CC BY
17
УДК 616.981.452:616-093/-098
Л.М.Куклева, Г.А.Ерошенко, Н.Ю.Шавина, А.И.Павлова, В.В.Кутырев
АНАЛИЗ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ПСЕВДОГЕНОВ КАК СПОСОБ ИЗУЧЕНИЯ ЭВОЛЮЦИОННЫХ ПРЕОБРАЗОВАНИЙ ГЕНОМА ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ
Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов
Проведено сравнительное изучение структуры трех генов (YPO1582, YPO1967 и YPO4008) в штаммах возбудителей псевдотуберкулеза I-VI сероваров и чумы, выделенных в России и за рубежом. Установлено, что штаммы неосновных подвидов Yersinia pestis содержат аллели генов «дикого» типа так же, как и исследованные штаммы Y. pseudotuberculosis. Штаммы основного подвида, выделенные в России и за рубежом, находятся на разных стадиях инактивации этих генов, что свидетельствует о незавершенном процессе редукции изученных генов. Исследование распределения псевдогенов может стать хорошим генетическим инструментом для изучения процессов эволюции генома Yersinia pestis.
Ключевые слова: возбудитель чумы, основной и неосновные подвиды Y. pestis, псевдогены, эволюция генома.
Осуществленная в последние годы расшифровка нуклеотидной последовательности генома ряда штаммов Yersinia pseudotuberculosis и Yersinia pestis [5-7, 9, 14] открыла возможность для изучения полиморфизма генома возбудителя чумы. При сравнении нуклеотидных последовательностей гомологичных генов Y. pestis и Y. pseudotuberculosis выявлена их идентичность на 97-99 % [10, 11], что свидетельствует о генетической близости этих бактерий. Разносторонний анализ секвенированных геномов патогенных иерсиний позволил установить, что возбудитель чумы произошел от псевдотуберкулезного микроба и за короткий промежуток времени эволюционировал из энтеропатогенной бактерии с фекально-оральным способом передачи в системный патоген, передающийся трансмиссивным путем. Формирование вида Y. pestis сопровождалось целым комплексом генетических событий, основными из которых были приобретение путем горизонтального переноса нового генетического материала, внутренние перестройки генома за счет внедрения IS-элементов и утрата функции некоторых генов в процессе адаптации возбудителя к новым условиям существования [13]. Процессы редуктив-ной эволюции имели, по-видимому, не меньшее значение для формирования вида Y. pestis, чем процессы приобретения новых генов [9]. Редукция генома чумного микроба привела к образованию у него большого количества так называемых «молчащих» генов или псевдогенов. Последние получили такое название, поскольку они обладают структурным сходством с последовательностями функционально активных генов, но из-за наличия различных генетических дефектов в структуре гена не могут экспрессироваться с образованием функционально активного белка [2]. Показано, что общее количество поврежденных генов и их состав (профиль псевдогенов) существенно различаются у разных штаммов возбудителя чумы. По данным B.Wren [13] количество псевдогенов в штаммах Y. pestis CO92, KIM и 91001 составляет соответственно 149, 54 и 140, тогда как у Y. pseudotuberculosis обнаружено 62 инактивированных гена. Кроме того, при секвени-ровании геномов штаммов Y. pestis Antiqua и Nepal516, принадлежащих к биовару antiqua [6],
выявлено соответственно 41 и 13 специфичных псевдогенов, не встречающихся в других изолятах.
В основе инактивации генов лежат различные генетические события. Так, инактивация генов может быть обусловлена мутациями сдвига рамки считывания (замена одного основания на другое). Примером подобной мутации является ген Y. pestis нит-ратредуктазы napA, в котором замена в 205-м кодоне гуанина на тимин привела к утрате способности осуществлять редукцию нитратов, что является особенностью штаммов чумного микроба биовара medievalis. Отсутствие проявления функции гена может быть следствием замены или утраты сразу нескольких нуклеотидов. Так, неспособность штаммов чумного микроба ферментировать глицерин, которая является биохимической меткой биовара orientalis, обусловлена дефектом в гене глицеро-3-фосфат дегидрогеназы (ген glpD), вызванным утратой фрагмента, содержащего 93 п.н. И, наконец, инактивация гена происходит в результате встраивания IS-элемента. В последнем случае поврежденные части гена могут фланкировать встроившийся IS-элемент или располагаться друг от друга на значительном расстоянии вследствие геномных перестроек, вызванных инсерционными последовательностями. У возбудителя чумы инактивация генов чаще всего обусловлена именно встраиванием IS-последовательностей, что связано с необычайно широким распространением этих генетических элементов в хромосоме Y. pestis.
