Научная статья на тему 'Структурная организация интактных и нарушенных IS100 элементов генов порина, граничащих с pgm-областью, у штаммов Yersinia pestis и Yersinia pseudotuberculosis'

Структурная организация интактных и нарушенных IS100 элементов генов порина, граничащих с pgm-областью, у штаммов Yersinia pestis и Yersinia pseudotuberculosis Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

CC BY
219
28
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
YERSINIA PESTIS / YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS / ГЕН ПОРИНА / ОБЛАСТЬ ПИГМЕНТАЦИИ (PGM) / ОБЛАСТЬ ASTE-HUTG / СЕКВЕНИРОВАНИЕ ГЕНОВ / PORIN GENE / PIGMENTATION (PGM) LOCUS / ASTE-HUTG REGION / SEQUENCING

Аннотация научной статьи по биологическим наукам, автор научной работы — Булгакова Е. Г., Краснов Я. М., Сухоносов И. Ю., Гаева А. В., Анисимова Л. В.

Ген порина, граничащий с областью пигментации (pgm), у высоковирулентных штаммов Yersinia pestis, как правило, нарушен IS100 элементом. При этом pgm-область, несущая гены, ответственные за вирулентность (остров высокой патогенности) и образование биопленки (hms-оперон), оказывается фланкированной прямыми копиями /S100, что вызывает ее дестабилизацию. Проведено изучение распространенности интактных и трункированных генов порина среди 240 штаммов Y. pestis из 39 природных очагов России и ближнего зарубежья и 68 штаммов Yersinia pseudotuberculosis из разных географических регионов. Большинство высоковирулентных штаммов Y. pestis и некоторые филогенетические линии Y. pseudotuberculosis серотипа О:1 содержат трункированные гены порина. В то же время деления pgm-области по фланкирующим IS100 у Y. pseudotuberculosis невозможна, так как IS 100 интегрирован в ген порина в ориентации, обратной по сравнению с Y. pestis. Интактный ген порина несут все штаммы Y. pestis с низкой эпидемической значимостью и отдельные филогенетические линии высоковирулентных штаммов Y. pestis из пустынных очагов и очага песчаночьего типа, а также большинство штаммов Y. pseudotuberculosis серотипа О:1. У менее вирулентных штаммов Y. pseudotuberculosis серотипа О:3 выявлена протяженная делеция, включающая ген порина и часть гена astE. Нуклеотидная последовательность генов порина у штаммов Y. pestis и Y. pseudotuberculosis из разных географических регионов идентична. Три аллеля гена порина отличаются исключительно сайтом интеграции и ориентацией К100-элемента или отсутствием его интеграции. Нуклеотидная последовательность IS 100 внедренных в ген порина иерсиний имеет небольшие различия только для двух штаммов Y. pestis, выделенных в Америке. Установлены корреляция низкой частоты Hmsмутантов c интактным состоянием гена порина у Y. pestis и отсутствие такой корреляции у Y. pseudotuberculosis.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по биологическим наукам , автор научной работы — Булгакова Е. Г., Краснов Я. М., Сухоносов И. Ю., Гаева А. В., Анисимова Л. В.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Текст научной работы на тему «Структурная организация интактных и нарушенных IS100 элементов генов порина, граничащих с pgm-областью, у штаммов Yersinia pestis и Yersinia pseudotuberculosis»

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016 УДК 579.842.23:579.25]:577.21.08

Булгакова Е.Г., Краснов Я.М., Сухоносов И.Ю., Гаева А.В., Анисимова Л.В., Гусева Н.П.,

Новичкова Л.А., Кутырев В.В.

СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ИНТАКТНЫХ И НАРУШЕННЫХ Ш00 ЭЛЕМЕНТОМ ГЕНОВ ПОРИНА, ГРАНИЧАЩИХ С PGM ОБЛАСТЬЮ, У ШТАММОВ YERSINIA PESTIS

И YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS

ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов

Ген порина, граничащий с областью пигментации (pgm), у высоковирулентных штаммов Yersinia pestis, как правило, нарушен IS100 элементом. При этом pgm-область, несущая гены, ответственные за вирулентность (остров высокой патогенности) и образование биопленки (hms-оперон), оказывается фланкированной прямыми копиями IS100, что вызывает ее дестабилизацию. Проведено изучение распространенности интактных и трункированных генов порина среди 240 штаммов Y. pestis из 39 природных очагов России и ближнего зарубежья и 68 штаммов Yersinia pseudotuberculosis из разных географических регионов. Большинство высоковирулентных штаммов Y. pestis и некоторые филогенетические линии Y. pseudotuberculosis серотипа О:1 содержат трункирован-ные гены порина. В то же время делеция pgm-области по фланкирующим IS100 у Y. pseudotuberculosis невозможна, так как IS100 интегрирован в ген порина в ориентации, обратной по сравнению с Y. pestis. Интактный ген порина несут все штаммы Y. pestis с низкой эпидемической значимостью и отдельные филогенетические линии высоковирулентных штаммов Y. pestis из пустынных очагов и очага песчаночьего типа, а также большинство штаммов Y. pseudotuberculosis серотипа О:1. У менее вирулентных штаммов Y. pseudotuberculosis серотипа О:3 выявлена протяженная делеция, включающая ген порина и часть гена astE. Нуклеотидная последовательность генов порина у штаммов Y. pestis и Y. pseudotu-berculosis из разных географических регионов идентична. Три ал-леля гена порина отличаются исключительно сайтом интеграции и ориентацией ISlOO-элемента или отсутствием его интеграции. Нуклеотидная последовательность IS100 внедренных в ген порина иерсиний имеет небольшие различия только для двух штаммов Y. pestis, выделенных в Америке. Установлены корреляция низкой частоты Hms- мутантов c интактным состоянием гена порина у Y. pestis и отсутствие такой корреляции у Y. pseudotuberculosis. Ключевые слова: Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis, ген порина, область пигментации (pgm), область astE-hutG, секвенирование генов.

