CC BY
13УДК 57.083.185: 582.281.21
DOI: 10.24412/1999-6780-2022-1-53-57
БИОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ МУКОРМИ-КОЗА
Ковыршин C.B. (студент, лаборант-исследователь)*, Выборнова И.В. (н.с.), Босак И.А. (с.н.с.)
НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина ФГБОУ ВО «Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова», Санкт-Петербург, Россия
Определены биохимические (,ассимиляционные) профили микромицетов - возбудителей мукормикоза. Для изученных мукоромицетое характерна ассимиляция глюкозы, мальтозы, галактозы, рафинозы, целлобиозы, тре-галозы, адонита, ксилозы, арабинозы и пролинарилами-дазная активность. Установлено, что для идентификации до рода мукоромицетое Lichtheimia spp., Rhizopus spp. и Rhizomucor spp. на основании способности к ассимиляции наиболее оптимальными являются 3-й и 4-е сутки.
Ключевые слова: ассимиляция, биохимические профили, мукормикоз, мукоромицеты, Mucorales, грибковая инфекция
BIOCHEMICAL FEATURES OF MUCORMYCOSIS ETIOLOGICAL AGENTS
Kovyrshyn S.V. (student, research assistant), Vybornova I.V. (scientific researcher), Bosak I.A. (senior scientific researcher)
Kashkin Research Institute of Medical Mycology of Northwestern State Medical University named after I.I. Mechnikov, St. Petersburg, Russia
The biochemical (assimilation) profiles of micromycetes, the causative agents of mucormycosis, were studied. It was found that the assimilation of glucose, maltose, galactose, raffinose, cellobiose, trehalose, adonitol, xylose, arabinose as well as proline-arylamidase activity, are generally characteristic for mucoromycetes. It was revealed that for identification to the genus level of micromycetes lichtheimia spp., Rhizopus spp. and Rhizomucor spp. based on the ability to assimilate various carbon sources, the 3rd and 4th days are the most optimal.
Key words: assimilation, biochemical profiles, mucormycosis, Mucoraceae, Mucorales, fungal infection
ВВЕДЕНИЕ
Мукормикоз — инфекция, вызываемая условно-патогенными мицелиальными грибами порядка Mucorales. Как правило, данное заболевание развивает-
* Контактное лицо: Ковыршин Сергей Валерьевич, e-mail: kovyrshin_sergey@mail.ru
ся у пациентов на фоне иммунодефицита и характеризуется высокой летальностью (20%-80%) [1, 2]. В последнее время в мире существенно возросло количество случаев мукормикоза, особенно среди пациентов с COVID-19, в том числе с развитием вспышек, как было показано в Индии [3]. Несмотря на интенсификацию разработок в сфере лабораторной молекулярно-генетической диагностики мукормикоза, микроскопическое и культуральное исследование биоматериала по-прежнему остаётся основным в верификации этого диагноза [2, 4].
Видовая идентификация мукоромицетов по морфологическим и некоторым физиологическим признакам (предельная t° роста) - доступный подход, но требует наличия у врача-микробиолога специальной подготовки и определенного опыта работы с этими грибами. В последнее время, помимо микроскопического исследования культуры, рекомендован для идентификации грибов метод MALDI-TOF-масс-спектрометрии (Matrix-Assisted Lazer
Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF-MS), но, как показал опыт, данная методика требует специальных подходов к пробоподготовке, разработке новых библиотек масс-спектро-профилей мукоромицетов и имеет ограничение в точности идентификации отдельных мукоромицетов, например, представителей рода Lichtheimia [5].
Экспертным подходом к видовой идентификации мукоромицетов является таргетное ДНК-секвенирование таксономически значимых локусов. Однако оборудование и средства для ее проведения пока доступны для небольшого количества диагностических лабораторий.
Идентификация возбудителей мукормикоза до рода и вида имеет важное клиническое и эпидемиологическое значение. Имеются данные о различиях в чувствительности в зависимости от вида возбудителей мукормикоза к противогрибковым лекарственным препаратам, в частности, к амфотерицину В [6].
В связи с этим для решения диагностических задач при мукормикозе актуально изыскание дополнительных методов идентификации мукоромицетов, в частности, основанных на определении биохимических свойств.
