CC BY
50УДК 616.637:579.864:615.015.8:614.2
антибиотикорезистент-ность энтеробактерий,
выделенных из
мочи пациентов
многопрофильного
стационара
1Козлова н.с. (доцент кафедры)*, 2Баранцевич н.Е. (н.с.), 2 иванова л.В. (н.с.), 2гоик В.г. (с.н.с.), 2 баранцевич Е.П. (зав. цнил)
1 Северо-Западный государственный медицинский университет имени И.И. Мечникова (кафедра медицинской микробиологии); 2 Северо-Западный Федеральный медицинский исследовательский центр, Санкт-Петербург, Россия
© Коллектив авторов, 2015
Методом серийных разведений определена чувствительность к 16 антибактериальным препаратам 204 штаммов энтеробактерий, выделенных из мочи пациентов многопрофильного стационара. Отмечали большое разнообразие спектров антибиотикорезистентно-сти энтеробактерий с высоким удельным весом полирезистентных культур. Наибольшую активность в отношении энтеробактерий в данном стационаре проявляли карбапенемы. Фосфомицин, амикацин и ингибиторзащищенные пенициллины сохраняли активность в отношении эшерихий. У штамма Klebsiella pneumoniae, устойчивого к карбапенемам, выявили карбапенемазу NDM-1.
Ключевые слова: антибактериальные препараты, антибиотико-резистентность, карбапенемаза NDM-1, клебсиеллы, моча, энтеро-бактерии, эшерихии
resistance to antibiotics in enterobacteriaceae, isolated from urine in a multidisciplinary medical centre
1Kozlova N.s. (assotiate professor of the chair), 2Barantsevich N.E. (scientific collaborator), 2ivanova L.v. (scientific collaborator), 2Goik v.G. (senior scientific collaborator), 2 barantsevich E.P. (head of scientific research laboratory)
1 North-West State Medical University named after I.I. Mechnikov (Chair of Medical Microbiology); 2 North-West Federal Medical Research Centre, St. Petersburg, Russia
© Collective of authors, 2015
Minimal inhibitory concentrations (MIC) of 16 antibiotics were studied in 204 strains of Enterobateriaceae isolated from urine of patients in a multidisciplinary medical center. The high ratio of multidrug resistance (MDR), as well as numerous spectra of resistance, were evaluated. Sensitivity to carbapenems was observed in the majority of Enterobacteriaceae. Fosfomycin, amikacin and inhibitor-protected penicillins retained the activity against Escherichia coli. Resistance to carbapenems in Klebsiella pneumoniae strain was associated with the presence of NDM-1 gene.
Key words: antibiotics, Enterobacteriaceae, Escherichia, Klebsiella, NDM-1 carbapenemasе, resistance to antibiotics, urine
введение
В настоящее время энтеробактерии являются одними из наиболее часто встречающихся возбудителей как внебольничных, так и нозокомиальных инфекций разной локализации, в том числе инфекций мочевы-водящих путей [1-3]. При госпитальных инфекциях энтеробактерии по актуальности делят 1-2 места со стафилококками [1, 4-6]. Среди возбудителей инфекций мочевыводящих путей (ИМП) превалируют Escherichia coli (до 70-95% при неосложненных ИМП), Klebsiella spp., Enterobacter spp., Proteus spp. [1, 2], при этом для энтеробактерий характерна устойчивость к антибиотикам разных групп [6-8]. Ведущим механизмом резистентности к бета-лактамным антибиотикам у энтеробактерий является выработка бета-лактамаз расширенного спектра (БЛРС), а также карбапенемаз, гены которых локализуются на плазмидах и способны передаваться при внутривидовой, межвидовой и, даже, межродовой передаче. При этом микроорганизмы отличаются ассоциированной резистентностью к другим антибиотикам: гентамицину - до 80%, ципрофлокса-цину - 40-60% [1]. Так, при исследовании 573 штаммов энтеробактерий из 25 стационаров 18 городов России в 2011-2012 гг. продукция БЛРС была обнаружена у 78,2% всех изолятов, в том числе - у 90,6% Klebsiella pneumoniae и у 82,1% E. coli [4].