DOI 10.18821/0208-0613-2016-34-2-49-57

Род Yersinia включает 14 видов, 3 из которых патогенны для человека [1]. Возбудитель чумы — Y.pestis явился причиной трех пандемий с высоким уровнем смертности в результате быстрой генерализации инфекционного процесса (77—97%). В то же время близкородственные виды Y.pseudotuberculosis и Y.enterocolitica вызывают заболевания преимущественно с диарейным синдромом и невысоким уровнем смертности. Несмотря на значительные различия в клинических проявлениях инфекционного процесса и жизненных циклах, геномы Y.pestis и Y.pseudotuberculosis имеют более высокую степень гомологии, чем геномы Y.pseudotuberculosis и Y.enterocolitica, вызывающие заболевания с близкими симптоматикой и путями распространения. Большую роль в адаптации к условиям среды обитания у микроорганизмов играют порины — белки внешней мембраны — БМВ или OMPs (outer membrane proteins). Они обеспечивают процесс переноса метаболитов через внешнюю мембрану, образуя в ней каналы, заполненные водой, и регулируют поступление и выведение различных ионов в зависимости от осмотического давления, pH и температуры среды [2]. Поэтому утрата или приобретение новых поринов микроорганизмом может отражать процесс смены им экологических ниш на пути эволюции. У патогенных

иерсиний наиболее полно охарактеризованы порины OmpC и OmpF [3—6]. Большой интерес представляет порин OmpY, принадлежащий к новой группе неспецифических поринов патогенных иерсиний [7]. Ген этого порина ompY расположен на хромосоме между генами astE и hutG, ограничивая важную для жизнеобеспечения иерсиний хромосомную область пигментации (pgm). Область pgm включает hms-оперон, отвечающий за сорбцию гемина и кислых красителей, а также образование биопленки при пониженных температурах, повышающей эффективность трансмиссии возбудителя чумы [8—10]. Второй регион pgm-области ybt обеспечивает жизнеспособность микроба в организме теплокровного хозяина за счет работы генов сидерофорозависимой системы утилизации трехвалентного железа, включающей ген рецептора сидерофора и одновременно бактериоцина пестицина [11]. У штаммов Y.pestis биоваров antiqua, me-dievalis, orientalis ompY инактивирован й10-элементом. Рекомбинация между К100-элементами, фланкирующими pgm-область, инициирует спонтанные делеции всей области с частотой 10-5 [12, 13], что приводит к утрате вирулентных свойств и способности образовывать биопленку. Штаммы, циркулирующие на территории стран СНГ и Монголии, подразделяют на подвиды — основной и неосновные: алтайский, гиссарский, кавказский, улэгейский (по принятой в 1985 г. в России классификации). Штаммы основного подвида проявляют свойства, характерные для штаммов биоваров antiqua, medievalis или orientalis. Штаммы неосновных подвидов обладают избирательной вирулентностью для лабораторных животных. Исследования небольшого количества штаммов Y.pestis неосновных подвидов и штаммов Y. pseudotuberculosis не выявили й!00-элемент в гене порина [14, 15]. И те и другие штаммы стабильно сохраняют область пигментации, при этом у штаммов Y.pestis стабильно также проявление признаков пигментации и чувствительности к пестицину, а штаммы Y. pseudotuberculosis легко их утрачивают [16]. В то же время на территории стран СНГ встречаются штаммы основного подвида, у которых стабильно сохраняется признак пигментации, а редкие непигментированные клоны реверсируют к исходному варианту [17—19]. Ранее нами были определены и сравнены нуклеотидные последовательности hms, оперона у штаммов Y.pestis разного происхождения и штаммов Y. pseudotuberculosis [16]. Оказалось, что единичные нуклеотидные замены, выявленные в этой области у патогенных иерсиний из разных географических регионов, не были связаны с особенностями проявления признака пигментации и стабильностью области pgm. Одной из причин низкой частоты появления непигмен-тированных клонов у редких штаммов основного подвида может быть отсутствие IS100 в гене порина ompY. Однако такие штаммы еще не были детально охарактеризованы. В настоящее время неполно изучены различия в структурной организации гена порина у штаммов Y.pestis и Y. pseudotuberculosis разного происхождения

и их взаимосвязь со стабильностью самой области пигментации и признаков, кодируемых ее генами.

Целью нашей работы было сравнительное изучение структурной организации и распространения аллелей гена порина, граничащего с pgm-областью, у штаммов Y. pestis и Y. pseudotuberculosis разного происхождения.

Материалы и методы

В работе использованы 240 штаммов Y. pestis всех подвидов, изолированных из природных очагов России и ближнего зарубежья, 68 штаммов Y. pseudotuberculosis. Штаммы получены из Государственной коллекции патогенных бактерий РосНИПЧИ «Микроб». Бактерии выращивали в течение 18 ч на агаре LB рН 7,2 при 28°С и готовили взвесь микроорганизмов в дистиллированной воде в концентрации 1,0 ■ 107 — 1,0 ■ 109 м.к/мл. Подготовку проб и обеззараживание тестируемых штаммов проводили по схеме, описанной в методических указаниях МУ 1.3.2569—09 «Организация работ лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I—IV групп патогенно-сти». Структура праймеров, рассчитанных с помощью компьютерной программы «Primer Express», приведена в табл. 1.