Цель работы: определить биохимические (ассимиляционные) профили возбудителей мукормико-
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Для изучения биохимических профилей мукоромицетов использовали тест-систему Auxacolor™ 2 (Bio-Rad). Исследовали 28 штаммов порядка Mucorales, предоставленных Российской коллекцией патогенных грибов (РКПГ): Lichtheimia spp. - 11 штаммов (5 - L. corymbifera - РКПГ F-2020, 1601, 1493, 1837, 1568; 5 - L. ramosa - РКПГ F-1456, 1969, 2019, 2007, 2021; 1 - L. ornata - РКПГ F-1507), Rhi-
zopus spp. - 10 штаммов (8 - R. arrhizus - РКПГ F-2074, 2053, 2054, 1816, 1537, 1971, 2027, 2140; 2 - R. microsporia - РКПГ F-1538, 1497), 7 штаммов Rhi-zomucor pusillus - РКПГ F-1536, 1508, 1341, 1892, 1542, 1648, 1854. Культуры микромицетов выращивали 5 дней на агаре Сабуро. Для приготовления инокулюма с поверхности культуры собирали споры стерильным тампоном и добавляли их в 0,85% стерильный раствор, доводя плотность до 1 по МакФарланду. Затем 200 мкл инокулюма растворяли в 3 мл дистиллированной воды. Полученную рабочую взвесь заносили по 100 мкл в каждую лунку панели для биохимической идентификации и инкубировали в течение 4 суток при t° = 28 °С с ежедневной визуальной фиксацией результатов. Результат считали положительным при смене окраски в лунке с синей на желтую. Для обработки результатов применяли критерий Манна-Уитни, а также программу STATISTICA for Windows. Для исследования особенностей роста мукоромицетов в лунках биохимической панели использовали стереомикроскоп Stemi 2000-С с осветителем KL 1500 LCD (Carl Zeiss Jena, Германия).
Использованные сокращения. GLU - глюкоза, MAL - мальтоза, SAC - сахароза, GAL - галактоза, LAC - лактоза, RAF - рафиноза, INO - инозит, CEL
- целлобиоза, TRE - трегалоза, ADO - адонит, MEL
- мелецитоза, XYL - ксилоза, ARA - арабиноза, HEX — гексозаминидазная активность, РОХ — фено-локсидазная активность, PRO - пролинариламидаз-ная активность.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В ходе исследования получены биохимические профили возбудителей мукормикоза — представителей родов Lichtheimia, Rhizopus и Rhizomucor. Характерные свойства штамма, присущие мукоромицету Lichtheimia corymbifera, по ассимиляции углеводов отражены на биохимической панели (Рис. 1).
C.Neg GLU MAL SAC GAL LAC RAF INO
CE! TRE ADO MEL XYL ARA HEX POX/PRO
Рис. 1. Биохимический профиль /./сМЬе/т/а согутЬ^ега РКПГР-2020 через 2 суток.
На рисунке 2 отчетливо видны различия в морфологии мукоромицета при исследовании содержимого лунок с отрицательным и положительным результатами по ассимиляции углеводов.
«ж Е2ж
Лунка без ассимиляции
lichtheimia corymbifera PKnrF-2020
Рис.2. Стереомикроскопия положительных и отрицательных лунок.
При проведении повторных тестов отмечено, что на 1-е сутки биохимический профиль одних и тех же штаммов внутри родов Lichtheimia и Rhizo-тисог был вариабелен, но на 2-4-е сутки стабильно воспроизводился. Для штаммов рода Rhziopus не выявлена вариабельность при повторной постановке теста. В связи с этим оценку биохимических профилей для штаммов проводили, начиная с 2-х суток.
Биохимические профили изученных родов мукоромицетов представлены в таблице 1. На сроке 2 суток выявлены различия между штаммами одного и того же вида по способности ассимилировать углеводы, поэтому в таблице указаны доли (%) положительных и отрицательных штаммов.
Таблица 1
Биохимические профили микромицетов порядка Мисога1ев _в течение 3 суток исследования_
L. ramosa
2
сутки
сутки
4
сутки
LAC
60% 40%-
2
сутки
сутки
4
сутки
20% 80%
сутки
сутки
4
сутки
GLU MAL SAC
2
сутки
3
сутки
4
сутки
2
сутки
80% +, 20% -
INO CEL TRE ADO MEL XVL ARA HEX POX
L. corymbifera
L. ornata
RAF INO CEL
29%
71%
29%
71%
29%
71%
R. pusillus
RAF INO CEL
R. microsporus
ADO MEL XYL ARA HEX POX
3 сутки + 50% +, 50%- + +
4 сутки + + + +
R. arrhizus
GLU MAL SAC GAL LAC RAF IN0 CEL TRE AD0 MEL XYL ARA HEX P0X PRO
2 сутки + 63% +, 37% 87%+, 13%- 87%+, 13%- 87%+, 13%- + 50% >0%- >0% +, 50%- 13% +, 87%
3 сутки + + + 13% 87% +
4 сутки + + + 13% 87%- + + + + + +
Примечание: в % указано количество штаммов, ассимилировавших вещества.