Изучение распределения псевдогенов у различных штаммов возбудителя чумы может внести существенный вклад в изучение путей эволюционного перехода чумного микроба от его предшественника - Y. pseudotuberculosis [11, 12]. Установление количества псевдогенов и их идентификация (локализация на хромосоме, функция их продуктов) может служить генетической меткой штаммов Y. pestis из различных природных очагов.
В то время как в литературе имеются отдельные публикации по изучению распространения псевдогенов у штаммов Y. pestis зарубежного происхождения [8, 12], данные по исследованию редук-тивной эволюции у штаммов, циркулирующих в России и на сопредельных территориях, фактически
отсутствуют. Практически не изучен состав псевдогенов у неосновных подвидов Y. pestis, которые, по мнению отечественных исследователей, являются наиболее древними ветвями эволюции Y. pestis [1, 4]. Идентификация псевдогенов и выявление их профиля у неосновных подвидов представляют собой особый интерес, поскольку могут помочь в установлении этапов редуктивной эволюции при формировании вида Y. pestis.
Целью настоящего исследования явилось изучение распределения псевдогенов в штаммах основного и неосновных подвидов чумного микроба в сравнении с возбудителем псевдотуберкулеза для изучения микроэволюции вида Y. pestis.
Материалы и методы
В работе использовали 121 штамм Y. pestis основного (47), алтайского (12), кавказского (11), улэ-гейского (6) и гиссарского (11) подвидов, таласской группы штаммы (6), зарубежные изоляты (28), принадлежащие к биоварам antiqua (5), medievalis (5) и orientalis (18), а также 12 штаммов Y. pseudotuberculosis I-VI сероваров, выделенные в России и за рубежом. Штаммы получены из Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб», где они хранились в лиофильно высушенном состоянии.
Штаммы культивировали в течение 24 ч при 28 °С на 1,5 % агаре LB (pH 7,2). Культуральные и биохимические свойства испытуемых штаммов определяли в соответствии с «Руководством по профилактике чумы» [3].
Реакционная смесь для ПЦР (25 мкл) имела состав: 10 mM Tris-HCl (pH 8,0); 2,5 mM MgCl2; по 0,2 mM каждого из нуклеотидов dATP, dCTP, dGTP, dTTP; по 0,6 м^ каждого праймера; 5 ед. Taq ДНК-полимеразы (НИИ генетики) и 10 нг ДНК. В качестве матрицы в ПЦР использовали препараты тотальной ДНК штаммов Y. pestis. Для выявления дефектов в генах Y. pestis использовали олигонук-леотидные праймеры, описанные Z.Tong et al. [12]. Амплификацию фрагментов генов в ПЦР проводили на программируемом термостате «Терцик» (ЗАО «НПФ ДНК-Технология», Россия) по следующей программе: пре-денатурация при 95 °С в течение 5 мин, затем 30 циклов по 95 °С - 30 с, 60 °С - 30 с, 72 °С - 1 мин и 5 мин при 72 °С. В качестве матрицы в ПЦР использовали препараты тотальной ДНК штаммов Y. pestis. Синтез олигонуклеотидных праймеров осуществляли на автоматическом синтезаторе ДНК «ACM-102U» в НПФ «Литех» (Россия). Анализ ПЦР-продуктов проводили в 2 % агарозном геле и регистрировали в УФ-свете. В качестве контроля молекулярной массы использовали коммерческие маркеры GenRuler™ 50 bp DNA Ladder (MBI Fermentas, Литва).
