЪо1ту8 adeninivorans BKM У-2677 (В. adeninivorans) и микроорганизмы, выделенные из активного ила Paracoccus yeei ВКМ B-3302 (Р. yeei). Солетолерантные дрожжи В. adeninivorans способны окислять широкий спектр органических соединений [9, 10]. В условиях медиаторного электрокатализа бактерии Р. yeei способны окислять широкий спектр органических соединений [3, 7].

При составлении ассоциации для рецепторного элемента БПК-биосенсора необходимо использовать микроорганизмы с разным набором ферментных систем, что способствует расширению спектра окисляемых субстратов. Проведен анализ субстратной специфичности полученных рецепторных элементов на основе сформированной ассоциации и индивидуальных микроорганизмов, входящих в ее состав в электрокаталитических условиях. Для регистрации изменения окислительной активности микроорганизмов использовали медиатор ферроцен, поскольку он обладает наибольшей скоростью передачи электрона на электрод [11] (рис. 1).

120

£ 100 II

«

с. о о Я

о О X ю н

о а

80

60

40

О 20

II

ее се

Г> (Г» 11

1г11т1тЛт1 I

л ее ее ее ее

гл рл рл ро

о о о о о

5 § ё §■ й

<-> .<5 г» % ¡5

и Г •

* 2 £

8 о

о в

я

Й 2

г — к

о

и

Я н О

о

® И о Ш 1-

н В е

>-» о

ю

5 §

I

ГЛ

_ о & &

ё й

1 1

П П

л

к Н ^ ^ к к

Н 2 1 ■ I М х

В. й г1; П п к «

8" о. § § §

в Я Я

а В

11

■ ■

. 1 III

50

н

с

г у

&

м

о я а

Я Си

ее Н

О —

у

к

к

п

о

в =

й

а

^ 2

<

н ч

о

и о к

£ СП

5

•л н ее О Я X и Ш

ее X К со ю (Г*

I

Г ) . *»

я Б. ас1еппигоган$ шр.уееI ■ Д снЗепшгогапз+Р. уее1 Рис. 1. Субстратная специфичность биорецепторов на основе смешанной ассоциации и индивидуальных микроорганизмов Р. уввЬ [3] и В. айвпШуогат [2], из которых составлена ассоциация

При использовании ассоциации и медиатора ферроцена можно зарегистрировать окисление 12 субстратов, что уступает биосенсорам на основе индивидуальных бактерий P. yeei [3] (22 субстрата) и дрожжей B. adeninivorans [2] (16 субстрата). Биорецептор на основе смешанной ассоциации не окисляет фруктозу, ксилозу, лактозу, сорбит, 3-метилбутанол-1, этановую кислоту, тогда как биорецепторы на основе индивидуальных штаммов обладают данной способностью.

Долговременная стабильность рецепторных элементов определяет рекомендуемый срок эксплуатации. Для ассоциации и индивидуальных культур, из которых она сформирована, исследовали динамику аналитических сигналов при ежедневном введении модельного раствора глюкозы и глутаминовой кислоты с конечными концентрациями 150 мг/л каждого компонента, значение БПК5 данного раствора составляет 205 мгО2/дм3 [1].

<

0,8

с.

о 0.6

р

о 0.4

ю

5

5 0,2

0

А

1 н ■ ]

] ! ; г 1 : ,

. [ ] I [

3 4 ВрОШ, сут.

2,5

<

'А

7, 2 £

8 1,5 к '

б и

| 1

а 0,5 с

"Л,

_1 ^ ^—Н^йн

—Т^4**

3

& 2,5

1« 2

К % 1.5

.1 " |

| 0.5

£ о

I

]0 15 20 Время, сут.