Реакционная смесь содержала: ПЦР-буфер, MgCl2 — 1,5 ммоль, смесь dNTP — 0,4 ммоль, праймеры прямой — 1,2 пмоль, обратный — 0,8 пмоль, Taq-полимераза — 2 ед., исследуемая ДНК — 10 мкл, вода деионизированная — до 25 мкл. Режим амплификации для образцов с праймерами: первый цикл 94°С — 1 мин, далее следуют 35 циклов, состоящих из шагов: при 94°С — 30 с, 62°С — 30 с, 72°С — 40 с. В реакционной смеси для амплификации фрагментов более 1000 п.н. увеличивали концентрации dNTP mix — 0,8 ммоль, прямых праймеров — 3,52 пмоль и временные параметры амплификации: первый цикл 94°С — 2 мин, далее — 35 циклов, состоящих из шагов: при 94°С — 1 мин, 62°С — 1 мин, 72°С — 4 мин.

Для разделения продуктов амплификации использовали 0,8% агарозный гель. В качестве маркеров молекулярных размеров ампликонов использовали ДНК фага 1, обработанного рестриктазами HindIII и EcoRI + HindIII; ДНК фага jX 174, обработанного рестриктазой HaeIII.

Автоматическое секвенирование проводили на генетическом анализаторе модели «CEQ 8000» (Beckman Coulter, США). Для проведения секвенирования и обработки полученных результатов использовали программное обеспечение «CEQ 8000 Series Genetic Analysis System Software v. 9.0», «MEGA 4.0».

Депонирование нуклеотидных последовательностей, определенных в данном исследовании, осуществлено в GenBank под номерами KP176372 — KP176387.

Результаты и обсуждение

ПЦР-анализ гена ompYу штаммов Y.pestis разного происхождения

На территории стран СНГ и Монголии циркулируют штаммы 5 подвидов: основного — Y. pestis ssp. pestis, неосновных — Y. pestis ssp. caucasica, Y pestis ssp. hissar-ica, Y. pestis ssp. altaica, Y. pestis ssp. ulegeica и таласской группы (не представлена в классификационной схеме, но по ряду признаков штаммы можно отнести к неосновным подвидам [20]). В первую очередь перед авторами стояла задача изучения распространенности аллелей гена ompY (интактных и инактивированных IS100-элементом) среди штаммов, принадлежащих к разным подвидам и природным очагам. Принадлежность к конкретному аллелю у штаммов чумного микроба определяли с помощью 3 пар праймеров (IH1-IH2, IH3-IH4 и IH1-IH4). Праймеры IH2 и IH3 комплементарны областям й100-элемента и позволяют судить о наличии/отсутствии и ориентации IS100. Праймеры IH1 и IH4 комплементарны областям гена порина, фланкирующим место встраивания й100-элемента и потому удобны для выявления как интактных, так и трункированных генов порина (рис. 1, а).

Предварительный анализ структурной организации

Таблица 1

Последовательности олигонуклеотидных праймеров, использованных в работе

Название Нуклеотидная последовательность (5'-3') Размер ампликона, п.н.

IH1 TTTACCGCAACAACATCATCC 787

IH2 ACCGCAGAAGCAACTCCAG

IH3 TGAAGCAACAGCAGGTCG 795

IH4 ATGGCCGCAACTATGGTG

IH1 TTTACCGCAACAACATCATCC 2690/7331

IH4 ATGGCCGCAACTATGGTG

HSI81 TTTCGACTATGGCCGCAAC 936

IH2 ACCGCAGAAGCAACTCCAG

HSI84 CCGCAACAACATCATCCG 623

IH3 TGAAGCAACAGCAGGTCG

HSI55 GCAAGCTAGGGTTCAGTGGC 619

HSI56 GCAGCGAATATCGTCCATGA

HSI57 GCCGTTATCCTGCCAGACA 755

HSI58 TGAGCCGTTCGGTTATTCG

HSI61 AGCGAATAACCGAACGGCT 784

HSI62 TGTCTTACGTGCAGGCAAGG

HSI65 TTATGCACACCTCCGCAGG 405

HsI66 ACCAACATCATCCCAGCCC

HsI67 TACGGGTGGCTGAGGATACG 994

HsI68 CGCTGCACTTGAAAGAGCTG

HSI69 TGCGAATTCCCTACTGATTGG 768*

HSI70 TCCCACTGACCGAAACCAG

HsI71 TGCTTTGCAGATGGTTCGC 659

HSI72 TCACCGTCTTCGTTACGCC

HsI73 GCTCTTTCAAGTGCAGCGGA 417

HsI74 CGTTACGGTAGGTTGCCAGG

HSI75 CGTCGTTGACAGTCTCTTGCC 446*

HsI76 GGCGGGTTCTCATGCTGAT

HSI75 CGTCGTTGACAGTCTCTTGCC 872*

HsI78 GCGTCCGTTATTCCTCGGT

HsI79 GCGCTAATTCTAGTTGCACCG 714

HsI80 TGCCACTGTCGTATTCCGAG

HsI81 TTTCGACTATGGCCGCAAC 2682

HSI82 CATCCGTATTCAAGCCCAATG

HsI83 TGGTTTCGGTCAGTGGGAA 2808

HsI84 CCGCAACAACATCATCCG

TAN 2 ACAACCATGCTGACGTGGG 1230

HsI61 AGCGAATAACCGAACGGCT

PSN1 TGCGACCCATATTGACCTGC 745

PSN2 ATGCTCGGCAACCCGTTT

Примечание. 1 2690 п.н. — для штаммов основного подвида и 733 п.н. — для штаммов неосновных подвидов и штаммов основного подвида из Кызылкумского пустынного очага [11]; приведены размеры ампликона для штамма Y.pestis С092.

