Структурированные и неструктурированные формы существования микромицетов в искусственных и естественных условиях Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

УДК 616.992:616-057

СТРУКТУРИРОВАННЫЕ И НЕСТРУКТУРИРОВАННЫЕ ФОРМЫ СУЩЕСТВОВАНИЯ МИКРОМИЦЕТОВ В ИСКУССТВЕННЫХ И ЕСТЕСТВЕННЫХ УСЛОВИЯХ

Блинов Н.П. (зам. директора по научной работе)*

НИИ медицинской микологии им. П. Н. Кашкина ГОУ ДПО СПб МАПО, Санкт-Петербург, Россия

© Блинов Н.П., 2009

Микроорганизмы (в том числе и отдельные микромицеты), как правило, существуют в сообществах себе подобных или других видов либо на питательных субстратах in vitro, либо in vivo — в живых организмах. В первом случае они могут быть «взвешенными» в жидких средах (взвеси), или в виде планктона (от греч. plankton — блуждающее); в других случаях, например, на уплотнённых субстратах in vitro или на слизистых оболочках у людей и животных, на/в коже и её придатках (ногтях и волосах), в некоторых других тканях патогенные и условно-патогенные микромицеты образуют характерные структурированные формы, за счёт которых они обеспечивают себе определённые преимущества в конкурентной борьбе за выживание.

Ключевые слова: бактерии, взвеси, грибы нитчатые, дрожжи, колонии, микромицеты, планктон, структурированность

THE STRUCTURAL AND NON STRUCTURAL FORMS OF EXISTENCE OF MICROMYCETES IN ARTIFICIAL AND NATURAL CONDITIONS

Yelinov N.P. (The deputy Director for Research Programs)

Kashkin Research Institute of Medical Mycology.

SEI APE SPb MAPE, SPb, Russia

© Yelinov N.P., 2009

Microorganisms (including micromycetes) as rule exist in complicity of themselves similar or other species either on nutrient substrates in vitro or in vivo — in living organisms. In the first case they can be lonely disperged in fluid media (dispersions) or in the plankton shape, for example in solid substrates in vitro or on mucous membranes at people

* Контактное лицо: Блинов Николай Петрович Тел.: (812) 303-51-40

and animals, on/in skin and its appendages (hairs and nails) and some other tissues pathogenic and conditionally-pathogenic micromycetes make characteristic structural forms with which they secures themselves definite advantages in a competition for the surviving.

Key words: bacteria, colonies, hyphal fungi, micromycetes, plankton shape, structurality, yeasts

У ряда специалистов — микробиологов до последнего времени формировались представления о микроорганизмах преимущественно как об одноклеточных формах живьгх существ; тем более, что объекты микологии до недавних пор систематики относили к царству растений. Поэтому неудивительно то, что со студенческой скамьи мы изучали одноклеточные культуры бактерий, дрожжевых организмов в суспензиях в жидких средах или в КОЁ — на плотных средах.

Многие микроорганизмы в природных условиях обитания находятся в плёнко-формирующихся системах, прикрепляющихся к каким-либо поверхностям, а не «свободноплавающими клетками» — взвесями (планктонная форма).

Очевидно, мы можем говорить о том, что плён-кообразование in vivo тесно связано с патогенностью микроорганизма (в том числе — микромицета), то есть его способностью вызвать инфекционный процесс. Патоген (один или в ассоциации) в биоплёнке становится устойчивее к защитным силам макроорганизма (имея в виду, прежде всего, иммунную систему), а также к различным химиотерапевтическим средствам.

В настоящей работе приведены данные о планктонных и структурированных формах некоторых избранных грибов из родов Aspergillus, Aureobasidium, Candida, Fusarium, Gelosinospora, Penicillium и др. Демонстрационные материалы выполнены преимущественно на видах, сохраняемых в Российской коллекции патогенных грибов (РКПГ) в НИИ медицинской микологии им. П. Н. Кашкина СПб МАПО.