В силу сложных механизмов устойчивости и формирования полирезистентных штаммов выбор адекватного режима антибиотикотерапии нозокомиаль-ных инфекций, вызванных энтеробактериями, представляет определенные сложности [8, 9]. Учитывая высокий уровень резистентности энтеробактерий к антимикробным препаратам разного механизма действия и его выраженную вариабельность в различных регионах, очень важным представляется изучение антибиотикорезистентности этих микроорганизмов, особенно - выделенных в многопрофильных стационарах [9], что и было целью нашего исследования.
материалы и методы
В 2011-12 гг. в многопрофильном стационаре г. Санкт-Петербурга из мочи пациентов с инфекциями мочевыводящих путей были выделены 204 штамма энтеробактерий, в том числе: 124 культуры Escherichia coli, 65 штаммов Klebsiella pneumoniae, 11 культур En-terobacter spp. и по 2 штамма Proteus mirabilis и Morganella morganii (Рис.1).
Контактное лицо: Козлова Надежда Сергеевна, Тел.: (812) 543-19-20
Рис. 1. Удельный вес энтеробактерий в моче пациентов многопрофильного стационара
Идентификацию этиологически значимых микроорганизмов осуществляли фенотипически и по последовательности первых 500 пар нуклеотидов гена 16SPHK [10]. Определение чувствительности выделенных чистых культур энтеробактерий к антибактериальным препаратам проводили методом серийных разведений в агаре Мюллер-Хинтон с диапазоном концентраций от 0,06 мкг/мл до 128 мкг/мл [11].
Была определена чувствительность всех штаммов к 16 антибактериальным препаратам: ампициллину (Ap), цефотаксиму (Ctx), цефепиму (Cpm), цефиксиму (Cfx), цефтриаксону (Cta), комбинациям амоксицил-лин / клавуланат (Am/cl), пиперациллин / тазобактам (Pi/tz), цефоперазон / сульбактам (Cfp/sb), ципроф-локсацину (Cip), моксифлоксацину (Mox), имипенему (Im), меропенему (Mer), эртапенему (Ert), гентами-цину (Gm), амикацину (Ak), фосфомицину (Fm). Использовали референтные штаммы E. coli АТСС 25922, E. coli АТСС 35218. Определение категорий чувствительности на основании полученных МИК проводили в соответствии с рекомендациями European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (2013) [11]. Полученные данные обрабатывали статистически с помощью пакета прикладных программ SPSS Statistics 17.0 (США) [Гланц C. Медико-биологическая статистика. - М., 1999]. Для фенотипического выявления карба-пенемазной активности применяли модифицированный тест Ходжа. Детекцию генов карбапенемаз (KPC, NDM, OXA-48, VIM. IMP) осуществляли с использованием отечественных наборов методом полимераз-ной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени. Для точного определения выявленного гена исследовали последовательность нуклеотидов гена, отвечающего за продукцию карбапенемазы [12].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Большая часть изученных культур (75,0%) оказались устойчивы хотя бы к одному антибактериально-
му препарату. Отметим, что удельный вес резистентных культур среди штаммов, выделенных из мочи, был ниже, чем среди культур энтеробактерий, выделенных в этот же промежуток времени в данном стационаре из респираторного тракта (94,6%) [13]. Чувствительными ко всем препаратам были обе культуры протея, высокий удельный вес чувствительных ко всем препаратам штаммов был выявлен у Б.еоН (39,5%). Все культуры клебсиелл и морганелл были устойчивы хотя бы к одному антибиотику.
