CC BY
22
УДК 602.4:628.35:664 DOI: 10.24412/2071-6176-2023-1-58-68
КОМПОЗИТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ НА ОСНОВЕ ПОЛИАНИЛИНА В КОНСТРУКЦИИ БИОСЕНСОРОВ
Л.С. Кузнецова, К.Д. Чайка, А.С. Харькова, В.А. Арляпов
Для создания амперометрического безреагентного биосенсора для определения глюкозы использовали электрополимеризованный анилин в составе композитных проводящих полимеров, содержащих терморасширенный графит или углеродные нано-трубки. Электрохимические характеристики модифицированных электродов изучали методом циклической вольтамперометрии. Наиболее эффективный состав композитного проводящего полимера, содержащего полианилини терморасширенный графит, позволяет проводить анализ содержания глюкозы в диапазоне 0,4 - 1,4 ммоль/дм3, с пределом обнаружения 0,12 ммоль/дм3.
Ключевые слова: проводящие полимеры, полианилин, одностенные углеродные нанотрубки, терморасширенный графит, биосенсор, глюкозооксидаза.
Введение
На сегодняшний день биосенсорные технологии быстро развиваются и играют важную роль в области клинического анализа, фармацевтики, пищевой промышленности и мониторинга окружающей среды [1]. Интересными и перспективными материалами для модификации поверхности электродов являются композиты с использованием проводящих полимеров и наноматериалов [2]. Проводящие полимеры могут быть использованы в качестве иммобилизующей матрицы для биоматериала, которая параллельно может выполнять функции проводника электронного транспорта. Проводящие полимеры обладают биосовместимостью, позволяют создавать на своей основе безреагентные биосенсоры и потому интересны для использования в конструкции биосенсора [3]. Среди полимеров, применяющихся для создания электрохимических систем биосенсорных датчиков и биотопливных элементов можно выделить полианилин. Структуры на основе полианилина, благодаря их полезным свойствам, таким как устойчивость к воздействию окружающей среды, настраиваемая проводимость, большая площадь поверхности и окислительно-восстановительные свойства, достаточно широко применяются в конструкции биосенсоров для определения глюкозы. Так, композит на основе полианилин-монтмориллонита с включением наночастиц платины использовали для создания высокоселективного и стабильного глюкозного биосенсора [4]. Биосенсор продемонстрировал отличную долговременную стабильность в течение двух месяцев и был успешно применен для определения уровня глюкозы в сыворотке крови человека. Полианилин также эффективно может работать в гибридных композитах, например, с полидифенилами-
ном [5]. Синергетическое взаимодействие составляющих гибридного композита обеспечивают усиленный перенос электронов для осуществеления процесса окисления глюкозы. Следует отметить, что на проводимость полианилина сильно влияет pH раствора, он показывает более высокую проводимость в кислых растворах и более низкую проводимость в нейтральном растворе [6]. Биосенсоры на основе фермента глюкозооксидазы помимо применения для определения содержания глюкозы являются модельными образцами для сравнения подходов к формированию рецепторных систем, которые потом можно применять в широком спектре каталитических биосенсоров для оценки других показателей. В предыдущих работах нами показана возможность успешного использования наноматериалов в составе биосенсоров и их положительного влияния на характеристики электродов [7, 8, 9].
В настоящей работе изучали влияние углеродных материалов на примере углеродных нанотрубок и терморасширенного графита в композитных матрицах, содержащих электрохимически полимеризо-ванный анилин, на характеристики и параметры амперометрического глюкозного биосенсора.
Реагенты и оборудование. В работе использовали фермент глюкозооксидазу (ГО) (Sigma-Aldrich, США) (удельная активность 15 Е/мл). В качестве основы проводящей матрицы использовали: анилин («Диаэм», Россия). Для проведения биосенсорных измерений использовали натрий-калий фосфатный буферный раствор с рН 6,8 (33 мМ KH2PO4 и 33 мМ N2HPO4, «Диаэм», Россия).