генов ompY проведен на группе штаммов, включающих по 1—2 штаммам каждого подвида и таласской группы. Штамм Y. pestis ssp. pestis 231 (708) с праймерами IH1- IH2 и IH3-IH4 образует специфичные ампликоны размером 787 и 796 п.н. соответственно. Штаммы неосновных подвидов: Y. pestis ssp. altaica KM683 (И-2359) — Алтайский горный очаг; Y. pestis ssp. altaica И-3340 — Алтайский горный очаг; Y. pestis ssp. ulegeica И-3069 — Монголия, Убурхангай; Y.pestis ssp. hissarica А-1249 — Гиссарский высокогорный очаг; Y.pestis ssp. caucasica 1146 — Зангезуро-Карабахский

Рис. 1. Структурная организация региона hutG — astB штаммов Y. pestis и Y. pseudotuberculosis. A — регион hutG — astB штаммов Y. pestis и Y. pseudotuberculosis с интактным геном порина ompY: стрелками указаны сайты посадки праймеров, пунктирными линиями показаны сайты внедрения IS 100 в ген ompY для штаммов Y. pestis (фланкированы последовательностями TCTCT) и

Y. pseudotuberculosis (фланкированы последовательностями AGAAAG); B — регион hut G — astB, характерный для штаммов Y. pseudotuberculosis серотипа О:3: пунктирной линией обозначена область делеции.

очаг и штамм таласской группы Y.pestis А-1802 (21/10) — Таласский высокогорный очаг не образуют специфичные ампликоны. Такие результаты возможны, если гены ompY штаммов Y pestis неосновных подвидов интактны, или при инвертированном положении /5100, поэтому дальнейший анализ штаммов разного происхождения на присутствие гена порина и распространенность его аллелей проводили с помощью праймеров 1Н1—1Н4.

При ПЦР-скрининге 240 штаммов Y.pestis из 39 природных очагов стран СНГ и нескольких аймаков Монголии с помощью праймеров 1Н1—1Н4 у большинства штаммов основного подвида амплифицировался фрагмент размером 2690 п.н. У штаммов неосновных подвидов и таласской группы (рис. 2, треки 11, 25, 29—31, 36—38, 40—44, 46—50, 52—58), а также штаммов основного подвида, выделенных в Кызылкумском пустынном (см. рис. 2, треки 32—34), Приаральско-Каракумском пустынном (рис. 2, трек 8) и Прикаспийском песчаном очагах (рис. 2, трек 4) выявлялся ампликон размером 733 п.н. Длина этого фрагмента ДНК соответствует размеру части интактного гена ompY, ограниченной праймерами. Проведенный анализ показал, что все 49 исследованных штаммов неосновных подвидов и 6 штаммов таласской группы несут интактный ompY. Среди штаммов основного подвида превалируют штаммы с инактивированным ompY (187 штаммов), но встречаются штаммы с интактным геном (5 штаммов) и штаммы, утратившие его часть (48 штаммов) (см. рис. 2, треки 15, 18, 19). Штаммы, утратившие часть ompY, не образуют ампликоны с праймерами 1Н1—1Н4 и 1Н3—1Н4, но образуют с праймерами 1Н1—1Н2. При рассеве их на среде НmsD с конго красным [16] вырастают только непигменти-рованные клоны, не способные к реверсии признака пиг-

ментации. При тестировании этих штаммов с помощью праймеров на гены hms оперона (HMS9-10) и ybt региона (PSN1-2) специфические ампликоны не образовывались. В совокупности эти данные позволяют говорить о делеции всей области пигментации. Из природных очагов, в которых выявлены штаммы с интактным ompY, были исследованы по 6 штаммов. Только в Кызылкумском очаге количество штаммов с инактивированным и интактным геном было равным. В других очагах штаммы с интактным геном были единичными. Как видим, для штаммов основного подвида наличие аллеля инактивированного ompY превалирует, но не является отличительным признаком. Штаммы, несущие тот или иной аллель ompY, были выделены от разных носителей, но структурная организация гена у этих штаммов не зависела от вида носителя, равно как и от года выделения культуры. В то же время известно, что каждый из этих очагов подразделяется на несколько ландшафтно-экологических районов, в которых выделяются штаммы, различающиеся по некоторым фенотипическим свойствам [21]. С большой долей вероятности можно предположить, что различия в структурной организации гена порина у изученных штаммов связаны с геоморфологическими особенностями ареалов их обитания. Подтверждение или опровержение данного предположения может быть получено после выделения и исследования коллекции штаммов Y.pestis из разных районов этих природных очагов.

ПЦР-анализ гена ompY штаммов Y. pseudotuberculosis из разных географических регионов

Структуру и распространенность аллелей гена порина у штаммов Y. pseudotuberculosis изучали в ПЦР с праймерами IH1—IH4. Большинство исследованных штаммов Y. pseudotuberculosis с праймерами IH1—IH4 образовыва-

2 3

5 6 7 8 9 10 11 12 1314151617181920212223242526 2728

29 30 31 32 33 34 35 36 3738 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 £ 51 525354 5556575859

ЪЛ

*

Рис. 2. ПЦР-скрининг штаммов Yersiniapestis разного происхождения с помощью прай-меров IH1-IH4 на наличие гена порина. 1 — VHind III; Y pestis ssp. pestis: 2, 14, 39, 51 — 231(708); 3 — KM 872(C-527); 4 — KM 873(C-528) (Прикаспийский песчаный очаг); 5 — KM 921(C-631); 6 — M-956; 7 — И-1270; 8 — А-1763 (Приаральско-Каракумский пустынный очаг); 9 — И-3102; 10 — И-3205; Y pestis ssp. ulegeica: 11

— И-3069; 12, 28, 35, 45, 59 — фХ 174/HaeIII; 13 — VEcoRI + Hind III; 15 — C-754; 16 — 550; 17

— 615(90); 18 — C-747; 19 — C-749; 20 — 930(295); 21 — 932(1859); 22 — 1065; 23 — 1252(959); 24 — KM 938(A-1450); Y. pestis ssp. altaica: 25 — И-3340; Y pestis ssp. pestis: 26 — 4635; 27 —

6661; Y pestis таласской группы: 29 — А-1802; 30 — А-1814; 31 — А-1815; Y. pestis ssp. pestis (Кызылкумский пустынный очаг): 32 — А-1822; 33 — А-1824; 34 — А-1825; Y. pestis ssp.caucasica: 36

— 818; 37 — 1146; 38 — 6499; Y pestis ssp. hissarica: 40 — А-1249; 41 — А-1633; 42 — А-1723; 43

— А-1724; 44 — А-1725; 46 — КМ 684(И-2422); Y pestis ssp. ulegeica: 47 — И-3068; 48 — И-3069; 49 — И-3071; 50 — И-3130; Y pestis ssp. altaica: 52 — 2183; 53 — КМ 683(И-2359); 54 — 2817; 55

— И-2998; 56 — И-3000; 57 — И-3086; 58 — И-3340.