Результаты и обсуждение
Экспериментальные исследования по изучению распространенности поврежденных генов у Y. pestis и Y. pseudotuberculosis проводили с использованием представительной выборки штаммов этих возбудителей, выделенных в России и за рубежом. В качестве объектов исследования были выбраны гены, участвующие в реализации ряда метаболических
путей патогенных иерсиний и расположенные в разных участках хромосомы - YPO1582 (лактозо-пермеаза), и YPO4008 (двухкомпонентная система сенсоркиназы), а также ген порина YPO1967.
На первом этапе изучен ген YPO1582, детерминирующий синтез пермеазы, обеспечивающей поступление лактозы внутрь бактериальной клетки. По данным компьютерного анализа нуклеотидной последовательности, штамм Y. pseudotuberculosis IP32953 содержит ген YPO1582 в интактном состоянии [5, 12]. Для того, чтобы определить наличие гена YPO1582 и его структуру у других штаммов возбудителя псевдотуберкулеза, нами были изучены изоляты Y. pseudotuberculosis, выделенные от животных и людей, больных дальневосточной скарлатиноподобной лихорадкой, принадлежащие к различным сероварам возбудителя. Полученные результаты (рис. 1, дорожки 9 и 18) свидетельствуют о том, что во всех испытанных нами штаммах возбудителя псевдотуберкулеза I-VI сероваров выявлен специфический ПЦР-продукт, величина которого (950 п.н.) соответствует размеру ожидаемого фрагмента у штамма возбудителя псевдотуберкулеза, представленного в базе данных GenBank. Эти данные позволяют предположить интактность гена биосинтеза пермеазы (YPO1582) у изученных нами штаммов возбудителя псевдотуберкулеза.
При анализе 46 штаммов неосновных подвидов Y. pestis: кавказского (Закавказский и ВосточноКавказский высокогорные очаги), алтайского (Алтайский горный), гиссарского (Гиссарский высокогорный) и улэгейского (Северо-Западная Монголия), а также группы таласских изолятов возбудителя чумы (Таласский высокогорный очаг чумы) показано, что все они содержали аллель гена YPO1582 «дикого» типа, как и у изученных штаммов возбудителя псевдотуберкулеза. Об этом свидетельствует наличие ампликона такого же размера - 950 п.н. (рис. 1, дорожки 10-17), что и у штаммов возбудителя псевдотуберкулеза.
Другая картина получена при исследовании 75 штаммов чумного микроба основного подвида, выделенных в России и за рубежом. Показано, что лишь 47 % изолятов содержали инактный ген лакто-зопермеазы - YPO1582 (рис. 1, дорожки 2 и 3; рис. 3, А), тогда как у 53 % штаммов в ПЦР выявляли амплификат размером 2265 п.н. (рис. 1. дорожки 5 и 7; рис. 3, А). Такой размер ампликона обуслов-
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
2265 п.н—*■ _ „
950 п.н.—*•«•■»■»«* ж » — _440 пн.
• - <—121 п.н.
Рис. 1. ПЦР-анализ с праймерами на ген YPO1582 у штаммов Y. pseudotuberculosis и Y. pestis различных биоваров и подвидов:
Штаммы: 1 - б/в antiqua (Kenya 102); 2 - б/в orientalis (EV);
3, 4 - основного п/в (А-148б, И-1996); 5 - б/в medievalis (212);
6, 7, 8 - основного п/в (КМ956, И-3223, С-624); 9, 18 - Y. pseudotuberculosis (312-I с/в и 417-III с/в); 10 - гиссарского п/в (А-1728);
11, 12 - алтайского п/в (И-2359, И-2998); 13 - гиссарского п/в (А-1249); 14 - улэгейского п/в (И-3131); 15 - из группы таласских (А-1802);
16, 17 - кавказского п/в (3544, 818); 19 - отрицательный контроль;
20 - маркеры молекулярной массы (440 и 121 п.н.)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
2243 п.н~ 289 п.нг
-440 п.н. -121 п.н.
