CC BY
50
УДК 543.55:579.222.2
РАЗРАБОТКА ЭЛЕКТРОПРОВОДЯЩЕГО ГИДРОГЕЛЯ НА ОСНОВЕ ХИТОЗАНА И МЕДИАТОРА ЭЛЕКТРОННОГО ТРАНСПОРТА ФЕРРОЦЕНКАРБОКСАЛЬДЕГИДА
А.Д. Андреева, А.С. Харькова, В.А. Арляпов
Разработан биосенсор на основе графитового печатного электрода, состоящий из хитозана, модифицированного медиатором ферроценкарбоксальдегидом, в присутствии фермента глюкозооксидазы. Структуру полученной модифицированной плёнки изучали методом ИК-спектроскопии. Определены основные аналитические характеристики полученного биосенсора: линейный диапазон определяемых концентраций глюкозы для разработанной системы составил 0,25-3,1 мМ, чувствительность -2930±50 нА^дм3. Разработанный биосенсор перспективен в использовании для определения глюкозы в клинической диагностике.
Ключевые слова: биосенсор, хитозан, ферроценкарбоксальдегид, проводящие гидрогели.
Введение
В настоящее время наибольшее значение среди амперометрических биосенсоров имеют устройства с медиаторным переносом электронов с активного центра фермента на электрод с помощью низкомолекулярного переносчика и безмедиаторным переносом электронов от активного центра фермента на электрод. Наиболее универсальным современным подходом для решения задачи, связанной с сопряжением ферментов с преобразователем сигнала является создание электропроводящих гидрогелей. Полимеры, способные к образованию проводящих гидрогелей, представляют собой сложную структуру, состоящую из молекул электроактивных соединений, ковалентно связанных с полимерной основой, которая может обладать или не обладать электропроводностью.
Молекулы электропроводящих полимеров характеризуются большой молекулярной массой, а использование гидрогеля на их основе при создании биокатализатора позволяет им одновременно контактировать с поверхностью электрода и биологическим материалом, и таким образом, отпадает необходимость передвижения медиатора в системе.
Хитозан представляет собой биополимер, состоящий из ß-D-глюкозаминовых звеньев и ^ацетил^-глюкозамина [1]. Он обладает уникальными физико-химическими характеристиками, такими как отличная способность к образованию мембран, хорошая биосовместимость, высокая проницаемость для воды, нетоксичность, высокая механическая прочность и легкость химической модификации [1, 2]. Благодаря этим уникальной свойствам данный полимер широко
изучается в качестве матрицы для иммобилизации биоматериалов при создании биосенсоров [3-5].
Электропроводящие системы, в состав которых входит хитозан, отличаются быстрым временем отклика, высокой воспроизводимостью, а сам полимер обеспечивает закрепление биоматериала и прочную сшивку за счёт большого количества функциональных групп [6]. Матрицы на основе хитозана имеют очень низкую эффективность переноса электронов [7, 8]. Для улучшения условий обмена электронами между активным центром фермента и электродом в сенсорную систему вводят специальные диффузионно-подвижные низкомолекулярные вещества, которые служат переносчиками электронов, называемые медиаторами [9].
Среди большого количества окислительно-восстановительных медиаторных систем ферроцен и его производные обладают наилучшими характеристиками, а именно: низкие молекулярные массы, быстрый перенос электронов и отклик на электроактивные вещества, стабильность в окисленной и восстановленной формах [10-12].
Целью работы является создание электропроводящего гидрогеля на основе хитозана и медиатора электронного транспорта ферроценкарбоксальдегида.