ли ампликоны размером 733 п.н. (рис. 3, треки 4, 8—14, 16—19, 22—24, 26, 28, 33—36, 49—52, 55, 56, 58—63), характерные для интактного ompY. Наряду с этим были выявлены 6 штаммов, ампликон которых близок по размеру ампликонам штаммов Y.pestis основного подвида с трункированным ompY (рис. 3, треки 5, 15, 20, 21, 31 и 54). Это штаммы серотипа 0:1, выделенные в Алматы — А17, А2526, Дагестане — 251Д, 141Д, Астраханской области — 414, Туркмении — B19. Однако при тестировании данных штаммов праймерами IH1—IH2 и IH3—IH4 на трункированный ompY специфичные ампликоны не образовывались. Причиной этого может быть различная ориентация й100-элемента в ompY Y. pseudotuberculosis и Y.pestis или инактивация другим мобильным элементом. Проверка первого предположения подтвердилась при использовании ПЦР с двумя парами праймеров (HSI81—IH2 и IH3—HSI84), обеспечивающими синтез ампликонов при наличии в ompY инвертированного IS100 (см. рис. 1, а). По данным GenBank у штамма Y.pestis C092 !$100-элемент встроен в ген порина по TCTCT-сайту. При этом реальный размер ампликонов HSI81—IH2 — 950 п.н. и IH3—HSI84 — 650 п.н., образованных с ДНК штаммов Y. pseudotuber-culosis, отличался от размеров фрагментов, рассчитанных для инвертированного встраивания IS100 в сайт TCTCT гена порина (1145 и 442 п.н. соответственно). При секве-нировании генов порина этих штаммов было показано, что разница в размерах предсказанных и реальных ампли-конов вызвана различными сайтами встраивания IS100 у штаммов Y. pseudotuberculosis и Y.pestis.

Кроме штаммов Y. pseudotuberculosis с интактным и трункированным ompY, выявлена еще одна довольно многочисленная группа штаммов, у которой с прайме-

рами IH1—IH4 ампликоны не образовывались. К этой группе штаммов относятся: штамм Mollaret III (см. рис. 3, трек 53), «бадхызские» штаммы серотипа О:3 (см. рис. 3, треки 25, 27, 32, 40—48, 57), штаммы, выделенные на территории Астраханской области: Аст. 2, Аст. 207 — серотипа О:3 (см. рис. 3, треки 6, 7) и 343 штамм (серотипа О:3, место выделения в паспорте не указано) (см. рис. 3, трек 29). Анализ ДНК штаммов с помощью дополнительных пар праймеров выявил протяженную де-лецию, захватывающую ompY и ген сукцинилглютаматдесукцинилазы astE аргининового оперона (рис. 1, в). При определении левой границы делеции ампликоны образовывались с праймерами HSI79—HSI80 на ген hutG гистидинового оперона, но отсутствовали с праймерами HSI75— HSI78 и HSI75—HSI76 на межгенное пространство ompY — hutG. Образование ампликона размером 714 п.н. с праймерами HSI79—HSI80 (см. рис. 1, а) свидетельствует о присутствии hutG в хромосоме исследуемых штаммов. Для определения правой границы делеции использовали пары праймеров, обеспечивающие образование ампликонов с частичным перекрыванием ну-клеотидных последовательностей, ■ HSI71—HSI72, HSI73—HSI74 (на

область начала ompY); HSI67— HSI68, HSI69—HSI70 (на область межгенного пространства astE — ompY) и HSI61—HSI62, HSI65—HSI66 (на astE) (см. рис. 1, а). Ни с одной из этих пар праймеров не происходила амплификация ДНК изучаемых штаммов. Только с праймерами HSI55—HSI56, HSI57—HSI58 (на astB) ДНК тестируемых штаммов образовывали ампликоны размерами 755 и 619 п.н. соответственно. Следует отметить, что праймер HSI58 комплементарен области начала astE. Таким образом, правой границей делеции является ген astE, а сама делеция включает ген ompY и часть гена astE. Судя по тому, что все 19 исследованных штаммов, лишенных области astE — hutG, относятся к серотипу О:3, данную делецию можно отнести к структурным особенностям хромосомы штаммов этого серо-типа.

Как видно из проведенных исследований, для штаммов Y. pseudotuberculosis характерно, но необязательно наличие интактного гена ompY. Некоторые штаммы се-ротипа 0:1 (генетически наиболее близкого к Y.pestis), как большинство штаммов Y.pestis ssp. pestis, содержат трункированный ген порина. Исследованные штаммы серотипа О:3 (более дальние «родственники» Y.pestis) вообще не содержат этот ген. Вероятно, отсутствие ompY или наличие его в инактивированной форме в геноме штаммов Y. pseudotuberculosis компенсируется работой других генов поринов с близкой функцией.