Среди энтеробактерий превалировали культуры, устойчивые к ампициллину (72,5%), ципрофлоксацину и моксифлоксацину (по 42,2%). Более трети штаммов были устойчивы к цефалоспоринам III (по 38,2%) и IV (34,8%) поколения (Рис. 2).
В большом международном исследовании в 2011 г. из 76596 штаммов энтеробактерий, выделенных в 28 странах, устойчивыми к цефалоспоринам III поколения оказались 13,3% [14], достигая 52% при инфекциях кровотока [15]. За период с 2008 по 2011 гг. в большинстве стран наблюдали выраженное увеличение удельного веса устойчивых к цефалоспоринам III поколения культур, и ни в одной стране не отмечали снижения количества таких штаммов среди энтеробактерий. При этом широкое использование цефало-споринов, помимо роста резистентности к ним самим, сопровождалось селекцией и распространением полирезистентных БЛРС-продуцирующих энтеробактерий (концепция «параллельного ущерба») [2, 16].
Почти треть выделенных культур оказалась устойчива к амоксициллин / клавуланату (31,9%) и ген-тамицину (30,9%). Несколько большую активность проявляли комбинации пиперациллин / тазобактам (21,6% устойчивых культур) и цефоперазон / сульбак-там (17,6%), а также амикацин (резистентность 18,1%). Наиболее активными в отношении энтеробактерий оказались фосфомицин (7,3%) и карбапенемы.
Рис. 2. Устойчивость энтеробактерий к антимикробным препаратам
Отметим, что широкое использование карбапене-мов в качестве препаратов стартовой эмпирической терапии обеспечивает селекцию штаммов энтеробак-терий, продуцирующих карбапенемазы [17]. В то же время удельный вес устойчивых к ним энтеробактерий остается невысоким. Так, в 2011 г. из 73920 штаммов энтеробактерий, выделенных в 28 странах, устойчивыми к карбапенемам были только 1,8%, причем большинство устойчивых культур было выявлено в Греции [14]. Устойчивость к цефалоспоринам III поколения и карбапенемам является маркером полирезистентности энтеробактерий [15]. Считают, что в России практически отсутствует резистентность энтеробактерий к карбапенемам [9, 18], однако в настоящее время такие штаммы уже регистрируют в разных регионах России [19], в том числе в данном многопрофильном стационаре [12]. Среди энтеробактерий, выделенных в стационаре, 6,4% были устойчивыми к эртапенему, только 1 штамм клебсиеллы (0,5%) был устойчив к имипенему и меропенему. Большинство устойчивых к карбапенемам культур - K. pneumoniae (84,6%), удельный вес резистентных к эртапенему культур среди них составил 16,9%.
Наибольшую устойчивость к антимикробным препаратам среди энтеробактерий в данном стационаре проявляли штаммы клебсиелл (Рис.2). К большинству изученных антимикробных препаратов удельный вес устойчивых культур этих микроорганизмов колебался в диапазоне от 38,5% до 100%. Наибольшую активность в отношении клебсиелл проявляли карбапене-мы, особенно - имипенем и меропенем, к которым выявили только одну резистентную культуру (1,5%). Данный полирезистентный штамм K. pneumoniae оказался устойчивым к 15 из 16 изученных нами антимикробных препаратов и проявлял чувствительность только к фосфомицину. При дополнительном определении чувствительности культуры еще к пяти антибиотикам установили ее чувствительность к азтреонаму, коли-стину, тетрациклину, доксициклину и тигециклину.
С помощью модифицированного теста Ходжа выявили у штамма карбапенемазную активность, далее методом ПЦР и последующего сиквенирования по Сэнгеру был обнаружен ген NDM-1 [12]. Обнаружение в многопрофильном стационаре K. pneumonia - продуцента карбапенемазы является опасным прогностическим признаком, требующим строгого контроля для препятствия распространения устойчивости к карба-пенемам.