Рис 2. ПЦР-анализ гена YPO 4008 у штаммов Y. pestis из различных природных очагов чумы:
Штаммы: 1, 2 - гиссарского п/в (А-1249, А-1728); 3 - основного п/в (А-М-231); 4 - основного п/в (И-3102); 5 - основного п/в (КМ638);
6 - алтайского п/в (И-2359); 7 - б/в antiqua (Kenya 102); 8 - улэгейского п/в (И-3131); 9 - кавказского п/в (818); 10 - б/в medievalis (162);
11, 12 - Y. pseudotuberculosis (312-1 с/в, 417-III с/в); 13 - из группы таласских (А-1802); 14 - б/в orientalis (65/23); 15-17 - основного п/в (А-1836, А-161, И-3205); 18 - отрицательный контроль; 20 - маркеры молекулярной массы (440 и 121 п.н.)
лен внедрением в инактный ген IS-элемента (IS285) размером 1315 п.н. [2], что, по-видимому, и обусловило инактивацию гена лактозопермеазы у штаммов основного подвида.
Наличие большого количества штаммов (53 %) основного подвида с нарушением структуры гена YPO1582 служит доказательством того, что этот ген находится в процессе инактивации, однако обнаружение 47 % штаммов с инактным геном свидетельствует о незавершенности этого процесса. Вероятно, экспрессия этого гена не является жизненно необходимой, поскольку при его нарушении клетки остаются жизнеспособными.
Кроме гена лактозопермеазы, нами изучен ген YPO4008, который кодирует двухкомпонентный сенсорный белок - киназу. По данным компьютерного анализа, штамм Y. pseudotuberculosis IP32953 содержит этот ген, не нарушенный внедрением IS-элемента и дающий в ПЦР при использовании праймеров, предложенных Z.Tong et al. [12], фрагмент размером 289 п.н. Интактность этого гена у возбудителя псевдотуберкулеза подтверждена нами при изучении в ПЦР-анализе других штаммов Y. pseudotuberculosis, принадлежащих к I-VI серо-варам. На электрофореграммах у этих изолятов выявляли амплификат размером 289 п.н. (рис. 2, дорожки 11, 12), который соответствует аллели гена YPO4008 «дикого» типа у штамма Y. pseudotuberculosis IP32953 [5], представленного в базе данных GenBank.
Изученные штаммы возбудителя чумы неосновных подвидов - кавказского, алтайского, гиссар-ского, улэгейского, а также изоляты таласской группы (рис. 2, дорожки 1, 2, 6, 8, 9, 13) образовывали специфичный фрагмент такого же размера (289 п.н), как и возбудитель псевдотуберкулеза, т.е. содержали аллель гена «дикого» типа.
Среди штаммов основного подвида, представленных зарубежными изолятами биоваров antiqua (5), medievalis (5) и orientalis (18), а также штаммами, циркулирующими на территории России (47) 51 % изолятов содержали аллель гена YPO4008 «дикого» типа (рис. 2, дорожки 2, 6, 8, 9, 11-13, 16, рис. 3, В). У них выявляли специфический амплификат размером 289 п.н. Однако у 47 % изученных штаммов, независимо от их принадлежности к тому или иному биовару Y. pestis, наблюдали нарушение гена за счет вставки другой инсерционной последовательности - IS100. Такие штаммы образовывали специфичный ампликон размером 2243 п.н. (рис. 2, дорожки 4, 5, 7, 10, 14, 15, 17), соответствующий размеру гена (289 п.н) со встроенным IS100 (1954 п.н.). Представленные данные свидетельствуют о том, что данный ген также находится в стадии инактивации, поскольку выявлены как аллели «дикого» типа, так и нарушенные гены.