Материалы и методы
Формирование хитозановой матрицы модифицированной ферроценкарбоксальдегидом. Для получения рецепторного элемента 100 мг хитозана растворяли в 10 мл 3 % уксусной кислоты. Полученный раствор перемешивали с раствором 10 мг ферроценкарбоксальдегида в 7 мл ацетона. Смесь перемешивали в течение 2 часов и затем добавляли 2 мл 0,7 М №ВН при перемешивании. Реакционную смесь перемешивали в течении 4 часов и модифицированный полимер осаждали раствором 50 х 10-3 М №ОН пока рН не станет 10. Осажденный полимер центрифугировали, промывали С2Н5ОН и оставляли сушиться в сушильном шкафу. Полученный полимер растворяли в небольшом количестве уксусной кислоты (около 100 мкл) и добавляли 10 мкл глутарового альдегида.
Формирование рабочего электрода. Формирование осуществлялось с помощью нанесения на рабочую часть печатного графитового электрода 3 мкл рецепторного элемента. Затем электрод оставляли сушиться на 20-30 минут до полного высыхания. Перед использованием электрод промывали в буферном растворе в течение 5-10 минут.
Биосенсорные измерения. Сигнал регистрировался с помощью печатного графитового электрода, на поверхности которого располагался рецепторный элемент. В качестве преобразователя использовали потенциостат EmStat (PalmSens, Нидерланды). Объем кюветы составил 4
см3; натрий-калиевый фосфатный буфер рН=6,8; перемешивание магнитной мешалкой 200 об/мин; ввод пробы осуществляли автоматическими микропипетками переменного объема: 5-50 мкл, 20-200 мкл («Ленпипет», Россия). Ответом биосенсора являлась амплитуда изменения выходного сигнала биосенсора при добавлении глюкозы. После каждого измерения осуществлялась промывка кюветы с электродом буферным раствором в течение 5-7 минут.
Результаты и их обсуждения
В процессе разработки биосенсорного элемента для определения глюкозы использовались: хитозан - полимер, который обеспечивал крепкое закрепление биоматериала в матрице, сохраняя его свойства и отличающийся отличной биосовместимостью; глюкозооксидаза - фермент, катализирующий окисление глюкозы и ферроценкарбоксальдегид как медиатор электронного переноса. Схема реакций получения хитозановой плёнки модифицированной ферроценкарбоксальдегидом представлена на рис. 1.
СН2ОН
ж
СН2ОН
СН2ОН
кн.
кнсосн
сн2он
3
ад
сн2он
Fe
сн2он
I
КаВн4
сн2он о
сн2он
I
-о
Рис. 1. Схема взаимодействия хитозана с ферроценкарбоксальдегидом в присутствии ШЕН
Структуру полученной модифицированной ферроцен-карбальдегидом хитозановой плёнки изучали с помощью ИК-спектроскопии (рис. 2).
Г
_V
500 ^ 1000 1500 2000 1 2500 ' 1 3000 ' ' Э500 '
Волновое число, см"1
Рис. 2. ИК-спектр хитозана модифицированного ферроценкарбоксальдегидом
На данном спектре отчётливо видна полоса поглощения, равная 1634 см-1, характерная амидной полосе хитозана. Также, имеется полоса поглощения, равная 869,2 см-1. Данная полоса имеет наибольшее значение, так как она указывает на наличие ферроценилов в полученной плёнке, что подтверждает образование сшивки между хитозаном и ферроценкарбоксальдегидом [13].
Для графитового печатного электрода на основе модифицированного ферроценкарбоксальдегидом хитозана была снята циклическая вольтамперная зависимость при скорости развёртки 0,2 В/с (рис. 3). Показано, что полученный проводящий гель способен к обратимому окислению-восстановлению. Дальнейшие измерения с полученным гидрогелем производились при потенциале равном +0,37 В, соответствующем анодному пику вольтамперограммы.
Для определения диапазона определяемых концентраций разработанного электрода была построена градуировочная зависимость ответа биосенсора от концентрации глюкозы в измерительной кювете (рис. 4).