Электрохимическая полимеризация анилина на поверхности рабочего электрода. Анилин электрохимически полимеризовали путем циклического изменения приложенного потенциала от -0,1 до +0,9 В относительно электрода сравнения (Ag/AgCl) при скорости сканирования 20 мВ/с в течение 10 циклов в растворе, содержащем 0,1 М анилина в 0,1М растворе HCl. Структура получаемого проводящего полимера представлена на рис. 1.
Рис. 1. Структура полианилина, полученного электрохимической
полимеризацией
Материалы и методы
В зависимости от степени окисления выделяют 3 основные формы полианилина [10]: у=0 - полностью окисленная форма полианилина -пернигранилин, у=1 - полностью восстановленная форма полианилина -лейкоэмеральдин, у=0,5 - форма полианилина с соотношением окисленных и восстановленных фрагментов равным 1:1 - эмеральдин. Данные формы полианилина могут вступать в кислотно-основные реакции и существовать как в виде соли, так и в виде основания.
Формирование композитных материалов на основе полианилина. Для модификации электродов углеродными нанотрубками на поверхность рабочего электрода наносили 1 мкл суспензии однос-тенных углеродных нанотрубок (длина углеродных нанотрубок составляла 1-10 мкм, средний диаметр 1,5 нм, внешняя удельная поверхность была равна 450 м2/г, ООО «Углерод Чг», Россия) и оставляли до полного высыхания. Слой терморасширенного графита толщиной 0,1 мм и диаметром 3 мм был сформирован на рабочей поверхности графитового печатного электрода при давлении 150 бар. Плотность полученного слоя терморасширенного графита составляла 16 г/л. На поверхности графитовых печатных электродов, модифицированных терморасширенным графитом и углеродными нанотрубками проводили электрохимическую полимеризацию анилина, после чего электроды промывали натрий-калиевым фосфатным буферным раствором (рН=6,8) и высушивали.
Формирование рабочих электродов на основе полианилина и композитных материалов на его основе. На высушенную поверхность модифицированного полианилином и его композитами электродов наносили 3 мкл фермента глюкозооксидазы и оставляли до полного высыхания. Сверху наносили 3 мкл смеси, состоящей из 0,0035 г бычьего сывороточного альбумина, 50 мкл натрий-калиевого фосфатного буферного раствора (рН=6,8) и 7,5 мкл глутарового альдегида, и оставляли сушиться до полного высыхания.
Электрохимические измерения. Для электрохимических измерений использовали потенциостат EmStat («PalmSens», Нидерланды). В работе использовали графитовые печатные электроды (ГПЭ) (ООО «Русенс», Россия), выполненные по трехэлектродной схеме (рис. 2).
тсрмо расширенный графит/углеродные нанотрубки
Рис. 2. Схема используемого трехэлектродного графитового печатного электрода и биосенсорной установки для определения глюкозы
Измерения проводили в калий-натрий-фосфатном буферном растворе с рН 6,8 при 22 °С. Объем ячейки составлял 4 мл. Перемешивание осуществляли магнитной мешалкой (ЗАО "Экрос", Россия) со скоростью 200 об/мин. Циклические вольтамперограммы регистрировали при скорости развертки потенциала 20-200 мВ/с. Измеряемым параметром (откликом биосенсора) в режиме амперометрии являлась амплитуда выходного сигнала биосенсора при добавлении субстрата. После каждого измерения электрод трехкратно промывали буферным раствором.