Биохимические характеристики изученных видов мукоромицетов. На 2-е сутки для 100% штаммов L. ramosa была характерна ассимиляция глюкозы, мальтозы, галактозы, целлобиозы, трегалозы, адонита, ксилозы, арабинозы и положительная пролинариламидазная активность (ПАА), для 60% штаммов — лактозы, для 80% — рафинозы. Для штаммов L. ramosa не была свойственна ассимиляция сахарозы, инозита, мелецитозы, а также гексозаминидазная и фенолоксидазная активности. Установлено, что к 3-м суткам 100% штаммов L. ramosa ассимилировали лактозу и рафинозу, а на 4-е сутки изменений в биохимическом профиле не о б наруже -
Показано, что на 2-е сутки 100% штаммов L. corymbifera ассимилировали глюкозу, мальтозу, галактозу, рафинозу, целлобиозу, трегалозу, ксилозу, арабинозу и проявляли ПАА; 20% штаммов ассимилировали лактозу, 80% — адонит. Для 100% штаммов не была характерна ассимиляция сахарозы, инозита, мелецитозы, гексозаминидазная и фенолоксидазная активности. Установлено, что на 3-й сутки 100% штаммов ассимилировали лактозу и адонит, а на 4-е сутки изменений в биохимическом профиле не обнаружено.
В результате исследования определено, что на 2-е сутки штамм L. ornata ассимилировал глюкозу, мальтозу, галактозу, рафинозу, целлобиозу, трегалозу, адонит, ксилозу, арабинозу, ПАА, но отсутствовала способность к ассимиляции сахарозы, инозита, мелецитозы, гексозаминидазная и фенолоксидазная активности. Кроме того, на 3-е и 4-е сутки изменений в биохимическом профиле не было обнаружено.
Следует отметить, что на 2-е сутки 100% штаммов R. pusilliis усваивали целлобиозу, трегалозу, ксилозу и проявляли ПАА; 86% — глюкозу, мальтозу, галактозу, арабинозу, 29% - лактозу. Для 100% штаммов не свойственна ассимиляция сахарозы, рафинозы, инозита, адонита, мелецитозы, гексозаминидазная и фенолоксидазная активности. На 3-е сутки для 58% штаммов характерна ассимиляция рафинозы. Следует отметить, что на 4-е сутки изменений в биохимическом профиле не обнаружено.
На 2-е сутки для 100% штаммов Я. гтегоърогиъ отмечали ассимиляцию глюкозы, галактозы, целлобиозы, трегалозы, адонита, ксилозы и ПАА, для 50%
— мальтозы. В то же время отмечена ассимиляция сахарозы, лактозы, рафинозы, инозита, мелецитозы, арабинозы, гексозаминидазная и фенолоксидазная активности. На 3-е сутки 100% штаммов К. тгего-хрогш ассимилировали арабинозу, но на 4-е сутки изменений в биохимическом профиле не обнаруже-
Для 100% штаммов /?. ягг/к'ги« на 2-е сутки отмечали ассимиляцию глюкозы, адонита, для 87% — галактозы, целлобиозы, трегалозы, для 63% - мальтозы, для 50% - ксилозы, арабинозы, для 13% - положительную ПАА. 100% штаммов К. аггЫгш не ассимилировали лактозу, сахарозу, рафинозу, инозит, мелецитозу, отсутствовали гексозаминидазная и фенолоксидазная активности. На 3-е сутки 100% штаммов этого мукоромицета усваивали мальтозу, галактозу, целлобиозу, трегалозу, ксилозу, арабинозу, были положительны на ПАА; 13% штаммов ассимилировали рафинозу. На 4-е сутки изменений в биохимическом профиле не обнаружено.
В отличие от Я. тгсго8роги8, некоторые штаммы К. аггЫгш ассимилировали рафинозу на 3-е сутки.