Показанная выше градуировочная зависимость описывается уравнением Михаэлиса-Ментен. Для определения эффективности биосенсора была проведена оценка чувствительности биосенсора и найден коэффициент чувствительности, как тангенс угла наклона градуировочной прямой в координатах ответ сенсора - концентрация субстрата. Оценку чувствительности также проводили по значению нижней границы определяемых концентраций, которую рассчитывали статистическим
методом, исходя из критерия относительного стандартного отклонения результатов измерения ^г(С)) < 0,33 Полученные характеристики и сравнение с аналогами приведено в таблице.
80.00 60.00 40.00 20.00
<
■А 0.00
о
Н
-20.00 -40.00 -60.00
-1.00
у/ /
——^ /
-0 50
0.00 Потенции.!, В
0.50
1.00
Рис.3. Циклическая вольтамперная зависимость для графитового печатного электрода на основе модифицированной
ферроценкарбоксалъдегидом хитозаноеой плёнки
< I
га а. о о х Ф о о
03
10000
3000
6000 -
4000 -
2000
Концентрация глюкозы в кювете, ммоль/дм
Рис. 4. Градуировочная зависимость отклика биосенсора на основе модифицированной ферроценкарбоксальдегидом хитозановой плёнки
с глюкозооксидазой
Характеристики матриц ферментных биосенсоров для определения
глюкозы
Матрицы для иммобилизации ГОА Диапазон определяемых концентраций глюкозы, мМ Коэффициент чувствительности, нАдм3 Ссылка
Хитозан/ФЦ/ГО 0,2-3,1 2930±50 Данная работа
БСА/ферроцен/ГОА 0,7-2,5 110 ±20 [6]
Золь-гель/хитозан/ФЦ 0,4-21 274±30 [15]
На основе полученных данных можно судить о том, что разработанная матрица обладает наибольшей чувствительностью относительно аналогичных систем, в которых присутствует ферроцен в качестве медиатора электронного транспорта. Однако полученная матрица уступает плёнке [15] в верхней границе определяемых концентраций, что может быть связано с высокой пористостью золь-геля, которая улучшает перенос электронов в биорецепторном элементе.
Выводы
Сформирована матрица на основе хитозана, модифицированного медиатором электронного переноса ферроценкарбоксальдегидом, для иммобилизации фермента глюкозооксидазы. Разработанный проводящий гидрогель показал крайне высокое значение коэффициента чувствительности (2930±50 нАхдм3), что превосходит известные аналоги. Нижняя граница полученной системы составила 0,25 мМ, а верхняя граница определяемых концентраций равна 3,1 мМ. На основании полученных данных разработанная система является перспективной в использовании для определения глюкозы амперометрическими биосенсорами медиаторного биоэлектрокатализа.
Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект №17-74-10078).
Список литературы
1. Pillai C.K.S., Paul W., Sharmа C.P.. Chitin and chitosan polymers: Chemistry, solubility and fiber formation // Journal of Progress in Polymer Science. 2009. V.34. P. 641.
2. Honarkar H., Barikani M. Applications of biopolymers I: chitosan // Journal of Monatshefte für Chemie-Chemical Monthly. 2009. V. 140 P. 1403.
3. Carbon nanotube-chitosan modified disposable pencil graphite electrode for Vitamin B12 analysis / F. Kuralay, T. Vural, C. Bayram [et al]. // Journal of Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 2011. B. 87.
4. A glucose biosensor based on Prussian blue/chitosan hybrid film / Wang, H. Gu, F. Yin [et al]. // Journal of Biosensors and Bioelectronics. 2009. V.24 P. 1527.
5. Application of functionalised carbon nanotubes immobilised into chitosan films in amperometric enzyme biosensors / R. Pauliukaite, M.E. Ghica, O. Fatibello-Filho [et al]. // Journal of Sensors and Actuators B: Chemical. 2010. V. 55 P. 6239.
6. Chen X., Jia J., Dong S. Organically Modified Sol-Gel/Chitosan Composite Based Glucose Biosensor // Electroanalysis. 2003. V. 15 (7). P. 608612.