Обсуждение результатов
Для получения проводящих полимеров в качестве мономеров использовали анилин, характеризующийся устойчивостью при электрополимеризации [11], нетоксичностью и биосовместимостью для живых систем [4], [2]. Для формирования композитных материалов использовали одностенные углеродные нанотрубки и терморасширенный графит. Углеродные нанотрубки являются одним из наиболее часто используемых типов углеродных наноматериалов благодаря своей высокой проводимости [9], модификация поверхности графитовых печатных электродов широким спектром углеродных наноматериалов (одностенные и многостенные углеродные нанотрубки с разной функционализацией) с различными параметрами позволяет значительно повысить чувствительность создаваемых датчиков [6]. Терморасширенный графит как углеродный материал обладает большой площадью поверхности по сравнению с обычным графитом, что позволяет использовать его в биосенсорах для повышения чувствительности и рабочего диапазона. По сравнению с другими наполнителями на основе углерода, такими как углеродные нанотрубки и нановолокна, преимуществами терморасширенного графита является его низкая стоимость и технологичность [5]. Ранее описано
применение терморасширенного графита при создании биосенсоров для определения этанола [12], аскорбиновой кислоты [13], пропионового альдегида [14].
На циклической вольтамперограмме показаны типичные пики для полианилина после полимеризации при скорости развертки 20 мВ/с (рис. 3).
25.00 20.00 15.00 10.00 5.00
<
а 0.00
* -5.00 с к
I -10.00 и
-15.00
-20.00 т
-0.100 0.000 0.100 0.200 0.300 0.400 0.500 0.600
Потенциал, В
Рис. 3. Типичный вид циклической вольтамперограммы для электродов, модифицированных полианилином и его композитами
Анодный пик в области ~0,15 В, соответствует переходу полианилина из восстановленной формы лейкоэмеральдина в эмераль-диновую катион-радикальную форму. Это свидетельствует о присутствии данных фрагментов в составе продукта полимеризации и подтверждает их определяющий вклад в его реакционную способность в окислительно-восстановительных взаимодействиях.
Наличие протонированного полианилина-эмеральдина, доказано методом ИК-спектроскопии. Для него (рис. 4) характерны полосы при 1605 см-1, соответствующая хиноидным колебаниям С=С, при 1499 см-1, соответствующая С=С бензоидным колебаниям, при 1306 см-1, соответствующая поглощению связи С-№, при 1248 см-1 соответствующая валентным колебаниям С-Ы+', при 1128 см-1, соответствующая валентным колебаниям С=КН+', при 822 см-1 внеплоскостным деформационным колебаниям С-Н бензоидных колец.
и
к =
я ь;
о >>
с о о. С
Частота, 1/см
Рис. 4. ИК-спектр полианилина
В рамках исследования были сформированы матрицы для модификации поверхности печатных электродов на основе полианилина и его композитов с углеродными материалами: терморасгиренным графитом и углеродными нанотрубками. Принципиальная схема работы такой системы заключается в реакции проводящей матрицы с восстановленным ферментом с последующим переносом электронов к поверхности электрода (рис. 5). При этом наноматериал значительно увеличивает площадь контакта ГО с проводящим полимером, увеличивает общую проводимость системы и способствует прочному удерживанию ГО на поверхности.
Рис. 5. Строение электродов, модифицированных композитными
материалами на основе проводящего полимера полианилина с: А - терморасширенным графитом, Б -углеродными нанотрубками
Для разработанных матриц было проведено исследование электрохимических свойств методом циклической вольтамперометрии. По зависимости анодного пика от скорости развертки определили лимитирующую стадию электрохимических процессов в сформированных матрицах. Выявление лимитирующей стадии позволило применить модель Лавирона [15] (уравнение 1) для нахождения гетерогенных констант скорости переноса электронов на электрод. Использование модели Лавирона при определении электрохимических свойств проводящих и редокс-активных полимеров можно найти в работах [16] и [17] соответственно:
logk) = a log(1 - а) + (1 - а) log а - log(-^) -а(1 , (1)
nFv 2.3RT
где kg- гетерогенная константа скорости электрохимической системы (с-1см); F - число Фарадея (Кл/моль); v- скорость развертки потенциала (В/с); R - универсальная газовая постоянная (Джмоль/K); Т- температура (K); а - коэффициент переноса катодного процесса; (1 - а) - коэффициент переноса анодного процесса; ДЕ - разность потенциалов анодного и катодного пиков (В).