В отношении энтеробактера и E.coli также наиболее активными были карбапенемы, определенную активность сохранил амикацин (18,2% устойчивых штаммов энтеробактера и 5,6% E. coli), для кишечной палочки характерной осталась чувствительность к фосфомицину, к которому отмечали только одну устойчивую культуру (0,8%). Показано, что резистентность E. coli к этому препарату со временем меняется очень незначительно и во всем мире обычно не превышает 5%, что, возможно, связано с особенностями механизма его действия, препятствующими развитию к нему устойчивости [2]. К преимуществам препарата можно отнести отсутствие перекрестной устойчивости с другими антимикробными препаратами и доказанное предупреждение также адгезии возбудителя к эпителию мочевыводящих путей, что делает фосфоми-
цин по-прежнему актуальным для лечения инфекций мочевыводящих путей [2].
Безусловный интерес представляет ассоциированная устойчивость энтеробактерий к разным антимикробным препаратам, которая приводит к формированию полирезистентных и панрезистентных штаммов. В нашем исследовании ассоциированная устойчивость к цефалоспоринам и гентамицину составила 28,9%, к цефалоспоринам и фторхинолонам - 31,4%, что снижает ценность использования данных комбинаций для терапии инфекций, вызванных энтеробактериями. В определенной части случаев, в связи с гиперпродукцией БЛРС в отношении энтеробактерий, неэффективны и ингибиторзащищенные бета-лактамы - до 40,5% [1]. В нашем исследовании ингибиторзащищен-ные бета-лактамы не обладали высокой активностью в отношении энтеробактерий, устойчивость к амоксил-лину-клавуланату составила 31,9%, к пиперациллин / тазобактаму - 21,6% и цефоперазон / сульбактаму - 17,6%. Отметим, что 18,6% культур энтеробактерий имели ассоциированную устойчивость к цефалоспо-ринам, производным фторхинолонов, аминогликози-дам и ингибиторзащищенным пенициллинам.
На рисунке 3 видно, что среди энтеробактерий чаще выявляли штаммы, устойчивые к одному (20,6%) антимикробному препарату. Значительно реже наблюдали культуры, устойчивые к трем и двенадцати (по 7,4%), десяти (6,4%) и восьми, девяти (по 5,4%) препаратам. Наибольшее разнообразие сочетаний устойчивости отмечали у клебсиелл.
Рис. 3. Сочетанная устойчивость энтеробактерий к антимикробным препаратам
Почти половину выделенных культур составили полирезистентные (устойчивые к 3 и более препаратам разного механизма действия) штаммы (43,1%). Их удельный вес был равен удельному весу полирезистентных энтеробактерий, выделенных в этот же промежуток времени в данном стационаре из респираторного тракта (42,3%) [13], и различался у разных родов энтеробактерий (Рис. 4). Максимальное количество таких культур обнаружили среди клебсиелл (67,7%). Самым низким удельный вес полирезистентных культур оказался среди E. coli (29,8%).
неллы, клебсиеллы и морганеллы. Только два спектра встречались у трех родов энтеробактерий (к Ap и Ap, Am, Cl).
Рис. 4. Полирезистентные штаммы энтеробактерий
Всего у энтеробактерий было выявлено 46 спектров антибиотикорезистентности, наиболее распространенным среди них была моноустойчивость к ампициллину (20,6%). Значительно реже встречались следующие по распространенности спектры резистентности - к Ар, ар, Мох, (5,9%) и Ар, Срт, аа, СЙ, С&, Ат/с1, Р1/1г, 5£р/зЬ, От, Ак, С1р, Мох (3,9%). В целом, штаммы с десятью спектрами (Рис. 5), вместе составили почти половину изученных культур (46,5%). Остальные 36 спектров были представлены единичными штаммами и составили вместе менее трети изученных культур (28,5%).