Б

25

30

■ день 1 ■ день 2 ■ день 3 ■ день 6

1

В

Г

Рис. 2. Долговременная стабильность биорецепторного элемента на основе: А - ассоциации бактерий Р. уееЬ и дрожжей В. айентюогат; Б - бактерий Р. уее1; В - дрожжей В. айенШуогат. Горизонтальной

линией отмечено падение ответа биосенсора на 50% от максимального значения. Г - Изменение субстратной специфичности

биоэлектрода на основе ассоциации

Долговременная стабильность биорецепторного элемента на основе ассоциации бактерий P. yeei и дрожжей B. adeninivorans составляет 5 суток, что совпадает с долговременной стабильностью биорецепторного элемента на основе дрожжей B. adeninivorans (рис. 2В) и существенно уступает биорецепторному элементу на основе бактерий P. yeei, стабильность которого составляет 22 дня (рис. 2Г). Следует отметить, что у сформированной системы практически нет периода адаптации: ответ биосенсора в первый день составляет не менее 50% от максимального значения. Изменение субстратной специфичности биоэлектрода в ходе хранения электрода между измерениями показывает на сколько стабильна аналитическая система. Для биоэлектрода на основе ассоциации изменение субстратной специфичности при хранении биоэлектрода оценивали с помощью следующих субстратов: глюкоза, лактоза, этанол, глутаминовая кислота, 2-метилпропанол-1. Глюкоза и глутаминовая кислота входят в состав модельного раствора для построения калибровочной зависимости при определении БПК. Этанол окисляют дрожжи B. adeninivorans [2], биорецептор на основе P. yeei к указанному субстрату не чувствителен [3]. Биорецептор на основе P. yeei способен окислять мочевину, в отличие от биорецептора на основе B. adeninivorans. Лактозу способны окислять оба штамма, но ассоциация нечувствительна к данному веществу. Следует отметить, что скорость окисления субстратов меняется: в 1й и 2й день скорость окисления субстратов ассоциацией падает в следующем ряду: этанол>глюкоза>мочевина>глутаминовая кислота, но к шестому дню появляется следующая зависимость: глюкоза>этанол, мочевина>глутами-новая кислота. Вероятно, это связано с изменением состава ассоциации и преобладанием клеток P. yeei в конце измерения.

При разработке БПК-биосенсоров наиболее важной метрологической характеристикой является воспроизводимость, которая характеризует степень близости друг к другу единичных определений, полученных в разных условиях. Для оценки указанного параметра было изготовлено по 5 электродов для исследуемой ассоциации, значения их аналитических сигналов исследовали с помощью раствора глюкозы и глутаминовой кислоты. Для оценки воспроизводимости серий ответов биосенсора была проверена гипотеза о неразличимости дисперсий с помощью статистического критерия F-распределения. Во всех случаях экспериментально найденный F-критерий меньше критического значения 9,3; сформулированная нуль-гипотеза была подтверждена: воспроизводимость ответов, полученных разными электродами одинакова, а их дисперсии попарно однородны. Для оценки значимости различия средних ответов, полученных разными электродами, к каждой выборке попарно был применен модифицированный тест Стьюдента. Сигналы электродов не превышают критического значения и отличаются незначимо. Таким

образом, изготовление рецепторных элементов на основе ассоциации позволяет получать воспроизводимые аналитические сигналы.

Для оценки диапазона определяемых БПК5 для рецепторного элемента на основе ассоциации были получены градуировочные зависимости аналитического сигнала от индекса БПК5 модельного раствора на основе глюкозы и глутаминовой кислоты (рис. 3).

Рис. 3. Зависимость ответа биосенсоров от БПК5, полученная с помощью биорецепторного элемента на основе ассоциации бактерий P. yeei и дрожжей B. adeninivorans: А - полный вид; Б -линейный

участок

В результате обработки полученных зависимостей были найдены линейные диапазоны определения БПК5. Основные характеристики разработанной биорецепторной системы на основе ассоциаций представлены в таблице.