Гетерогенные константы скорости для матиц на основе полианилина, полианилина с терморасширенным графитом и полианилином с углеродными нанотрубками составили 0,46±0,06 с-1см, 0,57±0,09 с-1см и 0,55±0,07 с-1см, соответственно. Наибольшую гетерогенную константу скорости переноса электронов имеет композитная матрица на основе терморасширенного графита, который существенно увеличивает площадь контакта проводящего полимера с электродом.
Для определения константы скорости взаимодействия полианилина и композитных материалов на его основе с активным центром фермента глюкозооксидазы применяли метод циклической вольтамперометрии и моделирование Николсона-Шайна для данных систем (2) [18]:
Ik
k e3auJEW
п¥У ' (2)
где Iк- предельный ток в присутствии субстрата, мкА; предельный ток в отсутствии субстрата, мкА; квзаим - константа скорости взаимодействия медиатора и биоматериала; [Е] - концентрация фермента, мг/л; Я -универсальная газовая постоянная, Дж/(моль К); Т - температура, К; п -количество перенесенных электронов; Е - постоянная Фарадея, Кл/моль; V - скорость развертки, В/с.
С точки зрения взаимодействия полученных композитных матриц с глюкозооксидазой можно отметить, что внедрение углеродных материалов практически не изменяет константу взаимодействия композитов с глюкозооксидазой: все три матрицы характеризуются значением константы 0,1±0,01 см3/(моль*с), что говорит о том, что с активным центром ГО взаимодействует именно полианилин.
Оценка практической применимости сформированных композитов и получение аналитических и метрологических характеристик проводилась с построением градуировочных зависимостей ответа биосенсоров от концентрации глюкозы (таблица). Зависимости были аппроксимированы по уравнению Михаэлиса-Ментен (3):
V_ ' тах
Км + [3]' (3)
где Ушах - максимальная скорость ферментативной реакции, при которой все молекулы фермента участвуют в образовании фермент-субстратного комплекса, достигается при Км - эффективная константа
Михаэлиса, численно равная концентрации субстрата, при которой скорость ферментативной реакции достигает половины максимального значения(У=Ушах/2); У - скорость реакции; [Б] - концентрация субстрата, моль/дм3.
В таблице представлено сравнение основных характеристик разработанных биосенсоров.
Сравнение аналитических и метрологических характеристик разработанных биосенсоров с аналогами
Проводящая матрица Диапазон определяемых концентраций, ммоль/дм3 Коэффициент чувствительности, нА*дм3/ ммоль Предел обнаружения (Сшт), ммоль/дм3 Время единичного измерения, мин
Полианилин 0,5 - 0,72 11±1 0,15 1-2
Полианилин - терморасширенный графит 0,4 - 1,4 23±5 0,12 1-2
Полианилин - углеродные нанотрубки 1,5 - 2,1 17±2 0,23 1-2
Бычий сывороточный альбумин, ковалентно связанный с ферроценом и нанотруб-ками [7] 0,1 - 1,8 330±10 - 1-3
Проводящий гидрогель на основе золь-геля и нанотрубок [9] 0,045 - 1,04 1480±30 - 1-3
Полученный в ходе работы электрод, модифицированный композитом на основе полианилина и терморасширенного графита обладает самой высокой чувствительностью. Он не уступает аналогам в широте диапазона определяемых концентраций, однако, отличается
сравнительно низкой чувствительностью по сравнению с аналогами, что связано, предположительно с тем, что полианилин проявляет максимальную окислительную способность при pH<7 [19]. Апробация биосенсора на основе композитного материала, содержащего полианилин и терморасширенный графит, проведена на пяти образцах крови. Результаты сравнивали со значениями, полученными с использованием глюкометра OneTouchSelect (LifeSkan Inc. (Johnson and Johnson), США). Статистическая обработка (модифицированный тест Стьюдента) полученных результатов показала, что данные обоих методов незначимо отличаются. Разработанный биосенсор можно эффективно использовать в качестве альтернативы стандартному методу анализа.