Сравнение различных родов мукоромицетов на основе их биохимических профилей. Установлено, что на 2-е сутки различия выявлены между: ЫсЫЬегтга и ЯШготисог — в ассимиляции адонита, рафинозы; ЫсЫЬегт1а и ЯЫгорш - в ассимиляции арабинозы, ПАА и рафинозы; ЯЫгорш и ЯЫготисог
— в ассимиляции адонита и ПАА. На 3-е сутки различия проявлялись между: 1лсЫкеита и ЯЫготисог
— в ассимиляции рафинозы, лактозы и адонита; ¡ЛсЫкеита и ЯЫгорш - в ассимиляции рафинозы и лактозы; ЯЫгорш и ЯЫготисог — в ассимиляции адонита. На 4-е сутки показаны различия между: родами ЫсШкегтга, ЯЫготисог и ЯЫгорш - в отсутствии ассимиляции последним лактозы и рафинозы; ЫсШкегтга, ЯЫгорш и ЯЫготисог - в отсутствии ассимиляции последним адонита. Выявленные различия статистически достоверны (р<0,05).
Полученным биохимическим профилям были присвоены коды по аналогии с имеющимися для дрожжевых грибов в инструкции Аихасо1ог™ 2. Каждому тесту соответствовало определенное значение, затем суммировали положительные показатели в группе из 3 лунок (5 групп). Получившееся число являлось одной из составляющих кода (табл. 2). В данной модификации рассчитывали только показатели, основанные на ассимиляции веществ, так как остальные параметры тест-системы, предложенные производителем, применимы только для дрожжевых грибов.
Как видно из представленного ключа, на вторые сутки наблюдения максимальное числовое значение кода было у представителей рода Lichtheimia. Внутри рода Rhizopus можно различить R. microsporus и R. arrhizus между собой. Рода Rhizopus и Rhizomucor отличались по отсутствию ассимиляции адонита вторым. На третьи и четвертые сутки все изученные рода мукоромицетов отличались уникальными кодами биохимических признаков.
Сложной оказалась дифференцировка видов внутри рода Lichtheimia, так как биохимические профили L. ramosa, L. ornata и L. corymbifera наиболее схожи. Вероятно, увеличение выборки штаммов мукоромицетов позволит установить дополнительные различия между ними.
Изучение биохимической активности мукоромицетов на основе других тест-систем по данным литературы. Исторический опыт исследования ассимиляционной активности мукоромицетов сравнительно скуден. Одно из первых наблюдений с использованием 2-х биохимических панелей промышленного производства опубликовано сотрудниками отдела молекулярной микологии института Пастера в Париже. Авторам удалось доказать возможность биохимической идентификации мукоромицетов, однако, в противоположность нашему исследованию, индивидуальные биохимические особенности штаммов были слабо выражены [7]. Кроме того, авторы не смогли определить консенсусный ассимиляционный профиль Rhizopus arrhizus. В октябре 2018 г. Pawlowska J. и соавторы [8] сообщили о результатах
исследования, проведенного с использованием тест-системы «Biolog Phcnotyping microarray», где оценили профили ассимиляции углеводов у мукоромицетов. В список представленных родов вошли Rhizopus и Lichtheimia, для которых были выявлены различия: ассимиляция лактозы и рафинозы вторым родом, но не первым, что совпадает с полученными нами результатами (Рис. 3).
Б
Рис. 3. Различия в ассимиляции лактозы (А) и рафинозы (Б) микромицетами родов ЯЬ/горив и /./сЛйе/т/а на 3 сут-
Авторы отметили, что штаммы рода Rhizopus не ассимилировали целлюлозу, но хорошо росли на простых целлюлозо-содержащих средах. В нашем исследовании присутствовал углевод целлобиоза, который является мономером целлюлозы. Установлено, что род Rhizopus может ассимилировать цел-лобиозу, что объясняет данный феномен.
В работе Ра\у1о\¥зка I. с! а1.[8], также как и в проведенном нами исследовании, показано, что Lichtheimia эрр. ассимилируют более широкий спектр углеводов, чем Rhizopus эрр. Авторы провели аннотирование генов-транспортеров углеводов у мукоромицетов и установили, что представители семейства Lichtheimiaceae имеют большее количество таких генов, что может объяснять более эффективное использование Сахаров в качестве единственного источника углерода этими микромицетами.