В род Aspergillus включено, в среднем, 200 видов, из которых свыше 20 видов описаны как патогены, способные вызывать заболевание людей (аспергил-лёз) [1-3]. Наиболее часто выделяют из патологического материала A. fumigatus, затем — A. flavus, A. niger и др. Из них первый за сутки в подходящих условиях способен образовывать порядка 65 млн. зародышевых клеток — экзоконидий. Созревшие конидии могут находиться в форме взвеси в воздухе закрытых помещений или во внешней среде. Подобные конидии, попав в жидкую водную среду, находятся во взвешенном состоянии до начала прорастания и формирования нитей мицелия. Если же эти клетки оказываются на уплотнённой питательной среде или субстрате, то они могут образовывать колонии определённой структуры, или архитектоники (фото 1,2,3). ...... ’

а б

Фото 1. А. 1 — недельные колонии, выра-

щенные на среде Сабуро; б) конидиеносец и отпадающие конидиоспоры (х40)

а б

Фото 2, A. flavus:a) 1 — недельные колонии, выращенные на среде Сабуро; б) конидиеносец и отпадающие конидиоспоры (х40)

ванных сумках (аскусах), из которых они освобождаются во вне. В качестве демонстрации ниже приведен перитеций Gelosinospora species с яйцевидными бугристыми аскоспорами (фото 4), «выходящими» через остиолу.

Фото 4. Высвобождение аскоспор из перитеция Gelosinospora species через остиолу

а б

Фото 3, А. п!дег: а) 1 — недельные колонии, выращенные на среде Сабуро; б) конидиеносец и отпадающие конидиоспоры (х40)

Если экзоконидии мицелиальных грибов, как правило, гаплоидные, то аскоспоры сумчатых грибов обычно диплоидные и образуются в структуриро-

Конидии у A. flavus — шаровидные, гладкие — до шиповатых, 3-6 мкм в диаметре (чаще 3,5-4,5 мкм); у A. fumigatus — шаровидные, гладкие (могут быть субшаровидными, иногда — эллипсовидными) или шиповатые (редко — гладкие), 2,2-3,0 мкм в диаметре; у A. niger конидии также шаровидные, толстостенные, коричневые — до чёрных по цвету, нерегулярно-шероховатые, 4-5 мкм в диаметре.

Цвет колоний; у A.flavus жёлтый — до желтоватозелёного или, с возрастом, зелёного; у A. fumigatus — белый, зелёный — до серо-зелёного, на скошенной агаризованной среде в пробирках — серые с возрастом. Оборотная среда колоний вариабельна по цвету. Колонии Л. niger вначале белого цвета, становящиеся затем чёрными; оборотная сторона их случайно может приобретать бледновато-жёлтую окраску.

В качестве возбудителей аспергиллеза описаны следующие виды: A. amstelodamii, A. candidus, A. carneus, A. clavatus, A. conicus, A. deflectus, A.fischeri, A.flavipes, A. nidulans, A. niveus, A. ochraceus, A. oryzae, A. parasiticus, A. repens, A. restrictus, A. ruber, A. sydowi, A. terreus, A. ustus, A. versicolor [1].

В роде Aureobasidium описано 14 видов, достаточно широко распространённых в природе, их изолируют из почвы, воздуха, растительных остатков, как сапробы они могут находиться на поверхности кожи людей в качестве контаминантов, хотя в отдельных случаях некоторые из них (например, A. pullulans) могут индуцировать кератит, перитонит у лиц, длительно получающих перитонеальный диализ, лёгочную инфекцию, а вид A. mansonii может обусловить менингит.

Ныне описаны два варианта A. pullulans — var. pullulans и var. melanogenum. Колонии последнего быстрее становятся зеленовато-чёрными — до чёр-

ных примерно через 4-5 суток. А. ри11и1аж с разновидностями является диморфным (фото 5).

полисахарид

клетки

б в

Фото 5. Aureobasidium pullulans: а) планктонный рост бесцветных клеток при глубинном выращивании,х 950: б, в) пленчатый структурированный рост на агаре Сабуро. http://microbioloav.mtsinai.on.ca/mia/defunai [4]

Дрожжевые организмы рода Candida объединяют свыше 160 видов, из которых около 20 описаны как возможные патогенны для человека. Наиболее важным из них в этом плане является С. albicans — диморфный микромицет, способный быть одноклеточным, например, при +37 °С, и псевдомицелиаль-ным при 26-28 “С (фото 6, 7, 8).

а б

щ V 1 б

В 1 * ] г

Фото 7. Колонии (натуральная величина) С. albicans (а, в, г — РКП ГУ-401/NCTC 885-653 и б — РКПГУ-885-653), выращенные на сусле-агаре (а, в) и среде Сабуро (б, г) при 28 и 37 ° соответственно

Он часто вызывает оппортунистические инфекции у иммунодефицитных лиц, например, у пациентов с трансплантатами, у страдающих от СПИД, у онкологических больных.