В отличие от результатов, полученных при изучении гена YPO1582, при анализе состояния гена YPO4008 выявлено 2 % штаммов основного подвида Y. pestis, у которых при использовании праймеров на концевые участки гена YPO4008 не удалось получить продукта амплификации. Мы предположили, что это связано с внедрением IS-элемента в ген YPO4008, которое у части штаммов основного подвида (2 %) вызвало значительные перестройки в хромосоме, в результате чего фрагменты гена YPO4008 оказались на удаленном расстоянии друг от друга. Для подтверждения этого предположения нами использованы две пары праймеров, в каждой из которых один из праймеров был комплементарен фрагменту гена YPO4008, а другой -IS-элементу. В результате таких экспериментов в ПЦР удалось получить образование специфического продукта. Таким образом, дополнительный ПЦР-анализ с использованием праймеров на концевые участки IS100 позволил установить, что процесс инактивации гена YPO4008 зашел достаточно дале-
Рис. 3. Результаты изучения состояния генов УР01582 (А), УР01967 (Б) и УР04008 (В) у 75 штаммов основного подвида У. резИз, выделенных в природных очагах чумы России и за рубежом:
| | - интактный ген; Ц - ген со вставкой В-элемента;
Ц - ген, фрагменты которого значительно удалены друг от друга из-за перестроек, вызванных внедрением В-элемента
ко: в результате рекомбинационных событий, вызванных внедрением инсерционной последовательности, различные фрагменты поврежденного гена оказались в разных частях хромосомы бактериальной клетки.
Третий из изученных нами генов YPO1967, детерминирующий синтез порина, в виде аллели «дикого» типа присутствовал у всех изученных штаммов Y. pseudotuberculosis, независимо от того, к какому сероварианту принадлежали использованные изоляты. На электрофореграммах присутствовал специфичный ампликон 450 п.н. Полученный с использованными нами олигонуклеотидными праймерами ПЦР-продукт совпадал с величиной фрагмента, рассчитанного на основании анализа нуклеотидной последовательности гена YPO1967 штамма Y. pseudotuberculosis IP32953, представленной в базе данных GenBank.
При изучении структуры гена YPO1967 у неосновных подвидов Y. pestis - кавказского, алтайского, гиссарского, улэгейского, а также группы таласских штаммов - показано, что все они содержали аллель гена «дикого» типа. Об этом свидетельствовало обнаружение на электрофореграммах специфического ПЦР-продукта размером 450 п.н.
Для изолятов основного подвида, циркулирующих в природных очагах России и зарубежных стран, установлено, что лишь 28 % изученных штаммов несли аллель «дикого» типа гена YPO1967 (рис. 3, Б). Все остальные изученные штаммы характеризовались различными повреждениями этого гена. Для выявления гена при постановке ПЦР использовали как праймеры, фланкирующие ген YPO1967, так и праймеры на последовательность IS100 [12]. Использование такой системы праймеров позволило выявить различные структурные изменения гена YPO1967. Так, у 34 % штаммов в ПЦР выявляли амплификат размером около 2400 п.н., свидетельствующий о том, что ген содержит вставку IS100 размером 1954 п.н., а у 38 % штаммов при использовании праймеров, фланкирующих ген YPO1967, его не удалось обнаружить. Это связано, по-видимому, с тем, что внедрение IS-элемента в ген приводит к протяженным перестройкам этого участка хромосомы, в результате которых разные части гена оказались на значительном отдалении друг от друга. При использовании сочетания двух пар праймеров, один из которых комплементарен концевому участку изучаемого гена, а второй - начальному (концевому) участку IS-элемента, удалось получить амплификаты у 16 % штаммов, не дававших сигнал в предыдущих экспериментах. У 11 % штаммов не удалось получить положительного ответа ни с одной парой праймеров. По-видимому, в этих штаммах встраивание IS-элемента в ген YPO1967 привело к столь серьезным повреждениям этого участка хромосомы, что были утрачены отдельные участки гена, выявляемые с помощью использованных праймеров.
Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что в штаммах возбудителя псевдотуберкулеза всех шести сероваров изученные гены YPO1582, YPO1967 и YPO4008 находятся в интактном состоянии так же, как и в штамме
Y. pseudotuberculosis IP32953, представленном в базе данных GenBank.
Анализ структуры генов 46 штаммов неосновных подвидов, изолированных в Закавказском и Восточно-Кавказском (кавказский подвид), Гиссар-ском (гиссарский п/в), Таласском (группа таласских изолятов) высокогорных, Алтайском горном (алтайский п/в) очаге и в Северо-Западной Монголии (улэгейский п/в) показал, что изученные гены у штаммов неосновных подвидов также находятся в интактном состоянии, что служит доказательством их близости штаммам Y. pseudotuberculosis. В результате проведенных исследований показано, что неосновные подвиды представляют собой группы, генетически однородные по изученным генам, поскольку не выявлено ни одного штамма, несущего мутации в изученных генах. Полученные нами данные о наличии интактных генов YPO1582, YPO1967 и YPO4008 у штаммов возбудителя псевдотуберкулеза и неосновных подвидов чумного микроба подтверждают предположение о том, что последние являются наиболее древними ветвями эволюции Y. pestis, у которых процессы редукции метаболических генов не достигли тех масштабов, которые отмечены для основного подвида чумного микроба.