Заключение
Анализируя значения кинетических констант и метрологических характеристик, биосенсор с матрицей на основе проводящего композита полианилина и терморасширенного графита выявлен как наиболее перспективный и подходящий для дальнейшего использования в составе безреагентных медиаторных биосенсоров. Статистический анализ не выявил отклонений результатов, полученных с помощью биосенсора и референтного метода. Таким образом, разработанный биосенсор может быть использован в клинических исследованиях для быстрого и точного измерения уровня глюкозы в крови.
Работа выполнена в рамках гранта Президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых российских ученых -кандидатов наук, номер гранта № МК-4815.2022.1.4.
Список литературы
1. Covalent organic frameworks (COFs)-based biosensors for the assay of disease biomarkers with clinical applications / L. Wang, H. Xie, Y. Lin [et al.] // Biosensors and Bioelectronics. 2022. P. 114668
2. Idumah C.I. Novel trends in conductive polymeric nanocomposites, and bionanocomposites // Synth. Metals. 2021. V. 273. P. 116674.
3. Rehman A., Zeng X. Interfacial composition, structure, and properties of ionic liquids and conductive polymers for the construction of chemical sensors and biosensors: a perspective // Curr. Opin. Electrochem. 2020. Т. 23. № April. P. 47-56.
4. Highly selective and stable glucose biosensor based on incorporation of platinum nanoparticles into polyaniline-montmorillonite hybrid composites/ H. Zheng, M. Liu, Z. Yan, J Chen [et al.] // Microchem. J., 2020. V. 152. P. 104266.
5. Muthusankar E., Ragupathy D. Graphene/Poly(aniline-co-diphenylamine) nanohybrid for ultrasensitive electrochemical glucose sensor // Nano-Structures and Nano-Objects. 2019. V. 20. P.100390
6. Sulfonated polyaniline network grafted multi-wall carbon nanotubes for enzyme immobilization, direct electrochemistry and biosensing of glucose/ K.-P. Lee, S.Komathi, N. J. Nam [et al.] // Microchem. J. 2010. V. 95. №. 1. P. 74-79.
7. A Hybrid Redox-Active Polymer Based on Bovine Serum Albumin, Ferrocene, Carboxylated Carbon Nanotubes, and Glucose Oxidase / V.A. Arlyapov, A.S. Khar'kova, T.N. Abramova [et al.]// J. Anal. Chem. 2020. Т. 75. № 9. P. 1189-1200.
8. Use of biocompatible redox-active polymers based on carbon nanotubes and modified organic matrices for development of a highly sensitive BOD biosensor / V.A. Arlyapov, A.S. Kharkova, S.K. Kurbanaliyeva [et al.] // Enzyme Microb. Technol. 2021. Т. 143. С. 109706.
9. Glucose biosensor based on screen-printed electrode modified with silicone sol-gel conducting matrix containing carbon nanotubes / O.A. Kamanina, S.S. Kamanin, A.S. Kharkova [et al.] // 3 Biotech. 2019. Т. 9. № 7. С. 290.
10. Анализ ЯМР-спектров некоторых ароматических полиаминов / С.В. Осадченко, Я.О. Межуев, А.Р. Долотков [и др.] // Успехи в химии и технической технологии. Том XXVI. 2012. № 4 (133).
11. Electrochemical preparation and electrical characterization of polyaniline as a sensitive biosensor/ H.H. Hamid, M.E. Harb, A.M. Elshaer [и др.] // Microsyst. Technol. 2018. V. 24. № 4. P. 1775-1781.
12. А.Н. Решетилов, Ю.В. Плеханова, С.Е. Тарасов. Влияние некоторых углеродных наноматериалов на окисление этилового спирта бактериальными клетками Gluconobacter oxydans // Прикладная биохимия и микробиология. 2017. T. 53. № 1. C. 115-122.