Таким образом, полученные данные позволяют предположить, что исследование биохимических
Таблица 2
Условные коды, характеризующие микромицеты порядка Mucorales на тест-системе Auxacolor™ 2
L. ramosa
2 сутки 3 5(7) 6 5 1 +
3 сутки 3 7 6 5 1 +
4 сутки 3 7 6 5 1 +
L. corymbifera
2 сутки 3 5 6 5 1 +
3 сутки 3 7 6 5 1 +
4 сутки 3 7 6 5 1 +
L. ornata
2 сутки 3 7 6 5 1 +
3 сутки 3 7 6 5 1 +
4 сутки 3 7 6 5 1 +
R. microsporus
2 сутки КЗ) 1 6 1 +
3 сутки 1(3) 1 6 5 1 +
4 сутки 3 1 6 5 1 +
R. arrhizus
2 сутки 1 1 6 1(5) 0(1) +
3 сутки 3 1 6 5 1 +
4 сутки 3 1 6 5 1 +
R. pusiiius
2 сутки 1 1 4(6) 4 1 -
3 сутки 3 1(5) 6 4 1 +
4 сутки 3 1(5) 6 4 1 +
свойств мукоромицетов по ассимиляции набора углеводов может быть полезно при идентификации грибов до рода.
ВЫВОДЫ
1) Биохимические отличия по ассимиляции углеводов представителей различных родов мукоромицетов наиболее выражены на третьи и четвертые сутки наблюдения: в отличие от родов ЫсЫЬеШга и ЯЫготисог, для рода ЯЫгорш не характерна асси-
миляция лактозы и рафинозы, а для рода ЯШготисог - адонита.
2) Для исследованных в работе мукоромицетов родов ЫсЫЬеМга, ЯЫгорш и ЯЫготисог характерны ассимиляция глюкозы, мальтозы, галактозы, цел-лобиозы, трегалозы, ксилозы, арабинозы и пролина-риламидазная активность. Наибольшее количество веществ ассимилируют представители рода ¡ЛсЫкеита.
ЛИТЕРАТУРА
1. Хостелиди С.Н., Шадривова О.В., Борзова Ю.В. и др. Клинико-лабораторные особенности мукормикоза у взрослых. Проблемы медицинской микологии. 2020; 22 (2): 22-28. [Khostelidi S.N., Shadrivova O.V., Borzova U.V., et al. Clinical and laboratory features of mucormycosis in adults. Problems in medical mycology. 2020; 22 (2): 22-28 (In Russ)]. doi: 10.24412/1999-6780-2020-2-22-28
2. Cornely O.A., Alastruey-Izquierdo A., Arenz I)., Chen S.C.A., et al. Global guideline for the diagnosis and management of mucormycosis: an initiative of the European Confederation of Medical Mycology in cooperation with the Mycoses Study Group Education and Research Consortium. The Lancet Infectious Diseases. 2019; 19 (12): e405-e421.
3. Gandra S., Ram S., Levitz S.M. The «Black Fungus» in India: The Emerging Syndemic of COVID-19-Associated Mucormycosis. Ann. Intern. Med. 2021; 174 (9): 1301-1302. doi: 10.7326/M21-2354
4. Министерство здравоохранения Российской Федерации. «Профилактика, диагностика и лечение новой ко-ронавирусной инфекции (COVID-19)» - Временные методические рекомендации, версия 15 (22.02.2022). [Ministry of Health of the Russian Federation. "Prevention, diagnosis and treatment of new coronavirus infection (COVID-19)" -Temporary guidelines, version 15 (02/22/2022) (In Russ)].
5. Рябинин И.А., Ковыршин С.В., Васильева Н.В. Масс-спектрометрическая характеристика возбудителей мукормикоза. Проблемы медицинской микологии. 2021; 23 (4), 44-50. [Ryabinin I.A., Kovyrshyn S.V., Vasilyeva N.V. Mass-spectometric characteristics of mucoromycosis causative agents. Problems in Medical Mycology. 2021; 23 (4), 44-50 (in Russ)]. doi: 10.24412/1999-6780-2021-4-44-50
6. Vasilyeva N., Vybornova I., Kovyrshin S., et al. In vitro susceptibilities of mucormycosis etiologic agents to amphotericin В and posaconazole. J. Fungi. 2021; 7 (11): 289-290. doi: 10.3390/jof7110916.
7. Schwarz P., Lortholary ()., Dromer F., Dannaoui E. Carbon assimilation profiles as a tool for identification of zygomycetes. Journal of Clinical Microbiology. 2007; 45 (5): 1433-1439. doi: 10.1128/JCM.02219-06
8. Pawtowska J., Okrasiñska A., Kisto К., et al. Carbon assimilation profiles of mucoralean fungi show their metabolic versatility. Sci. Rep. 2019; 9 (1): 11864. doi: 10.1038/s41598-019-48296-w.
Поступила в редакцию журнала 10.03.2022 Рецензент: Т. С. Богомолова