Наиболее разнообразными спектры антибиотикорезистентности оказались у клебсиелл (29 спектров); у эшерихий отмечали 27 спектров, у энтеробактера - 7. Наиболее распространенным спектром устойчивости среди эшерихий, клебсиелл и энтеробактера была моноустойчивость к ампициллину, которая является природной только для клебсиелл (18,5%, 21,5% и 45,5% соответственно), но в остальном роды энтеробактерий различались по типам резистентности. Так, вторым и третьим по распространенности у эшерихий были спектры устойчивости к трем (Ар, С1р, Мох - 6,5%) и семи (Ар, С1р, Мох, Срт, 0:а, СЙ, Ох - 4,0%), а у клебсиелл - к двенадцати (Ар, Срт, С:а, СЙ, Ох, Ат/с1, Р1/ :г, Бф^Ь, От, Ак, С1р, Мох - 10,8%) и десяти (Ар, Срт, аа, СЙ, Ох, Ат/с1, РМг, БГр^Ь, От, Ак - 9,2%).
Рис. 6. Спектры антибиотикорезистентности E. coli
Рис. 5. Спектры антибиотикорезистентности энтеробактерий
Спектры резистентности, наиболее характерные для клебсиелл и эшерихий, представлены на рисунках 6 и 7. Отметим, что из сорока шести спектров устойчивости тринадцать обнаруживали только у эшерихий, пятнадцать - только у клебсиелл, один - только у энтеробактера. В то же время, десять спектров резистентности были общими для эшерихий и клебсиелл, пять - для E. coli и энтеробактера, четыре - для клебсиелл и энтеробактера и по одному - для эшерихий и морга-
Рис. 7. Спектры антибиотикорезистентности K. pneumoniae
Разнообразие спектров антибиотикорезистентности обусловлено высокой гетерогенностью циркулирующих в стационаре энтеробактерий, что дает возможность предположить отсутствие широкого распространения в данном стационаре госпитальных штаммов энтеробактерий.
выводы
1. Среди энтеробактерий, выделенных из мочи в многопрофильном стационаре, превалировали анти-биотикорезистентные культуры с высоким удельным весом полирезистентных штаммов (43,1%), которые чаще отмечали среди клебсиелл (67,7%) и энтеробактера (45,5%).
2. Наибольшую активность в отношении энтеро-бактерий проявляли карбапенемы, особенно имипи-нем и меропенем, к которым была выявлена только одна устойчивая культура K. pneumoniae. В отношении эшерихий сохраняли активность фосфомицин, к которому обнаружили только один устойчивый штамм, амикацин и ингибиторзащищенные пенициллины.
3. Устойчивость к карбапенемам штамма K. pneumoniae была обусловлена продукцией карбапеменазы NDM-1 и сочеталась с полирезистентностью к фтор-хинолонам и аминогликозидам. Культура проявляла чувствительность к фосфомицину, доксициклину, ти-гециклину, азтреонаму, колистину и хлорамфениколу. Выявление в стационаре продуцентов новых карбапе-немаз является опасным прогностическим признаком, подтверждающим неблагоприятную глобальную тен-
денцию распространения устойчивости к карбапене-мам.
4. Вариабельность устойчивости энтеробактерий к антимикробным препаратам и появление опасных для
распространения генов резистентности штаммов подтверждает необходимость проведения постоянного мониторинга антибиотикорезистентности микроорганизмов с анализом механизмов их устойчивости.
ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА
1. Сидоренко С.В. Микроорганизмы семейства Enterobacteriaceae: клиническое значение и этиотропная терапия// Consilium Medicum. - 2004. - Т. 6, №1. - С. 23-26.
2. КозловР.С., ГолубА.В. Выбор антимикробных препаратов при неосложненных инфекциях мочевых путей: как принять соломоново решение?// Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2014. - Т. 16, №1. - С. 18-25.
3. Рябкова Е.Л., Иванчик Н.В., Сухорукова М.В. и др. Резистентность нозокомиальных штаммов Escherichia coli в стационарах России// Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2009. - Т. 11, №2. - С. 161-169.
