CC BY
20
УДК: 616-002.2+616-002-008.953-092+616-097
Ылий P.O., Толстяк Я.Ф.1, Кр{ль 1.И., Немеш Л.В.
АП0ПТ0ТИЧН1 ЗМ1НИ У ГЛ1К0К0НЮГАТАХ ПЛАЗМАТИЧН01 МЕМБРАНИ ПЕРИФЕРИЧНИХ Л1МФ0ЦИТ1В КР0В1 ПРИ СИСТЕМНОМУ ЧЕРВ0Н0МУ В0ВЧАКУ
1нститут бюлоги юмтини НАН Украши, вщдт регуляци прсшферацП' кттин та апоптозу, м. Льв1в, Льв1вський нацюнальний уыверситет ¡м. Д. Галицького, Украша
Порушений taiipeuc апоптотичного Mamepicuiy при системному червоному вовчаку тдукуе екс-понування автоантигетв кл1тинам iMyuuoï системи та сприяе розвитку системнш aemoiMyu-нш eidnoeidi. Ратше ми виявили специф{чт taiimunui noeepxueei глтоконюгати, - маркери апоптозу. Ми також розробили тест лектин-тдукованог аглютинацп для оцтки KWbKocmi апоп-тотичних wiimun. Метою даного досл{дження е оцтка змт у eKcnpeciï поверхневих глтопроте-ïuie л{мфоцит{в периферичног npoei у кл{тчно здорових douopie та пац{ент{в СЧВ, i пор{вняння даних змт з частотою апоптозу у naiçieumie. Кшътстъ апоптичних taiimuu визначали за кон-центращею лектину, що спричиняе аглютинащю taiimun та eidcomKOM taiimuu в cmadiï npe-Gl vuiimuHHOzo циклу (апоптотичт taiimunu), який визначали проточною цитометр{ею. Змти у поверхневих глтопротетах оцтювали лектин-цитох1м1чним анал{зом. При anajiiei апоптичних wiimuH двома незалежними методами спостеркаласъ сильна корелящя (R= 0,764, Р<0,001). Показано, що р{зниця в аглютинацп л{мфоцит{в двох популяцш пов'язана 3i зростанням eidcomKy Kaimuu, ят експонуютъ на свогй поверхт ôazami на галактозу глтопротети. Отже, специф{чт змти у cmpyKmypi кл1тинних поверхневих гл{коконюгат{в можуть ефективно використовува-тисъ nid час визначення апоптозу nid час СЧВ.
Ключов1 слова: апоптоз, mi ко протеши, плазматична мембрана, лектини, системний червоний вовчак.
Вступ
Системний червоний вовчак (СЧВ) - системне авто1мунне порушення, що характеризуеться ба-гатьма клш1чними проявами, в яю втягненш ба-гато оргашв та систем, чий патогенез чи точна етюлопя залишаються невщомими. За ф1зюлопчних умов Hi апоптичний Hi некротичний кл1тинний матер1ал не виявляеться в тканинах оргашзму через швидке видалення високоефек-тивною фагоцитарною системою. У хворих на СЧВ здатнють усувати вщмираюч1 кл1тини з тканин здебтьшого виявляеться порушеною i це може призводити до розладу центрального та допом1жних механ1зм1в толерантносп до влас-них антигешв. Автоантигени, що виявляються в апоптичному та некротичному матер1ал1 розшзнаються сироваткою хворих на СЧВ [1].