Изучение 75 штаммов чумного микроба основного подвида, выделенных в России и за рубежом, показало, что они, в отличие от неосновных подвидов, содержат гены YPO1582, YPO1967 и YPO4008, находящиеся на разной стадии инактивации. Гены «дикого» типа обнаружены у 53 % (YPO1582), 34 % (YPO1967) и 47 % (YPO4008) штаммов. Гены, нарушенные встраиванием инсерционных последовательностей (IS100 или IS285), выявлены у 47 % (YPO1582), 28 % (YPO1967), 51 % (YPO4008). Кроме того, показано, что у 2 % штаммов (для гена YPO4008) и 38 % (для гена YPO1967) внедрение IS-элементов и обусловленные ими рекомбинационные события привели к масштабным геномным перестройкам, в результате чего разные части гена оказались на значительном отдалении друг от друга. При этом у 11 % штаммов Y. pestis ген YPO1967 поврежден настолько сильно, что его не удалось обнаружить ни с одной из использованных нами пар праймеров. Следует отметить, что полученные нами результаты по исследованию повреждения различных генов у разных штаммов Y. pestis, свидетельствуют о том, что процессы инактивирования отдельных генов происходят независимо друг от друга.
В целом полученные нами результаты по распределению псевдогенов у основного и неосновных подвидов возбудителя чумы служат доказательством того, что в геноме высоковирулентных штаммов Y. pestis интенсивно протекают редуктивные процессы, обусловленные распространением IS-элементов. Наши данные совпадают с результатами других исследователей о том, что в процессе становления возбудителя чумы микроба при переходе от возбудителя с фекально-оральным (возбудитель псевдотуберкулеза) способом распространения инфекции к трансмиссивному пути с участием насе-комых-переносчиков произошла утрата функции большого количества генов, потерявших свое значение при новом механизме развития инфекционно-
го процесса. Полученные нами данные, а также результаты зарубежных исследований могут служить доказательством того, что изучение распределения псевдогенов у возбудителя чумы может служить эффективным методом анализа преобразования генома в процессе микроэволюции вида У. рез^З.
Работа поддержана грантами РФФИ ОФИ № 06-04-08152 и № 07-04-00100-а.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Куклева Л.М., Проценко О.А., Кутырев В.В. // Мол. генет. - 2002. - № 1. - С. 3-7. - 2. Льюин Б. Гены. - М.: Мир, 1987. - 543 с. - 3. Руководство по профилактике чумы. / Под ред. Наумова А.В., Самойловой Л.В. - Саратов, 1992. - 4. Филиппов А. А. Мобильные генетические элементы патогенных бактерий: Автореф. дис. ... д-ра мед. наук. -Саратов, 2001. - 42 с. - 5. Chain P., Carniel E., Larimer F . et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. - 2004. - Vol. 101, N 38. -P. 13826-13831. - 6. Chain P., Hu P., Malfatti S. et al. // J. Bacteriol. - 2006. - Vol. 188. - P. 4453-4463. - 7. Deng W., Burland V., Plunkett G. et al. // J. Bacteriol. - 2002. -Vol. 184. - P. 4601-4611. - 8. Lerat E., Ochman H. // Nucl. Acids Res. - 2005. - Vol. 33, N 10. - P. 3125-3132. - 9. Parkhill J., Wren B., Thomson N. et al. // Nature. - 2001. - Vol. 413. -P. 523-527. - 10. Perry R., Straley S., Fetherston J. et al. //
Infect. Immun. - 1998. - Vol. 66. - P. 4611-4623. - 11. Skurnik M., Peippo A., Ervela E. // Mol. Microbiol. - 2000. -Vol. 37. - P. 316-330. - 12. Tong Z., Zhou D., Song Y. et al. // J. Med. Microbiol. - 2005. - Vol. 54. - P. 1-10. - 13. Wren B. // Microbiology. - 2003. - Vol. 1. - P. 55-64. - 14. Zhou D., Tong Z., Song Y. // J. Bacteriol. - 2004. - Vol. 186. - P. 51475152.