4. Сухорукова М.В., Эйдельштейн М.В., Склеенова Е.Ю. и др. Антибиотикорезистентность нозокомиальных штаммов Enterobacteriaceae в стационарах России: результаты многоцентрового эпидемиологического исследования МАРАФОН в 2011-2012 гг.// Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2014. - Т. 16, №4. - С. 254-265.
5. Решедько Г.К., Рябкова Е.Л, Кречикова О.И. и др. Резистентность к антибиотикам грамотрицательных возбудителей нозокомиальных инфекций в ОРИТ многопрофильных стационаров России// Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2008. - Т. 10, №2. - С. 96-112.
6. Решедько Г.К., Щебников А.Г., Морозов М.В. и др. Escherichia coli как возбудитель нозокомиальных инфекций в ОРИТ// Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2012. - Т. 13, №4. - С. 314-321.
7. Руднев В.А., Бельский Д.В., Дехнич А.В. Инфекции в ОРИТ в России: результаты национального многоцентрового исследования// Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2011. - Т. 13, №4. - С. 294-303.
8. Яковлев С.Я. Госпитальные инфекции, вызванные резистентными грамотрицательными микроорганизмами: клиническое значение и современные возможности терапии// Инфекция и антибактериальная терапия. - 2004. - Т. 6, №4. - С. 48-56.
9. Стратегия и тактика применения антимикробных средств в лечебных учреждениях России. Российские национальные рекомендации. - М., 2012. - 92 с.
10. Пестова Н.Е., Баранцевич Е.П., Рыбкова Н.С. и др. Изучение эффективности применения метода секвенирования ДНК по фрагменту гена 16s рРНК для идентификации микроорганизмов// Профилактическая и клиническая медицина. -2011, №4. - С. 57-59.
11. EUCAST-(2013) - [Электронный ресурс] - Режим доступа: http://www.eucast.org/clinical_breakpoints/
12. Barantsevich E.P., Churkina I.V., Barantsevich N.E., et al. Emergence of Klebsiella pneumoniae producing NDM-1 carbapen-emase in Saint Petersburg, Russia// J. Antimicrob. Chemother. - 2013. - Vol. 68, №5. - Р. 1204-6. doi: 10.1093/jac/dks503. Epub 2013 Jan 12.
13. Козлова Н.С., Баранцевич Е.П., Баранцевич Н.Е., Гоик В.Г. Антибиотикорезистентность энтеробактерий в стационаре// Научное обозрение. - 2014, №8. - С. 992-998.
14. Antimicrobial resistance surveillance in Europe Annual report of European Antimicrobial resistance surveillance network (EARS-net), 2011. - Stockholm: ECDC, 2012. - 79 p.
15. The bacterial challenge: time to react ECDC/EMEA joint technical report. - Stockholm: ECDC, 2009. -42 p.
16. Козлов Р.С. Селекция резистентных микроорганизмов при использовании антимикробных препаратов: концепция «параллельного ущерба»// Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2010. - №12. - С. 284-94.
17. Risk assessment on the spread of carbapenemase-producing Enterobacteriae (CPE) through patient transfer between healthcare facilities? With special emphasis on cross-border transfer. - Stockholm: ECDC, 2011. - 63 p.
18. Научный отчёт о результатах многоцентрового исследования этиологии и антибиотикорезистентности энтеробактерий - возбудителей осложнённых интраабдоминальных инфекций в России. НИИ антимикробной химиотерапии. - Смоленск, 2010.
19. Егорова С.А., Кафтырева Л.А., Липская Л.В. и др. Штаммы энтеробактерий, продуцирующие бета-лактамазы расширенного спектра и металлобета-лактамазу NDM-1, выделенные в стационарах в странах Балтийского региона // Инфекция и иммунитет. - 2013. - Т.3, №1. - С. 29-36.
Поступила в редакцию журнала 29.07.2015
Рецензент: Л.А. Кафтырева