Усунення вщмираючих кл1тин регулюеться за допомогою ряду молекул на поверхы кл1тин -«маркер1в апоптозу», найвщомЫ серед них е екстернал1зац1я фосфатидилсерину та цта система молекул розтзнавання фосфатидилсерину ¡мунокомпетентними кл1тинами (у клш1чнш д1агностиц1 для його виявлення використовують рекомбшантний бток анексин V) [1]. P.O. Бтий та P.C. Стойка [2-4], та згодом ¡нша група дослщниш на чол1 з М. Hermann [5-6] описали змши поверхневих глкашв, кот pi позв'язаш з апоптозом, - зростання р1вня a-D-манозо та ß-D-галактозо-вмюних глкопротеТыв. Специф1чш лектини - вуглевод-зв'язуюч1 бтки - були ycniLUHO використаш для визначення змш у cneKTpi глкопротеТшв плазматичноТ мембрани при апоптоз1 [4]. Подалыш дослщження дозволили охарактеризувати та щентифкувати дат mi ко протеши [3, 4]. Явище змши профтю поверхневих miKaHiB при апоптоз1 було використа-
но для виявлення вщмираючих кттин [7] та на його ochobí було розроблено тест лектин-¡ндукованоТ експрес д1агностики апоптозу, «Аг-лютест», що базуеться на аглютинацп кл1тин вщповщним лектином [8]. Перевагою даного тесту е те, що bíh не вимагае для детекци скпад-них прилад1в, на вщмшу вщ використання флуо-ресцентних кон'югат1в аннексину V чи лектишв [3], для виявлення яких потр1бен проточний ци-тометр або флуоресцентний м1кроскоп.
Дана робота описуе використання тесту лек-тинчндукованоТ аглютинацп для визначення поверхневих 3míh пщ час апоптотичноТ юмтинноТ смерт1. Ми оцшили змши у експреси поверхневих miKonpoTe'i'HÍB ( а саме знши p-D-вмюних, тобто, деаалованих глкашв ) у периферичних л1мфоцитах пац1ент1в з СЧВ та ктычно здорових донор1в та пор1вняли ц1 зм1ни з незалежним ви-значенням р1вня апоптотичних кл1тин методом проточно'1 цитометри. Отриман1 дан1 показують зростання píbhíb апоптозу та галактоз-вмютних поверхневих кл1тинних гл1кокон'югат1в у rpyni пац1ент1в з СЧВ у nopiBHHHi з контрольною гру-пою. Кореляц1я м1жданими щодо к1лькост1 апоптичних кл1тин, отримана методами лектин-¡ндукованоТ аглютинацй' та проточно'1 цитофлуориметрП', показала ефективнють лек-тин-стимульовано'|' аглютинацП' для оцшки апоптозу, як kn¡HÍ4Horo тесту.
Матср1али та методи
Обстеженню пщлягали 23 пац1енти з СЧВ ( 3 чоловки та 20 жшок). В1ковий д1апазон пац1ент1в коливався вщ 21 до 72 pokíb. Тривал1сть захво-рювання коливалась вщ 1 до 36 мюяц1в, жоден ¡з пац1ент1в не отримував базисноТ терапП'. Д1агноз СЧВ ставили на ochobí критерив ARA [10], bcí
пац1енти мали позитивы АНА (антинуклеарш антитта) та антитта до с^ОЫА (дволанцюговоТ ДНК). Активнють СЧВ визначалась на основ1 ¡ндекав ступеня активности БЬЕРА! [11] та ВИ_АС-2004 [12]. Контрольну групу складали 18 юпычно здорових донор1в вком 21-23 рош ( 8 чоловшв та 10 жшок ), як1 не хворти гострими або хрошчними захворюваннями за останш 6 мюяц1в.
Отримання л1мфоцит1в периферичноТ кровк Видтення пол1морфоядерних юмтин перифери-чноТ кров1 здшснюють вщповщно до загально-прийнятих лабораторних методик ¡з використан-ням диференцшного центрифугування у град1ен-т1 фкол-верографшу або середовища ЬутрИоРгер (С1Ьсо-ВК1_, США, згщно з ¡нструкцн ями виробника) [13]. Точне визначення густини сумЫ мае критичне значения для чистоти видтення суспензи л1мфоцит1в. Щоразу ретель-но контролювали густину суспензи ареометрами вщповщно'!' точносп. При видтенш суспензи кл1тин контролювали чистоту видтення за до-помогою м1кроскопу, з метою уникнення забруд-нення суспензП' тромбоцитами, як1, завдяки високш схильносп до аглютинаци та утворення згустш, можуть призвести до хибно-позитивних результате чи до випадання осаду кттин.
В уах випадках була отримана письмова згода пац1ент1в на проведенення дослщжень, процедури здшснювались згщно вимог ком1си з бюетики при Льв1ському нацюнальному медичному ушверситет1 ¡м. Д. Галицького, затверджених наказом МОЗ Украши № 314 вщ 24.05.2006 р.