С. albicans — облигатный диплоидный вид с 8 парами хромосом, ранжированных от 0,95 до 3,5 Mb ДНК, а в гаплоидном состоянии объединяет до 16 Mb ДНК [5]. У людей С. albicans обнаруживают на слизистой оболочке ротовой полости, в пищеварительном тракте, у женщин — в вагине; за счёт трансформации дрожжевых клеток в псевдомицелиальные и мицели-альные нити С. albicans проникает в живые ткани, поэтому она способна заражать большинство органов и частей тела человека. При сепсисе в крови она находится преимущественно в дрожжевой фазе, тогда как на слизис тых оболочках формирует плёночные структуры (фото 8).

в г

Фото 6. Суспензированный рост некоторых видов Candida на жидкой среде Сабуро: а — С. albicans (RCPF-401 / NCTC 885-653), б — С./спяе/(РКПГУ-1057), в — С. lipolytica (РКПГУ-653/76), г — С. famata (РКПГУ 1196). Ув, х 900

В

Ш %

н.

%

Фото 8. Биопленки С. albicans на разных субстратах: а) на этафилконе; б) на балафилконе; в) на Сабуро — «ласточкины гнезда»

Характеристика патогенных и условнопатогенных Candida spp. приведена в таблице 1. Факторами патогенности/вирулентности у С. albicans являются адгезины, внеклеточные протеазы и фос-фолипазы, ростковые трубки и псевдогифы, способность к фенотипическому переключению округлых белых клеток в продолговатые тусклее (серые) и — наоборот (фото 9).

Фото 10. С. albicans (штамм WO-1) колонии на уплотненной питательной среде,содержащие округлые и продолговатые клетки: а — исходная гладкая; Ь — звездчатая; с — окольцованная; d — нерегулярно складчатая; е — пятнистая; f— шляповидная; g — пушистая; h — ревертант-гладкая

Г? I \

белый г? і ^ серый ■* і

Фото 9. Белая и серая (тусклая) формы клеток С. albicans

При этом продолговатые клетки оказываются более вирулентными, чем округлые. Можно предполагать, что продолговатые особи оказываются в гаплоидном состоянии. Обе формы находятся под контролем соответствующих генов — для белых округлых клеток WH11 ген, для тусклых продолговатых — SAPI ген (от англ. White — белый, Stcretory Aspartic Proteases — секреторные аспартил-протеазы) (фото 10).

Адгезины, выявленные у С. albicans, являются: углеводами, белками и, очевидно, липидами (!?). Лигандами углеводов в макроорганизме выступают лектиноподобные белки и, напротив, для белковых адгезинов лигандами оказываются лектиноподобные углеводы, или белки, нековалентно взаимодействующие между собой, а также ковалентно-связанные протеины; наконец, адгезином может быть липид, а лигандом в макроорганизме — протеин (!?) или, напротив, протеин выступает как адгезин, а лигандом — липид (!?).

Подобные адгезины и лиганды найдены у Aspergillus fumigatus, Candida glabrata, Cryptococcus neoformans, Penicillium marneffei, Pneumocystis carinii, Sporothrix schenckii и др.

Белок-адгезин у A. fumigatus размером 72 кДа взаимодействует in vivo с сиаловой кислотой лами-нина; другой адгезин (нерасшифрованной принадлежности) взаимодействует лектиноподобно с сиаловой кислотой фибронектина и фибриногена.

В любом варианте микромицетов можно отметить их возможность быть двухфазными в соответствующих условиях среды обитания (С. albicans и многие другие виды этого рода, Cryptococcus spp., Penicillium marneffei и др.) или монофазными (пени-

циллы, дерматомицеты). В суспензионной форме могут быть гаплоидные и диплоидные клетки, однако вирулентными оказываются, как правило, первые. И если структурированные формы на слизистых оболочках имеют в своем составе (в популяции) гаплоидные клетки, то их патогенность (вирулентность) возрастает.

С. albicans образует количественно большую и качественно более сложную биопленку на дисках силиконового эластомера по сравнению с другими видами Candida.

При микроскопии биопленок С. albicans найдено, что они «толстые» с однообразной мофрологией составляющих их базовых клеток-бластоспор, поверх которых располагается более плотный матриксный слой, состоящий из акзогликанов и гифов. Пленки С. parapsilosis обычно меньшего объема и состоят только из агломерированных бластоспор.

Однако частота образования биопленок из С. albicans заметно меньше (почти в 8 раз), чем частота формирования биопленок не- albicans видами Candida.