Параметры работы рецепторных элементов на основе ассоциации микроорганизмов и индивидуальных культур

Количество Долговременная Линейный Ссылка

окисляемых стабильность, диапазон

субстратов, сут. БПК5,

шт. мг/дм3

1 2 3 4 5

P. yeei, 12 5 49 - 290 Данная

B. adeninivorans / работа

ферроцен

1 2 3 4 5

B. adeninivorans / 16 5 2,5 _ 21 [2]

Ферроцен

P. yeei / ферроцен 22 22 1,3 _ 200 [3]

Консорциум на основе Shewanella -* _* 49 _ 723 [4]

loihica РУ-4

Консорциум _* _* 0 _ 65,25 [5]

Saccharomyces -* _* 10 _ 220 [6]

cerevisiae /

гексацианноферрат

(III) калия,

менадион

Активный ил/ 24 53 0,01 _ 0,23 [7]

гексацианноферрат

(III) калия

Chromobacterium _* _* 20 _ 225 [8]

violaceum/

гексацианноферрат

(III) калия

_* не определено

Таким образом, рецепторная система на основе ассоциации P. yeei и B. adeninivorans обладает низким биотехнологическим потенциалом для оценки поверхностных вод, значения БПК в которых варьируется в пределах 2-4 мг/дм3. Нижняя граница определяемых концентраций уступает биорецепторным элементам на основе индивидуальных культур и аналогам. Низкая долговременная стабильность аналитической системы ограничивает срок эксплуатации. Однако несмотря на все перечисленные недостатки рецепторная система может быть использована для оперативного мониторинга качества сточных вод городских хозяйственно-бытовых сточных вод, значения БПК5 в которых до очистки может достигать 720 мг/дм3 [12], сточных вод с пищевых производств, где БПК варьируется от 600 до 1100 мг/дм3, для сточных вод мясоперерабатывающих предприятий (10000-15000 мг/дм3), стоков с пивоваренных производств [13].

Заключение

Сформирована рецепторная система на основе смешенной ассоциации бактерий и дрожжей для экспресс-оценки БПК5. Исследованы зависимости аналитического сигнала и изменения характера окисления субстратов в ходе эксплуатации рецепторной системы, что дополняет известные знания и возможности применения ассоциаций в медиаторном

биоэлектрокатализе. Рецепторная система может использоваться для оценки БПК5 сточных вод до очистки (нижняя граница БПК5 составляет 49 мг/дм3). Отсутствие периода адаптации микроорганизмов после изготовления биорецептора позволяет формировать аналитическую систему непосредственно на предприятиях водоочистки.

Работа выполнена в рамках гранта Президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых российских ученых -кандидатов наук, номер гранта № МК-4815.2022.1.4.

Список литературы

1. ПНДФ 14. 1:2:3:4. 123-97. Количественный химический анализ вод. Методика выполнения измерений биохимической потребности в кислороде после n-дней инкубации (БПКполн) в поверхностных пресных, подземных (грунтовых), питьевых, сточных и очищенных сточных водах. -М.: 1997. 25 с.

2. A kinetic approach to the formation of two-mediator systems for developing microbial biosensors as exemplified by a rapid biochemical oxygen demand assay / Kharkova A. S., Arlyapov V.A., Ilyukhina A. [et al.] //3 Biotech. 2021. V. 11. I. 5. PP. 1-13.

3. Мeдиаторный БПК-биосенсор на основе клеток микроорганизмов, выделенных из активного ила / Харькова А. С., Арляпов В. А., Туровская А.Д. [и др.] // Прикладная биохимия и микробиология. 2019. Т. 55. №. 2. С. 199-208.

4. Comparative analysis of microbial fuel cell based biosensors developed with a mixed culture and Shewanella loihica PV-4 and underlying biological mechanism / Yi Y., Xie B., Zhao T., Liu H. [et al.] //Bioresource technology. 2018. V. 265. PP. 415-421.

5. N. Xiao, R. Wu, J.J. Huang, P.R. Selvaganapathy. Anode surface modification regulates biofilm community population and the performance of micro-MFC based biochemical oxygen demand sensor //Chemical Engineering Science. 2020. V. 221. No. 115691.