Анал1з лектинчндукованоТ аглютинацП' (Аглю-тест). Аглютинацш кл1тин здшснювали наступ-ним чином: 20 мкп кл1тинноТ суспензП' з 107 кт-
тин/мл додають до 20 мкп розчину лектину (роз-ведення вщ 1000 мкг/мл до 7,8 мкг/мл) у 96-лунковому ¡мунолопчному планшет! й ¡нкубують протягом 30 хв при юмнатнш температур!.
Для цього:
1. У ряд А аглютинацшного планшету вносять 40 мкл/лунку лектину в концентраци 1000 мкг/мл;
2. В ряди В-Н вносять 20 мкл/лунку ф1зюлопчного забуференого ф1зюлопчного розчину;
3. 20 мкл рщини з лунок А переносять у лунки В, дв1ч1 суспензують, пюля чого 20 мкл рщини з лунок В переносять у лунки С \ т.д. до досягнен-ня лунок Н, з яких останш 20 мкл рщини вили-вають. Таким чином забезпечуеться р1вном1рна концентрац1я лектину в уах лунках;
4. В уа лунки ряду (А-Н) вносять по 20 мкл суспензи попередньо вщмитих л1мфоцит1в периферичноТ кров1 в концентраци 20 млн кл ¡тин/мл;
5. Проводять ¡нкубацш упродовж 30 хв при юмнатнш температур!. Використання приладу для автоматичного нахилу планшету (¡з кутом нахилу платформи 7°) прискорюе процес аглютинаци. При необхщносп час ¡нкубаци мож-на збтьшити до 60 хв.
6. Оцшюють мш1мальну концентрацш лектину в кожному ряд1, яка ще здатна викликати помяну аглютинацш юптин. 3 метою спрощення процедури анал1зу автори рекомендують для оцшки ступеня аглютинацП' використовувати поняття «клас аглютинацП» - тобто ту ктькють лунок, в яких спостер1гаеться аглютинац1я. Ця величина обернена до концентраци лектину, необхщноТ для аглютинацП', \ пропорцшна до кшькосп апоп-тичних юмтин у популяци (див. Рис. 1)
Зразки 1-12
/I 2 3 4 5 6 7 8 9 Ю II 12
А0©@©©©©©©©00 В00©©©©©©©©00 с000©©©©©©@00 □0000@©©©©000 Е00000©©©©@00
Р000000©@©©©0
с0000000@©©0© н00000000©0©@
.Пектин, Клас ^ мкг/мл аглютинацП' 1000 1
500 2
250 3
4,125 4
62.5 5 31.25 6
15.6 7 7.8 8
Результата анализ
0 1 2 3 4 5 6 7 а 72 -* Клас аглютинаци
2000' 1000 500 250 125 62,5 31,3 15,6 7,8 15,6 - - Концентрац!я лектину
Рис. 1.1нтерпретаи,1я можливих результат/в при використанн/ тесту лектинчндукованоТ аглютинацП' кл/тин. Стушнь аглютинаци визначають за мтмальною концентрацию лектину, необидною для аглютинацП Стушнь аглютинаци зручшше зазначати як «клас аглютинацП», сп'1вв '1дношення
м'1ж двома величинами зазначено справа.
Примггки: 1 - попередыми дослщженнями нами встановлено, що концентрац1я лектину 2000 мкг/мл аглютинуе практично BCi ¡нтактш кл1тини. 2 - при такому результат! слщ вважати клас аглютинаци «7» та м1н1мальну концентрацш лектину «15,6 мкг/мл», вщсутнють аглютинацП' в однш ¡з лунок, але ТТ наявнють у наступних свщчить про можливе помилкове внесения кшькосп кл1тин, дш випадкових чинниш, тощо. Якщо аглютинац1я вщсутня у двох i бтьше лунках пщряд - анал1з слщ повторити. 3 -аглютинац1я кл1тин за меншоТ' концентрацП' лектину, а ТТ вщсутнють за бтьшоТ концентрацП' свщчить про помилку в приготуванш розведень лектину, внесены ктькосп кттин, тощо; анал1з слщ повторити. 4 - див. п. 3, анал1з слщ повторити.