Анализ нуклеотидных последовательностей гена ompY Y.pestis и Y. pseudotuberculosis, выделенных в разных географических регионах

Сиквенс ompY выполнен у 8 штаммов Y.pestis 5 подвидов и таласской группы, одного штамма Y. pseudotuberculosis Аст.2618 с интактным геном и 5 штаммов

Рис. 3. ПЦР-скрининг штаммов Yersinia pseudotuberculosis из разных географических регионов с помощью праймеров IH1-IH4 на наличие гена порина. 1, 38 — VEcoRI + Hind III; 2, 39 — Y pestis 231(708); 3, 65 — Y pestis И-3069; 4 — Y. pseudotuberculosis серотип 0:1: А.5; 5 — А.17; серотип 0:3: 6 — Аст.2; 7 — Аст.207; серотип 0:1: 8 — Аст.2618; 9 — 7Арм.; 10 — 79Аз.; 11 — 155Аз.; 12 — 300Аз.; 13 — 10В; 14 — 90-Д; 15

— 141-Д; 16 — 46/68; 17 — 50-73; 18 — 3(71-S); 19 - 79(776-S); 20 — А-2526; 21 — 251-Д; 22 — И-199; 23 — И-270; 24 — И-406; серотип 0:3: 25 — 118; 26 — KM38(135/pCad); серотип 0:3: 27

— 296; серотип 0:1: 28 — 312; серотип 0:3: 29 — 343; 30 — 345; серотип 0:1: 31 — 414; серотип 0:3: 32 — 417; 33 — 78; 34 — 83; 35 — 110; 36 — 15-73; 37, 64 — фХ 174/HaeIII; серотип 0:3:

40 — 1442; 41 — 903; 42 — 1031; 43 — 898; 44 — 1451; 45 — 595; 46 — 701; 47 — 744; 48 — 834; серотип 0:1: 49 — 35; 50 — 36; 51 — 51; 52 — 63; серотип 0:3: 53 — Mollaret III; 54 — B-19; 55

— 1870; 56 — Pfeifferi; серотип 0:3: 57 — 1445; серотип 0:1: 58 — H2; 59 — H3; 60 — 7; 61 — 9;

62 — 31; 63 — 34.

Y pseudotuberculosis с псевдогеном порина. Все штаммы Y. pseudotuberculosis, выбранные для секвенирования гена порина, относятся к серотипу О:1 (табл. 2). Кроме того, определена нуклеотидная последовательность фрагмента astE — hutG у штаммов Y. pseudotuberculosis серотипа О:3, Аст. 2 и 1442 («бадхызского»).

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Секвенирование ompY осуществлено с помощью праймеров, последовательности которых представлены в табл. 1. Для секвенирования ompY-штамма основного подвида из Аксайского высокогорного очага использовали пары праймеров IH1—IH2, IH3—IH4, IH1—IH4, HSI71—HSI72 и HSI75—HSI76. Для секвенирования ompY-штамма основного подвида из Кызылкумского пустынного очага, штаммов неосновных подвидов, штамма Y. pseudotuberculosis с интактным геном порина — пары праймеров IH1—IH4, HSI71—HSI72 и HSI75— HSI76. Для секвенирования псевдогенов ompY-штаммов Y. pseudotuberculosis — пары праймеров HSI81—HSI82, HSI83—HSI84, HSI81—IH2, HSI84—IH3, HSI71— HSI72 и HSI75—HSI76. Для секвенирования области astE— hutG применили праймеры HSI61-Tan2.

Нуклеотидная последовательность интактного гена ompY Y.pestis и Y. pseudotuberculosis

При сравнении нуклеотидных последовательностей ompY-штамма основного подвида из Кызылкумского

пустынного очага, всех штаммов неосновных подвидов, штаммов таласской группы и штамма Y. pseudotuberculosis Аст. 2618 с помощью компьютерной программы Mega 4,0 обнаружена их идентичность. Изучение гомологии нуклеотидной последовательности общей для исследованных штаммов и последовательностей, депонированных в GenBank, проведено с помощью программы BLAST. Нуклеотидные последовательности экспериментальных штаммов оказались идентичными нуклео-тидным последовательностям ompY Y. pestis штаммов: Angola (CP000901.1) из группы Pestoides; Pestoides F (CP000668.1) кавказского подвида, 91001 (AE017042.1) биовара micro-tus, а также штамма Y. pseudotuberculosis IP32953 (BX936398.1). Перечисленные зарубежные штаммы Y. pestis по своим фенотипическим и молекулярно-генетическим характеристикам близки штаммам неосновных подвидов [22]. Размер открытой рамки считывания интактного гена порина 1080 п.н. Предполагаемый полипептидный продукт состоит из 360 аминокислот. Молекулярная масса порина 39561 Д. Это кислый белок с pI — 5,53.

Нуклеотидная последовательность трункированных генов по-рина Y.pestis и Y. pseudotuberculosis Секвенирование псевдогена ompY штамма Y.pestis 231 (708) показало, что структура самого гена порина не отличается от структуры изученных интактных ompY. Мобильный элемент IS100 интегрирован в сайт TCTCT гена порина через 870 п.н. после старта (см. рис. 1, а). Последовательность TCTCT фланкирует й100-элемент, так как при встраивании произошла ее прямая дупликация. Мобильный элемент несет на концах несовершенные инвертированные повторы протяженностью 28 п.н. й100-элемент включает 2 перекрывающихся на один нуклеотид, гена транспозаз istA и istB. При встраивании !5100-элемента терминирующий кодон TGA для гена порина образуется через 945 нуклеотидов после старта непосредственно перед началом гена istA. При этом С — терминальный конец порина, отвечающий за образование р-тяжей, формирующих пору, утрачивается.