Candida spp. в пленках значительно устойчивее к флуконазолу, чем в «планктонной» форме. Антими-котики, сравнительно давно и недавно применяемые на практике, не действуют губительно в отношении биопленок Candida spp. (амфотерицин В, ворикона-зол = Вифенд®, итраконазол = Орунгал® и др, флу-коназол = Дифлюкан®, флуцитозин = фторцитозин, равуконазол). Но липидные формы амфотерицина В (амбизом, абелсет), каспофунгин и микофунгин обладают ингибирующим действием в отношении биопленок Candida spp.; подмечено, что нестероидные противовоспалительные лекарственные средства (аспирин и др.) обладают in vitro сходным ингибирующим действием.

Возможные повреждения грибами-патогенами разных систем макроорганизма приведены в таблице 2.

Ферменты и клеточные процессы, регулируемые кальмодулином*

Аденилат-циклаза

Таблица 2.

Возможные повреждения грибами-патогенами разных систем макроорганизма

миозин-light chain -киназа фосфорилаза киназа

гуанилат-циклаза

Саг*-зависимая протеин-киназа

НАД-киназа

освобождение

нейромедиатора

фосфодизстераза фосфолипаза А2

Саг*-АТФ-аза

диссоциация микротубул мембранное фосфорилирование другие? (пост-синаптические, ядерные функции)

система повреждающее действие благодаря:

покровная активности кератиназ при дерматомикозах кожи и её придатков; за счёт активности фосфолипаз при микотических поражениях слизистых оболочек открытых полостей

мышечная белку «кальмодулину»*, активирующему миозин — киназу, катализирующей р-цию фосфорилирования миозина с последующим сокращением гладких мышц, при снижении уровня Са2+ в плазме крови менее 2.5mm/l возможны выраженные спазмы скелетных мышц

опорная (скелетная) эффектам «кальмодулина» — кальций (са2+)-связывающего протеина, а также гормональной дис-регуляции метаболизма кальция при участии стероидного гормона 1,25-дигидроксихоле-кал ьциферола, парат-гормона, кальцитонина, глюкокортикоидов и гормона роста, остеомиелита

кровеносная микотическим поражениям структурных компонентов сердца, фунгемиям, грибковым энзимопатиям, обусловливающим тромбообразование или, напротив, индуцирующим гидролиз субстратов

дыхательная микозам различных отделов системы с первичным повреждением липидных мембран в составе слизистых оболочек ФЛ-азами

пищеваритель- ная микозам различных отделов системы, включая дисбиозы, изменения pH содержимого желудка, тонкой, тощей и толстой кишок и пр.

нервная поражениям ЦНС, например, при криптококкозе, сце-доспориозе при участии ферментов полифенолоксидаз, ФЛ аз и др.

эндокринная микозам эндокринных органов и тканей (прежде всего, pancreas и обусловленный этим сахарный диабет)

выделительная микозам системы (уретриты, циститы, пиелиты, колиты и др.)

сенсорная микозам (кератиты, перитониты, отиты, менингиты, плевриты и др.)

иммунная микозам и микоаллергозам

репродуктивная микозам гениталий (в том числе — при участии эндокринной системы)

При развитии патологических процессов у людей и животных — представителей надцарства эукариотов важную роль могут приобретать чистые культуры или их ассоциации, например, с бактериями в пленках при кандидозе верхних отделов дыхательных путей.

Пленки Candida spp. образуются в составе нор-мобиоты у людей в связи с имплантированными био- и другими материалами (протезы, шунты, эн-дотрахеальные трубки, различные типы катетеров, биопленки на глазных линзах и др.).

Прогнозируемые задачи исследования планктонных и биоплёночных структур микромицетов:

I. Изучить молекулярные механизмы возникновения и развития биоплёнок — какие потенции клеток индуцируют их переход от планктонной формы существования к плёночной и — наоборот, с учётом ныне задействованных генов?

II. Оценить структурно-функциональное состояние биоплёнок от начала их формирования и до «конечного созревания».

III. Исследовать диапазоны чувствительности и резистентности биоплёнок к биоцидам и лекарственным средствам.

Таблица 1.

Культуральные и физиолого-биохимические характеристики Candida species

Candida (анаморфа): P П Образование Ферментация Ассимиляция

пм ХЛ РТ У а 6 в г д е 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25

ofricono + - + ± + - + + + - - - + + - ± + - + - - - - - + - - - - - - - + - - +

albicans + - + + + - + в - + - + + + - + + - + - - - - + + + + - - +

albicans var. stellatoidea + - + + - - + в - + - + + + - + + - + - - - - + + + + - - +

catenulata + - + - - - в ± - ± - - + + + - + в в - - ± - + - + - + - - +

ciferrii + - + + + + + в + - - в + - в + + + в + + + + + + в в в

dubliniensis + - + + + - + в - + - в + + - + + - + - - - - + - - - - - - - - + - - - +