Для документування результате, планшети сканують при 1200 dpi у трансм1сивному режим1 на сканер!, загалом для документацп результате достатньо звичайного сканування у трансм1сивному режим1 (лампа пщсвпжи знахо-диться над планшетом) на будь-якому вщповщному сканер! при 300 dpi, також можливо фотографувати планшет за допомогою фото-апарату, хоч у цьому випадку не гарантуеться збереження лшшносп зображення.
Лектин-цитох1м1чний анал1з. Лектиноцитох1м1-чний анал1з ¡з використанням ферментативних кон'югат1в лектишв здшснювався як описано ра-шше [2] з деякими змшами. Мазки кл1тин фксували у сумЫ ацетон : метанол : формалш (19:19:2) протягом 90 с при юмнатнш температур! та висушувались на noeiTpi. Мазки ABi4i промивали ТСБ протягом 2 хвилин, пюля чого ¡нкубували ¡з НКР-м1ченими лектинами (50 мкг/мл) протягом 1 години при юмнатнш температур! чи при 4о С протягом ночк За необхщност1 вщповщний вуглеводний ¡нпбпчэр (0,1 М розчин) додававали до ¡нкубацшноТ' сумЫ. Мазки дв1ч1 промивали ТСБ по 10 хв та ¡нкубували з 0,5 мг/мл 3,3'-д1амшобензидином (DAB, Sigma) та 4 мкл/мл Н202 у ТСБ протягом 15 хвилин. У деяких експериментах до ¡нкубацшноТ сумЫ з метою покращення контра-стування кл1тин додавали розчин NiCI2 (кшцева концентрац1я 1 мг/мл). Мазки промивали дис-тильованою водою, висушували на noeiTpi та за потреби заключали у канадський бальзам. Денситометрш вологих препарате проводили за допомогою м1кроскопу Zeiss (Австр1я), облад-наного камерою Nikon (Nikon Corp., Япошя).
Визначення концентрацГ! ДНК ( у npe-G1 ) за допомогою проточно'!' цитометрп. При anonT03i вщбуваеться прогресуюча деградац1я ДНК в кл1тиы, частина ДНК виходить з юмтини, з'являються кл1тини з меншим жж нормальний вм1ст ДНК - з'являеться додатковий niK на цитофлуорограм1 - npe-G1 niK. По кшькосп цих кл1тин визначають р1вень апоптозу.
Суспензш кл1тин (1-2 млн. кл1тин/мл) промивали холодним розчином PBS, а пот1м ресуспен-
зували в 1 мл холодного PBS. В 15 мл кожчноТ' центрифужноТ' про£нрки(або 12x75 мм кругло'!' проб1рки) вортексували 3 мл льодяного 70% етанолу i додавали 1 мл суспензп юмтин в PBS для fx швидкоТ дисперси, пот1м ¡нкубували сум1ш, як м1н1мум, 45 хвилин. При необхщносп застосу-вали ¡нкубацш протягом 12 годин. Кл1тини осад-жували i обережно вщбирали супернатант, ре-суспензуючи його в розчиж PI Master Mix (100мкг/мл PI та 100мкг/мл РНКази в PBS) до концентрацП' 0,5*106 кл1тин/мл. 1нкубували суспензш при 37° С протягом 30 хвилин. Зразки можна збер1гати при 4° С в темной до 3 джв. Анал1з проводився у FCS Express software, верая 3.
Статистичний анал1з. Статистичну обробку отриманих даних проводили у nporpaMi Origin 7 (Microcal, США), вщповщно до загальноприйня-тих алгоритм1в. Денситометричний анал1з, обробку та анал1з м1крофотографш кл1тин здшснювали за допомогою програм ImageJ (Нацюнальний ¡нститут здоров'я, США) та Gel-Pro Analyzer 4.0 (Media Cybernetics, США).