13. P. Ramesh, S. Sampath. Electrochemical and spectroscopic characterization of quinone functionalized exfoliated graphite // Analyst. 2001. V. 126. № 11. P. 1872-1877.
14. Potentialities of expanded natural graphite as a new transducer for NAD+-dependent dehydrogenase amperometric biosensors //C. Calas-Blanchard, T. Noguer, M. Comtat [et al.] // Anal. Chim. Acta. 2003. V. 484. № 1. P. 25-31.
15. Laviron E. Electroanal. Chem. Interfacial Electrochem. 1974, 52, 395-402; b) E. Laviron // J. Electroanal. Chem. 1979. V. 100. P. 263-270.
16. Coutinho I., Fortunato E. A Simple Procedure to Fabricate Paper Biosensor and Its Applicability—NADH/NAD+ Redox System // J. Pharm. Pharmacol. 2018.
17. J. de Fatima Giarola, V. Mano, A.C. Pereira. Development and application of a voltammetric biosensor based on Polypyrrole/uricase/graphene
for uric acid determination // Electroanalysis. Wiley Online Library. 2018. V. 30. № 1. P. 119-127.
18. Nicholson R.S., Sham I. Theory of stationary electrode polarography. Single scan and cyclic methods applied to reversible, irreversible, and kinetic systems. // Anal. Chem. ACS Publications, 1964. V. 36. № 4. P. 706-723.
19. Sensors based on conductive polymers and their composites / Y. Wang, A. Liu, Y. Han [et al.] // Polym. Int. 2020. V. 69. № 1. P. 7-17.
Кузнецова Любовь Сергеевна, мл. науч. сотр. лаборатории биологических соединений и биокомпозитов, l. s. latunina@,gmail. com, Россия, Тула, Тульский государственный университет,
Чайка Кристина Данииловна, мл. науч. сотр. лаборатории биологических соединений и биокомпозитов, krictina5 78@gmail. com, Россия, Тула, Тульский государственный университет,
Харькова Анна Сергеевна, канд. хим. наук, доц., Anyuta_Zaytseva@mail.ru, Россия, Тула, Тульский государственный университет,
Арляпов Вячеслав Алексеевич, д-р. техн. наук, доц., вед. науч. сотр. лаборатории биологически активных соединений и биокомпозитов, v.a.arlyapov@gmail.com, Россия, Тула, Тульский государственный университет
HYBRID MATERIALS BASED ONPOLYANILINE IN THE DESIGN OF
BIOSENSORS
L.S. Kuznetsova, K.D. Chaika, A.S. Kharkova, V.A. Arlyapov
To create an amperometric reagentless biosensor for glucose determination, electro-polymerized aniline was used as part of composite conductive polymers containing thermally expanded graphite and carbon nanotubes. The electrochemical characteristics of the modified electrodes were studied by cyclic voltammetry. The most effective composition of a composite conductive polymer containing polyaniline and thermally expanded graphite allows the analysis of glucose content in the range of 0,4-1,4 mmol/dm3, with a detection limit of 0,12 mmol/dm3.
Keywords: conductive polymers; polyaniline; single-walled carbon nanotubes, thermally expanded graphite, biosensor, glucose oxidase.
Kuznetsova Lyubov Sergeevna, junior researcher of the laboratory of environmental and medical biotechnology, l.s.latunina@,gmail. com, Russia, Tula, Tula State University,
Chaika Kristina Daniiovna, junior researcher of the laboratory of environmental and medical biotechnology, krictina578@gmail.com, Russia, Tula, Tula State University,
Kharkova Anna Sergeevna, candidate of Chemistry, docent, Anyuta_Zaytseva@mail.ru, Tula, Russia, Tula State University,
Arlyapov Vyacheslav Alekseevich, Doctor of Technical Sciences, docent, leading researcher of Bioactive Compounds and Biocomposites Laboratory, v.a.arlyapov@gmail.com, Tula, Russia, Tula State University