При BLAST-анализе установлена идентичность нуклеотидных последовательностей псевдогенов ompY штамма Y.pestis 231(708) основного подвида из Аксайского высокогорного очага и штаммов Antiqua (CP000308.1), Z176003 (CP001593.1), D182038 (CP001589.1), D106004 (CP001585.1), UG05-045 (AAYR01000006.1) биовара antiqua; KIM10 + (AE009952.1) биовара medievalis; MG05-1020 (AAYS01000003.1); CA88-4125 (ABCD01000001.1); PEXU2 (ACNS01000003.1) биовара orientalis. Небольшие отличия в нуклеотидных последовательностях псевдогенов ompY обнаружены у двух штаммов биовара orientalis: CO92 (AL590842) и INS (AMQL01000006). Нуклеотидные последовательности ompY у этих штаммов не имели отличий, но в последовательности й100-элемента вы-

явлены делеции двух нуклеотидов G1007 и T1016 в гене istA и нуклеотида G7 в гене istB. Делеции приводят к сдвигу рамок считывания генов istA и istB. В результате для обоих генов появляется единый терминирующий ко-дон TGA, расположенный через 24 нуклеотида от начала istB. При этом размеры istA увеличиваются на 16 нуклеотидов, а карбоксильный конец полипептида IstA изменяется и приобретает 7 дополнительных аминокислот. Для istB появление нового терминирующего кодона приводит к преждевременной терминации с нарушением функции гена. Эти изменения не мешают процессу рекомбинации между фланкирующими pgm область IS100, но стабилизируют положение IS100 в гене ompY.

Нуклеотидные последовательности псевдогенов ompY штаммов Y. pseudotuberculosis также идентичны последовательностям изученных интактных генов по-рина. Кроме того, они включают полную последовательность й100-элемента, идентичную последовательности IS100 из псевдогена ompY штамма Y.pestis 231(708), но в инвертированной ориентации (см. рис. 1, а). Различными оказались и сайты встраивания й100-элемента в генах чумного (TCTCT) и псевдотуберкулезного (AGAAAG расположен через 670 п.н. после старта) микробов. Преждевременная терминация транскрипции гена порина в этом случае происходит за счет появления терминирующего кодона TGA в области инвертированного повтора IS100 с образованием 249 аминокислотного полипептида лишенного пороформирующей способности.

Нуклеотидная последовательность региона astE — hutG у штаммов Y. pseudotuberculosis серотипа 0:3

Секвенирование 1228 п.н. региона astE — hutG у штаммов Y. pseudotuberculosis Аст.2 и 1442 позволило определить точные границы крупной делеции, отличающей штаммы серотипа 0:3 (см. рис. 1, в). Оказалось, что фрагмент astE — hutG включает 557 нуклеотидов от начала astE, после которых начинается делеция, захватывающая ompY и заканчивающаяся через 25 нуклеотидов после его терминирующего кодона по генетической карте штамма Y. pseudotuberculosis IP32953. При сравнении нуклеотидных последовательностей astE у штаммов Y.

pseudotuberculosis Аст. 2, 1442, IP32953 и Y pestis C092 с помощью алгоритма BLAST, выявлена вариабельность двух нуклеотидов — 365 и 457 после старта. Нуклеотид T365 отличает последовательности штаммов Y. pseudotuberculosis серотипа 0:3 от штаммов серотипа 0:1 и Y. pestis C092 (C365). Нуклеотид G457 отличает штамм Y. pseudotuberculosis 1442, выделенный на холмогорье Бадхыз, от остальных (T457) штаммов. Область межгенного пространства ompY — hutG у штаммов Y. pseudotuberculosis Аст.2 и 1442 полностью совпадает. При сравнении этой области с последовательностями, депонированными в GenBank, выявлены два региона тандемных повторов и вставка последовательности размером 361 п.н., специфичной для штаммов Y pseudotuberculosis. Первый регион представлен повторами (AT4GAAAG)n. Все последовательности штаммов Y. pseudotuberculosis содержали вставку нуклеотида A непосредственно перед повторами (AT4GAAAG)n по сравнению с последовательностью штамма Y. pestis C092. У этого штамма присутствует 8 повторов ATAGAAAG, у всех штаммов Y. pseudotuberculosis только 2 повтора, причем второй повтор несовершенный — ATAGAACG. Второй регион представлен четырьмя повторами CAAGTAAT у Y. pestis C092, двумя — у Y. pseudotuberculosis IP32953, а штаммы серотипа 0:3 Y. pseudotuberculosis содержат 2 повтора CAAGTAAC, один CAAGCAAC и один CAAGTAAT. Вставка размером 361 п.н. внедрена через 15 нуклеоти-дов после первого региона тандемных повторов, разделяя два региона тандемных повторов у всех штаммов Y. pseudotuberculosis. Нуклеотидная последовательность вставки у Y. pseudotuberculosis Аст.2 и 1442 идентична и отличается от последовательности Y. pseudotuberculosis IP32953 пятью единичными нуклеотидными заменами: 53A ^ C, 206A ^ G, 221A ^ G, 261A ^ G, 290T ^ A.

В настоящее время установлено клоновое происхождение возбудителя чумы Y. pestis от Y. pseudotuberculosis [23], поэтому неудивительно, что наряду с существующими различиями эти микроорганизмы имеют много общего. Это касается как структуры генов вирулентности, так и жизнеобеспечения. В то же время вид Y. pestis

Таблица 2

Штаммы патогенных иерсиний, отобранные для определения нуклеотидных последовательностей гена порина ompY

Штамм Очаг, место выделения Источник выделения Год выделения Ген порина ompY

Y. pestis.pestis 231 (708) Аксайский высокогорный очаг Серый сурок 1947 Нарушенный /5100

Y. pestis.pestis KM803 (А-1822) Кызылкумский пустынный очаг Большая песчанка 1983 Интактный

Y. pestis.altaica KM683 (И-2359) Алтайский горный Блохи монгольской пищухи 1973

Y. pestis altaica И-3340 Блохи длиннохвостого суслика 1992

Y. pestis ulegeica И-3069 Монголия, Убурхангай Полевка Брандта 1982 "

Y.pestis.hissarica А-1249 Гиссарский высокогорный очаг Арчевая полевка 1970 "