Дослщи проводили у трьох паралелях у кожному BapiaHTi, для лектиноцитох1м1чного анал1зу л1мфоцит1в пац1ент1в - у двох паралелях. Для ycix дослав, що проводились в паралелях, роз-раховували середне значения «М» та середню похибку «т», як1 й представлено на графках та рисунках. Р1вень достов1рност1 отриманих результате встановлювали при р<0,05. В po6oTi використовували три piBHi достов1рност1: *-р<0,05; **-р<0,01; *** р<0,001. При проведенж денситометричного анал1зу робили випадкову виб1рку кл1тин ¡з р1зних частин поля зору та вра-ховували р1вень фонового забарвлення у кожнш частин1 м1крофотографП', при цьому ктькють кл1тин, яку пщдавали анал1зу, для оджеТ' точки даних не була меншою за 50.
Результати та обговорення
Дослщження л1мфоцит1в периферичноТ' Kpoei кл1жчно здорових донор1в показали, що в популяци fx л1мфоцит1в 0.707±0.121 % кл1тин перебувае на стадП' npe-G1 (MiHiMyM - 0.14% i максимум - 2.09%), тобто е апоптичними. Па^енти з СЧВ характеризуються помп"ною змшою(зростанням) кшькосп апоптичних кл1тин (якщо анал1зувати за появою G1 niKy) - 4,47±0.5 % (м1жмальне значения - 0.86% та максимальне значения - 11.65 %) (р1зниця в значениях двох груп - Р<0.001).
TnnoBi д1аграми кл1тинного циклу здорового донора (D) та пац1ент1в хворих на СЧВ (1) та (2), визначеж методом проточно'!' цитофлуориметри, наведеж на Рис 2. У пац1ешчв з СЧВ спостер1гаеться значне зростання кшькосп кл1тин у npe-G1 фаз1 кл1тинного циклу.
В rpyni здорових донор1в значения необхщноТ' концентрацП' лектину для аглютинаци л1мфоцит1в було 1500±121,27 мкг/мл, в той час, коли в rpyni хворих на системний червоний вов-
чак така концентрац1я становила 306,19±128,17 (р1зниця в значениях м1ж дослщними группами становила Р<0.001 ) (таблиця 1). Таким чином, значения необхщноТ концентраци лектину м1ж двома дослщними трупами вщр1зняються майже в 5 раз1в, що може бути викликано 2 причинами: 1. зростання загального р1вня зв'язування лектину кл1тинами популяцп; 2. зростання кшькосп кл1тин, як1 специф1чно зв'язують лектин. Для дослщження мехашзм1в мазки перифершноТ кров1 дослщжували за методом
лектиноцитох1ми, використовуючи при цьому лектин УАА з наступним м1крофотографуванням та денситометричним анал1зом, який показав, що основне забарвлення в контрольнш груш становило 0,153±0,013 од., а в груш хворих на системний червиний вовчак було 0,144±0,01 од. без значних якюних вщмшностей м1ж популяц1ями кл1тин, в той же час ктькють ¡нтенсивно забарвлених юмтин в обох популяц1ях значно вщр1знялася (таблиця 1).
ргеС1
1
Л.
ргеС1
Л.
О-О,12% 1 - 2,37% 2 - 3,44%
Рис.2. Визначення л'шфоцит'т периферийно!'крое/ в стадн пре-С1 кл1тинного циклу методом проточно)' цитофлуориметрп. О - здоровий донор, 0.12% апоптичних кл'ппин; 1,2- л/мфоцити пери-ферично'Укров! пац1снт1в з СЧВ, 2.37 % та 3.44% апоптичних кл1тин в'1дпов'1дно, анал1з шляхом
фарбуванням прошдШ йодидом.
Таблиця 1
Ктьюсть апоптичних кл1тин / зм/ни в гл'1кокон'югатах плазматично'У мембрани л'мфоцит'т
КЛ1Н1ЧН0 здорових донор'т / хворих на СЧВ.