L.M.Koukleva, G.A.Yeroshenko, N.Yu.Shavina, A.I.Pavlova, V.V.Kutyrev
Analysis of Distribution of Pseudogenes as a Method to Study Evolutional Reorganizations in Yersinia pestis Genome
Russian Anti-Plague Research Institute "Microbe ", Saratov
Structures of three genes (YPO1582, YPO1967, YP04008) were comparatively studied in the infectious agents of pseudotuberculosis, serovars I-VI, and plague isolated in Russia and abroad. Yersinia pestis strains of minor subspecies were shown to contain wild-type gene alleles just as Yersinia pseudotuberculosis strains used in the experiments. The main subspecies strains originating both from home and foreign countries, were shown to be at different stages of inactivation of these genes suggesting an incomplete gene reduction process. Analysis of distribution of the pseudogenes may prove a very useful tool to investigate Y. pestis genome evolution processes.
Key words: infectious agent of plague, the major and minor subspecies of Y. pestis, pseudogenes, genome evolution.
Поступила 17.10.07.
УДК 616.932
О.В.Маркина, Е.В.Монахова, Л.П.Алексеева, Р.В.Писанов
ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ГЕМАГГЛЮТИНИН/ПРОТЕАЗЫ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ НА МОДЕЛИ КУЛЬТУР КЛЕТОК
Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт
Изучена биологическая активность препарата рекомбинантной гемагглютинин/протеазы (HA/P) холерных вибрионов по отношению к культурам клеток. Показана способность HA/P вызывать округление клеток линий CH0-K1, L-929, HeLa, HEp2 и McCoy и разрушение плотного монослоя MDCK и СаСо2, сопровождающееся отделением культуры от дна лунок. Обратимость реакции зависела от дозы и времени воздействия препарата. Полученные результаты согласуются с литературными данными об аналогичном влиянии на культуры клеток цитотоксина NMDCY (non-membrane-damaging cytotoxin) и свидетельствуют в пользу высказанного нами ранее предположения о возможной идентичности этих двух факторов.
Ключевые слова: холерный вибрион, гемагглютинин/протеаза, NMDCY, культуры клеток.
Гемагглютинин/протеаза (HA/P) - ключевая цинкзависимая металлопротеаза холерных вибрионов [4], обладающая, помимо протеолитической активности, способностью вызывать агглютинацию куриных эритроцитов, а также значительные изменения в культурах клеток Т84, MDCK-I, HT29 и CaCo2 [6, 9]. Однако на сегодняшний день в литературе имеется всего одно сообщение о способности HA/P вызывать округление клеток HeLa [5]. Дальнейшее изучение биологического действия HA/P на модели культур клеток представляет интерес в связи с тем, что описанный в 1996 г. цитотоксический фактор NMDCY (non-membrane-damaging cytotoxin) [7] обладает целым рядом свойств, позволяющих предположить, что он идентичен HA/P [1]. Основным свойством NMDCY, которому он обязан своим названием, является способность вызывать округление клеток линий СНО, HeLa и Vero, не сопрово-
ждающееся повреждением наружной мембраны. Показано, что его действие на данные культуры может быть обратимым в обратно пропорциональной зависимости от дозы токсина и времени его воздействия [7]. Поэтому целью настоящего исследования явилось изучение морфологических изменений, вызываемых препаратом HA/P в культурах клеток линий CHO-K1, L-929, HeLa, HEp2, McCoy, MDCK и СаСо2.
Материалы и методы
Частично очищенный препарат HA/P, полученный нами ранее из рекомбинантного штамма-проду-цента E. coli Jm103pHP61 [2], хранили в лиофили-зированном состоянии в запаянных ампулах. Непосредственно перед опытами готовили раствор с концентрацией общего белка 1 мг/мл. HA/P находилась