7. A label-free amperometric immunosensor based on biocompatible conductive redox chitosan-ferrocene/gold nanoparticles matrix/ D. Qiu, R.P. Liang, R. Wang [et al]. // Journal of Biosensors and Bioelectronics. 2009. V. 25 P. 852.
8. Zhang M., Gorski W. Electrochemical Sensing Platform Based on the Carbon Nanotubes/Redox Mediators-Biopolymer System // Journal of the American Chemical Society. 2005. V.127 P. 2058.
9. Варфоломеев С.Д., Березин И.В. В кн.: Физическая химия: Современные проблемы / Под ред. Я.М. Колотыркина. М.: Химия, 1982. С. 68-94.
10. Raoof J.B., Ojani R., Kolbadinezhad M. Voltammetric sensor for glutathione determination based on ferrocene-modified carbon paste electrode // Journal of solid state electrochemistry. 2009. V. 13 P.1411.
11. Chaubey A., Malhotra B.D. Mediated biosensors // Journal of Biosensors and Bioelectronics. 2002. V.17. P. 441.
12. Highly sensitive deoxynivalenol immunosensor based on a glassy carbon electrode modified with a fullerene/ferrocene/ionic liquid composite/W. Zhilei, L. Zaijun,S. Xiulan [et al]. // Journal of Journal of Biosensors and Bioelectronics. 2010. V.25 P. 1434.
13. Chitosan-ferrocene film as a platform for flow injection analysis applications of glucose oxidase and Gluconobacter oxydans biosensors/ Ovgu Yilmaz , Dilek Odaci Demirkol , Suleyman Gulcemal [et al]. // Journal of Colloids and Surfaces. B, Biointerfaces. 2012. V. 100 P. 62-68.
14. Латунина Л. С., Каманин С. С., Арляпов В. А. Ферментные биосенсоры для определения глюкозы, молочной кислоты и крахмала на основе модифицированных печатных электродов // Известия Тульского государственного университета. Естественные науки. 2017. №. 1. C. 67-75.
Харькова Анна Сергеевна, аспирант, Anyuta Zavtseva a mail.ru, Россия, Тула, Тульский государственный университет,
Андреева Анна Дмитриевна, бакалавр, anna-andreeva-chem(@,yandex.ru, Россия, Тула, Тульский государственный университет,
Арляпов Вячеслав Алексеевич, канд. хим. наук, доцент, v.a.arlvapovaigmail.com, Россия, Тула, Тульский государственный университет
DEVELOPMENT OF THE CONDUCTING HYDROGEL ON THE BASIS OF CHITOSAN AND THE MEDIATOR OF ELECTRONIC TRANSPORT OF FERROCENECARBOXALDEHYDE
A.S. Kharkova, A.D. Andreeva, V.A. Arlyapov
The biosensor on the basis of a graphite printing electrode consisting of the chitosan modified by a mediator ferrrocenecarboxaldehyde in the presence of glucose oxydas enzyme is developed. The structure of the received modified film was studied by an IK-spectroscopy method. The main analytical characteristics of the received biosensor are defined: the linear range of defined concentration of glucose for the developed system was 0,25-3,1 ¡M, sensitivity - 2930±50 nAdm3. The developed biosensor is extremely perspective in use for glucose definition by amperometric biosensors of a mediator bioelectrocatalysis.
Key words: biosensor, chitosan, ferrrocenecarboxaldehyde, conductive hydrogels.
Kharkova Anna Sergeevna, post-graduate student, Anyuta_Zaytseva@mail. ru, Russia, Tula, Tula State University,
Andreeva Anna Dmitrievna, student, anna-andreeva-chemaiyandex.ru, Russia, Tula, Tula State University,
Arlyapov Vyacheslav Alekseevich, candidate of chemical sciences, associate professor, v. a. arlyapov@gmail. com, Russia, Tula, Tula State University