Здоров1 донори, п=18 Хвор1 на системний червоний вовчак, п=15 Р
% апоптичних кл1тин1 0,707 ±0,121% 3,657 ± 0,505 % р<0,001
Аглютинац1я2 1,500 ± 121,27 мкг/мл 306,19±128,17 мкг/мл р<0,001
Основне УАА зафарбовування3 0,153 ±0,013 од. 0,144±0,01 од. 0,061
% УАА зафарбованих кл1тин 4,783 ± 0,936 % 8,27± 1,30 % р<0,05
1 - даш, виходячи з/ значень пре -С1кл1тин, визначеш методом проточноГ цитофлуориметрп
2 - визначення проведено за методом лектиншдуковано)' аглютинацп
3 - визначення проведено методом лектиноцитохШ(
У вах хворих (¡з 23 проанал1зованих) авто1му-нне захворювання - системний червоний вовчак - супроводжувались збтьшенням кшькосп апоптичних кл1тин та досягало значень, що значно (1-20 %) перевищують таку Тх ктькють у здорових донор1в л1мфоцит1в.
Отже, ми дшшли висновку, що р1зниця в аглютинацп л1мфоцит1в двох популяцш пов'язана з1 зростанням вщсотку кттин, як1 експонують на своТй поверхы багат1 на галактозу гл1 ко протеши.
Кореляцшний анал1з кшькосп апоптичних клн тин за методом проточно'!' цитофлуориметрп \
мш1мальноТ концентраци лектину, необхщноТ для аглютинацп кл1тин, визначеноТ' тестом лек-тинчндукованоТ' аглютинацп, показав сильну не-гативну кореляцш м1ж цими двома показниками (К=- 0,764, Р<0,001, див. рис 3). Осктьки конце-нтрац1я лектину е обернено пропорцшною до кн лькосп апоптичних кл1тин в популяцп', м1ж кшьм-стю апоптотичних кл1тин визначена тестом лек-тинчндукованоТ' аглютинацп та вщсотком юмтин в стадП' пре-С1 кл1тинного циклу спостер1галась сильна кореляц1я (К=0.7638).
12-
10"
Г
г Хвор! на СЧВ • Здоров! донори
R=-0,76383
О 6-
0) о. с
С Г"
16
r»t »■ 64
128
512 1024 2048
VAA, цд/ml
Рис 3. КореляцШний анал1з м'т концентрацию пектину, необидною для аглютинаци л'шфоцит 'т, та eidcomKOM апоптичних кл/тин. Концентрац/'я пектину е обернено пропорцШна до ктькостi апопти-
чних KnimuH.
Висновки
Дослщження л1мфоци"пв xpoBi 23 па^енгпв з СЧВ та 18 юпычно здорових донор1в показало зростання частоти апоптозу л1мфоцит1в у патенте з СЧВ. Вщсоток апоптичних кл1тин визначи-ли двома незалежними методами - за появою npe-G1 niKy, що детектувався проточною цито-метр1ею та концентрац1ею лектину, необхщною для аглютинаци кттин, що визначався лектин-¡ндукованою аглютинац1ею. М1ж даними, отри-маними двома методами, спостер1галась сильна кореляц1я. Таким чином, лектинчндукована аг-лютинац1я може використовуватись як надшний та простий метод для оцшки апоптозу пщ час СЧВ та в1ропдно i при ¡нших авто1мунних хворобах.
Лпсратура
1. Munoz L.E. SLE - a disease of clierence deficiency ? / L.E.Munoz, U.S.Gaipl, S.Franz [et al.] // Rheumatology. - 2005,- V. 44, №9. -P. 1101-1107.
2. Bilyy R.O. Lectinocytochemical detection of apoptotic murine leukemia L1200 cells / R.O. Bilyy, R.S.Stoika // Cytometry A .- 13 2003,- V.56.- P. 89-95.
3. Bilyy R. In vivo expression and characteristics of novel alpha-D-mannose-rich glycoprotein markers of apoptotic cells /R.Bilyy, Y.Kit, U Hellman [et al.] // Cell Biol. Int.- 2005,- V.29.- P. 920-928.
Реферат
АПОПТОТИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ У ГЛИКОКОНЪЮГАТАХ ПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЫ ПЕРИФЕРИЧЕСКИХ ЛИМФОЦИТОВ КРОВИ ПРИ СИСТЕМНОЙ КРАСНОЙ ВОЛЧАНКЕ Билий Р.А., Толстяк Я.Ф., Криль И.Й., Немеш Л.В.
Ключевые слова: апоптоз, гликопротеины, плазматическая мембрана, лектини, системная красная волчанка.