6. Bacterial cellulose immobilized S. cerevisiae as microbial sensor for rapid BOD detection / Zhao C., Wang G., Sun M. [et al.] //Fibers and Polymers. 2021. V. 22. I. 5. PP. 1208-1217.

7. А.С. Зайцева, В.А. Арляпов, А.Н. Решетилов. Медиаторный биосенсор на основе микроорганизмов активного ила для экспресс-определения низких значений БПК5 // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии им. Ю.А. Овчинникова. 2017. Т. 13. № 1. С. 50-57.

8. A redox mediated UME biosensor using immobilized Chromobacterium violaceum strain R1 for rapid biochemical oxygen demand

measurement / Khor B.H., Ismail A.K., Ahamad R. [et al.] //Electrochimica Acta. 2015. V. 176. PP. 777-783.

9. A yeast co-culture-based biosensor for determination of waste water contamination levels / Yudina N. Y., Arlyapov V.A., Chepurnova M.A. [et al.] // Enzyme and microbial technology. 2015. V. 78. PP. 46-53.

10. Measurement of biodegradable substances using the salt-tolerant yeast Arxula adeninivorans for a microbial sensor immobilized with poly(carbamoyl)sulfonate (PCS). Part II: Application of the novel biosensor to real samples from coastal and island regions / Chan C., Lehmann M., Tag K. [et al.] // Biosens Bioelectron. 1999. V.14. I. 3. PP. 295-302.

11. A mediator microbial biosensor for assaying general toxicity / Kharkova A. S., Arlyapov V. A., Turovskaya A.D. [et al.] // Enzyme and microbial technology. 2020. V. 132. № 109435.

12. Голод Ю. В., Дубенок С. А. Условия формирования хозяйственно-бытовых сточных вод, поступающих в централизованные сети канализации населенных пунктов республики Беларусь // Сахаровские чтения 2020 года: экологические проблемы XXI века. 2020. С. 356-359.

13. Кулаков А. Ю., Головатый С. Е. Разработка критериев оценки и требований к локальной очистке производственных сточных вод пищевой промышленности республики Беларусь // Сахаровские чтения 2019 года: экологические проблемы XXI века. 2019. С. 57-60.

Харькова Анна Сергеевна, канд. хим. наук, доцент, Anyuta_Zaytseva@mail.ru, Россия, Тула, Тульский государственный университет,

Арляпов Вячеслав Алексеевич, док. тех. наук, доц., ведущий научный сотрудник лаборатории биологически активных соединений и биокомпозитов, v.a.arlyapov@gmail.com, Россия, Тула, Тульский государственный университет

POTENTIAL OF THE BLASTOBOTRYS ADENINIVORANS YEAST AND PARACOCCUS YEEI BACTERIA ASSOCIATION FOR RAPID BIOCHEMICAL

OXYGEN DEMAND MONITORING

A. S. Kharkova, V.A. Arlyapov

The possibility of using the Blastobotrys adeninivorans yeast and Paracoccus yeei bacteria association for rapid biochemical oxygen demand (BOD) index monitoring was discussed. The number of oxidizable substrates in the presence of the ferrocene mediator is 12 compounds. Long-term stability is 5 days, and the linear BOD5 measurement range is from 49 to 290 mg/dm3. The receptor system is inferior in sensitivity to bioreceptors based on individual cultures and can be used for express monitoring of wastewater before treatment.

Key words: Paracoccus yeei bacteria, Blastobotrys adeninivorans yeast, ferrocene mediator, rapid BOD monitoring.

Kharkova Anna Sergeevna, candidate of Chemistry, docent, Anyuta_Zaytseva@mail.ru, Tula, Russia, Tula State University;

Arlyapov Vyacheslav Alekseevich, doctor of technical science, docent, leading

researcher of Bioactive Compounds and Biocomposites Laboratory, v.a.arlya-pov@gmail.com, Tula, Russia, Tula State University