famata var. famata + -с -с -с -с -с + в -с -с - + + в + в в + +с в в в в +с в + в + - +с +

famata var. flareri + -с -с -с -с -с + + -с -с - + + в + в в + +с в в в в +с с + в + - +с +

glabrata + - - - - - + - - - - + + - - - - - - в - - - - - - - - - +с - - - - - - -

guilliermondii + - + - - - + в + - - + + + + + + + + - + + + - + + + + в + - + в + + + +

kefyr + - + - - - + + + - в - + + - + - в в в - + - - м в - в - м - м - в - в +

krusei + + + - - + в + - - - - - + - в - - - - - - - - - - - - - - + - - - - - - +

lipolytica + + + - - + - - - - - - + в в -с в - + + в - - -с +

lusitaniae + - + - - - + в в в - в + + + + + + + - - - + - + в - - в + - м - в + +

norwegensis + - + - - - +м - - - - - + - - - - + - - - - - - - - - - - - + + - + + +

parapsilosis + - + - - - + в в М,- М,- М,- + + м,+ + + - + - - - + - в + - в - + - м,+ - + + +

pelliculosa + - + - - - + в + в - - + + - + + + + - - + + + в в - в - + + в - + + +

tropicalis + ± + - - - + + в + - +м + + в в + +м + - - - в + + - - М,- в в - м,+ - - в +

viswanathii + - + - - - + м в + - + + + в + + + + - - - - + + + -м - - - + - + + м +

zeylanoides - ± + - - - М,- - - - - Мг м,+ М,- м,+ - - м,- + - - - - - - - - - - + - в - - м +

Примечание: Р= рост при 37 °С, П = формирование плёнки или пристеночного кольца при росте на жидкой питательной среде, ПМ = образование псевдомицелия, Л= об-разованиетерминальных хламидоспор, РТ — образование ростковых ьрубок, У-образование уреазы. Ферментация: а-глюкозы, б-галактозы, в-сахарозы, г-мальтозы, д-лактозы, е-трегалозы. Ассимиляция: 1 — глюкозы, 2 — галактозы, 3 — Ь-сорбозы, 4 — сахарозы, 5 — мальтозы, 6 — целлобиозы, 7 — трегалозы, 8 — лактозы, 9 — мелибиозы, 10 — рафинозы, 11 — мелецитозы, 12 — растворимого крахмала, 13-ксилозы, 14 — Ь-арабинозы, 15 — Б-арабинозы, 6- Б-рибозы, 17 - Ь-рамнозы, 18-глицерина, 19 — эритрита, 20-рибита, 21 — галактита, 22 — Б-маннита, 23 — метил-а-О-глюкозида, 24 — салицина, 25 — янтарной кислоты; в-вариабельность, обусловленная штаммовыми различиями (тождественно!); м — медленное усвоение (М+) или не усваивается совсем (М, -); с — слабое усвоение (с+) или отсутствие такового (с-).

ПРОБЛЕМЫ МЕДИЦИНСКОЙ МИКОЛОГИИ. 2009. Т.11. №3

IV. Исследование превентивных мер, упреждающих формирование in vivo разнокачественных по составу и архитектонике биоплёнок.

V. Включить плёнкообразующие микромицеты (в первую очередь — из рода Candida) в качестве первоочередных объектов метобономики — науки

об одномоментном определении многих различных молекул в сложных системах (смесях), например, в крови при определении метаболического статуса пациента.

ЛИТЕРАТУРА

1. Блинов Н.П., Митрофанов В.С., Чернопятова P.M. Аспергиллезная инфекция; подходы к ее диагностике и лечению //Ж. Проблемы медицинской микологии. — 2002. — Т.4, №1. — С. 4-16.

2. Кибалкина С.А., Подольцева Э.И., Бараневич Е.П. и др. Аллогенная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток больному острым лейкозом, перенесшему инвазивный аспергиллез //Ж. Проблемы медицинской микологии. — 2002. - ТА,. №1. — С. 28-30.

3. Васильева Н.В., Блинов Н.П. Микроорганизмы — контаминанты и патогены — индукторы процессов старения больничных зданий и помещений медицинского назначения, а также возбудители некоторых заболеваний людей (учебное пособие). Под ред.Н.П. Блинова. — СПб, 2009. — 224 с.

A, http://microbiology.mtsinai.on.ca/mig/defungi

5. d’Enfert С. and Hube В. Candida: Comparrative and functional genomics. — Publisher Caister Academic Press, 2007. — 428 p.

Поступила в редакцию журнала 28.09.09

Рецензент: А. А. Степанова