Нарушенный клиренс апоптического материала при системной красной волчанке индуцирует экспонирование автоантигенов клеткам иммунной системы и содействует развитию системному автоиммунному ответу. Ранее мы обнаружили специфические клеточные поверхностные гликоконьюганты, -маркеры апоптоза. Мы также разработали тест лектин-индуцированной агглютинации для оценки ко-
9.
10.
11.
12.
Bilyy R. AMID: new insights on its intracellular localization and expression at apoptosis / R.Bilyy, Y.Kit, U Hellman [et al.] // Apoptosis.- 2008. - V. 13. - P. 729-732.
Hermann M. Lectins detect changes of the glycosylation status of plasma membrane constituents during late apoptosis / M.Hermann, J.R.Kalden, R.E.Voll // Cytometry A.- 2006,- V.69.- P. 230-239. Hermann M. After shrinkage apoptotic cells expose internal membrane-derived epitopes on their plasma membranes / M.Hermann, H.M.Jack, J.R.Kalden [et al.j // Cell Death. Differ.-2007,- V.14.- P. 733-742.
Bilyy R. Utilization of GaN: Eu3+ nanocrystals for the detection of programmed cell death / R. Bilyy, M.Nyk, R.Stoika [et al.] // Physika E: Low-dimensional Systems and Nanostructures.- 2008,- V.40.-P.2096-2099.
Stoika R.S. Agglutination-based method for fast detection, isolation and quantification of apoptotic cells / R.S.Stoika, R.O.Bilyy, V.O. Antonyk. In WO.- 2007,- 053654 USA, UA; 2006,- P.1-85. Bilyy R. Search for novel cell surface markers of apoptotic cells / R.Bilyy, R.Stoika. // Autoimmunity.- 2007,- V.40.- P. 249-253. Hochberg M.C. Updating the American College of Rheumatology revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus / M.C.Hochberg // Arthritis and Rheum.- 1997,-V.40.- P. 1725-1734.
Bompardier C. Derivation of the SLEDAI. A disease activity index for lupus patients / C.Bompardier, D.D.GIadman, M.B.Urowitz [et al.] //Arthritis Rheum.- 1992,- V.6.- P. 630-640. Isenberg D.A. BILAG 2004. Development and initial validation of an updated version of the BILAGs disease activity index for patients with systemic lupus erythematosus / D.A.Isenberg, A.Rachman, E.Allen [et al.] // Rheumatology.- 2005,- V.44.- P. 902-906. Сибирная H.A. Метод фракционирования клеток костного мозга в градиенте плотности смесей фикола и верографина / H.A.Сибирная, Б.Ф.Сухомлинов, М.В.Хмиль // Лаб. дело. -1991,- №4,-С. 24-25.
личества апоптических клеток. Цель данного исследования - оценка изменения в экспрессии поверхностных гликопротеинов лимфоцитов периферической крови у клинически здоровых доноров и пациентов СЧВ и сравнение этих изменения с частотой апоптоза у пациентов. Количество апоптичних клеток определяли по концентрации лектина, который индуцирует агглютинацию клеток, и процентом клеток в стадии npe-G1 клеточного цикла (апоптические клетки), который определяли проточной ци-тометрией. Изменения в поверхностных гликопротеинах оценивали лектин-цитохимическим анализом. При анализе количества апоптических клеток, определенных двумя независимыми методами, наблюдалась сильная корреляция (R=0,764, Р<0,001). Показано, что разница в агглютинации лимфоцитов двух популяций связана с ростом процента клеток, которые экспонируют на своей поверхности богатые на галактозу гликопротеины. Следовательно, специфические изменения в структуре клеточных поверхностных гликоконъюгатов могут эффективно использоваться для определения апоптоза при СЧВ.
Summary
APOPTOSIS-RELATED CHANGES IN PLASMA MEMBRANE GLYCOCONJUGATES OF PERIPHERAL BLOOD LYMPHOCYTES IN SYSTEMIC LUPUS ERYTHEMATOSUS Bilyy R.O., Tolstyak Ya.F., Kril I.J., Nemesh L.V.
Key words: apoptosis, glycoproteins, plasma membrane, pectin, systemic lupus erythematosus (SLE)
Impaired clearance of apoptotic cells during systemic lupus erythematosus provokes exposure of auto-antigens and contributes to the development of systemic autoimmune response. Recently, we found out specific cellular superficial glyconjugates which may be regarded as apoptosis markers. We also developed lectin-induced agglutination test for evaluating the amount of apoptotic cells. The aim of current study was to estimate the changes in surface glycoprotein expression in peripheral blood lymphocytes of clinically healthy donors and SLE patients, and to compare these changes with apoptosis incidence in those patients. Changes in superficial glycoproteins were estimated on the basis of cell agglutination by galactose-specific VAA lectin, as well as on the results of lectin-cytochemical analisis. Besides of it, the amount of pre-G1 (apoptotic) cells was controlled by flow cytometry. The obtained data revealed an increased apoptotic level in SLE patients. A strong correlation (R=0,764, P<0,001) was observed between these two parameters. Thus, specific changes in cell surface glyconjugate pattern can by effectively used for the detection of apoptotic cells during SLE.
УДК 591.39 + 616.36-002 + 591.4 + 615.065 + 615.244 Вадюк P.Л., Дельцова О.I., Перцович В.M.
ЕЛЕКТР0НН0М1КР0СК0П1ЧНА БУДОВА С ГЛАВКИ П1Д Д1ЕЮ ЦИСПЛАТИНУ ТА N КОРЕКЦМ ЕНТЕРОСГЕЛЕМ
ДВНЗ "1вано-Франшський нацюнальний медичний ушверситет", 1вано-Франшськ, УкраТ'на
Цисплатин вводили 30 бшим дорослим щурам (I група) внутр{шнъоочеревинно в doei 2 мг/кг ма-си один раз на тижденъ протягом 9 тижнгв (контрольна група - введения ф{зюлог{чного розчи-ну, 1,5 мл, 24 щури). Ентеросгелъ отримували 30 тварин (II група), внутр{шнъошлунково по 0,7 г дiiouoï речовини протягом 14 duie теля останнъого введения цисплатину (контрольна група -введения дистилъованог води, 24 тварини). Mamepian забирали на 1-у, 3-ю, 7-у, 14-у, 21-у та 28-у доби теля останнъого введения ЦП. У динамщ1 експерименту в першш zpyni eid 1-ï до 28-ï di6 найвиразтиы змти електронномтроскотчног будови KfiimuH cimKieKU спостеркалися протягом 7 di6 (некроз i апоптоз фоторецепторних KfiimuH, дистроф{чт змти бтолярних i ганглюнар-них нейронов). Bid 14-ï доби в Knimuuax нейронного ланцюга cimKieKU зменшувався набряк i дис-троф{чт прояви. Нормал{заци стану KfiimuH cimKieKU до 28-ï доби не виявилося. При 6ioxiMiu-ному досл{жент сироватки Kpoei визначалося пог{ршення стану антиоксидантног системи i посилення aKmueuocmi процесгв перекисного окисления л{тд{в. Шд впливом ентеросгелю ультраструктура Kaimuu cimKieKU вiднoвлювaлacя nid час його введения протягом 14 di6 i тдтримува-лася стабшъною до 28 di6. Водночас вiдбyвaлacя нopмaлiзaцiя показникгв системи перекисного окисления лiniдiв i антиоксидантного захисту.
Ключов1 слова : атмвка, ультраструктура, цисплатин, ентеросгель.
XiMionpenapaTH на ochobî платинових дезоргашзуе кл1тинний цикл, процеси комплекав широко застосовуються в лкуванш прол1фераци i активуе апоптоз. Пошкодження онкохворих. Вщомо, що цисплатин впливае на бшш, кттинного транспорту i кальц1евого го-транскрипцшш процеси в ядр1, пошкоджуе ДНК, меостазу, кл1тинного метабол1зму е ланками
* Фрагмент НДР 1вано-Франк1вського нацюнального медичного университету "Морфо-функцюнальний стан оргажв травно!', центрально!' та перифермно!' нервово!' систем за умов впливу малих доз рад1аци i токсичних факторщ (пестициди, кадмш, XiMionpenapaTH), (№ держреестрацм 0102U001009)