Y.pestis caucasica 1146 Зангезуро-Карабахский очаг Обыкновенная полевка 1962 "

Y.pestis.talassica A-1802 (21/10) Таласский высокогорный очаг Блохи мыши полевки 1980 "

Y.pseudotuberculosis Аст.2618 (0:1) серотип Астрахань Нет данных 1980 "

Y.pseudotuberculosis А-17 (0:1) серотип Алма-Ата Испражнения больного 1977 Нарушенный IS 100

Y.pseudotuberculosis А-2526 (0:1) серотип " То же 1977 То же

Y.pseudotuberculosis 251-Д (0:1) серотип Дагестан Нет данных 1966 " "

Y.pseudotuberculosis 141-Д (0:1) серотип " То же 1968 " "

Y.pseudotuberculosis 414 (0:1) серотип Астраханская область " " 1982 " "

Y.pseudotuberculosis Аст.2 (0:3) серотип Гребенщиковая песчанка 1980 Ген порина отсутствует

Y.pseudotuberculosis 1442 (0:3) серотип Туркмения, холмогорье Бадхыз 54 Большая песчанка 1976 То же

не мономорфен и штаммы отдельных подвидов и био-варов имеют как сходства, так и различия и между собой и со своим предшественнником Y. pseudotuberculosis. На основе дифференцирующих признаков базируется внутривидовая классификация, разделяющая представителей Y. pestis на подвиды, основной — Y pestis ssp. pestis и неосновные — Y. pestis ssp. caucasica, Y. pestis ssp. hissarica, Y. pestis ssp. altaica, Y. pestis ssp. ulegeica. Дополнительно описана таласская группа, близкая к неосновным подвидам. Было высказано предположение о промежуточном положении штаммов Y. pestis неосновных подвидов с низкой эпидемической значимостью между штаммами Y pseudotuberculosis и высоковирулентными штаммами Y. pestis основного подвида в эволюционном процессе [24].

Проведенные исследования показали высокую консервативность (идентичность) нуклеотидной последовательности гена ompY, граничащего с pgm-областью, у штаммов патогенных иерсиний: Y. pestis и Y. pseudotuberculosis. Установлено, что ген ompY может находиться у штаммов этих двух видов в интакт-ном или нарушенном й100-элементом состоянии. При этом все штаммы Y. pestis с низкой эпидемической значимостью (неосновных подвидов, таласской группы, группы Pestoides, биовара microtus) независимо от ареала их распространения несут интактный ген. Высоковирулентные штаммы Y. pestis с интактным геном ompY, выявленные нами в Кызылкумском пустынном, Приаральско-Каракумском пустынном, Прикаспийском песчаном очагах, не получили широкого распространения и выглядят как промежуточное звено между штаммами неосновных подвидов и основного подвида с инактивированным геном ompY или как отдельная эволюционная линия. Более уверенно об этом можно будет говорить после широкого изучения структурной организации их геномов. Не исключено, что подобные штаммы возникли и сохранились только в определенных ландшафтно-экологических районах. Другое возможное объяснение появления таких штаммов связано со способностью IS-элементов к точному исключению из места встраивания. Однако наши многолетние наблюдения за штаммами Y.pestis, несущими интактный и инактивированный ген ompY, при разных температурах на различных питательных средах при проведении их через организм биопробных животных и блох показали, что все эти манипуляции не приводили к исключению или внедрению IS100 в ген ompY. Более того, даже при клонировании IS100 под сильными промоторами вырезание мобильного элемента являлось неточным и приводило к возникновению делеций как в окружающих областях, так и в нем самом. Прецеденты точного исключения IS100 из места встраивания неизвестны. Подавляющее большинство высоковирулентных штаммов Y. pestis с большой эпидемической значимостью (штаммы основного подвида, биоваров antiqua, medievalis, orientalis) из разных географических регионов содержат нарушенный й100-элементом ген ompY. Для всех штаммов Y. pestis ориентация и сайт встраивания IS100 (TCTCT) одинаковы. Нуклеотидная последовательность встроенных IS100 идентична у штаммов Y. pestis 231 (708), био-варов antiqua, medievalis и штаммов биовара orientalis, выделенных на Мадагаскаре (MG05-1020), в Калифорнии (CA88-4125) и Бразилии (PEXU2). Такая структура превалируют среди IS100 из разных сайтов внедрения в геномах Y.pestis, депонированных в GenBank. Эксклюзивные последовательности й100-элементов с делецией трех нуклеотидов обнаружены у штаммов биовара orientalis CO92 (Колорадо) и INS (Перу). Даже в геномах

этих двух штаммов IS100 с такими делециями выявлены только в генах ompY. Причина данных мутаций не ясна.

У большинства штаммов Y. pseudotuberculosis серо-типа О:1, генетически наиболее близких штаммам Y. pestis, ген порина находится в интактном состоянии. Однако нами обнаружено несколько штаммов этого сероти-па с геном порина, инактивированным й100-элементом. Внедрение IS100 в сайт AGAAAG у данных штаммов произошло в инвертированной позиции по сравнению с IS100 штаммов Y. pestis, что исключает у них возможность делетирования всей области пигментации. Характерно, что существование штаммов Y. pseudotuberculosis серотипа О:1 с инактивированным геном по-рина — явление столь же редкое, как и существование штаммов основного подвида Y. pestis с интактным геном порина. Кроме штаммов Y. pseudotuberculosis О:1, большое сходство по ряду признаков со штаммами Y. pestis проявляют штаммы Y. pseudotuberculosis, выделенные на холмогорье Бадхыз. Ранее их даже относили к виду Y.pestis. Позднее на основе микробиологических тестов эти штаммы были идентифицированы как Y. pseudotuberculosis серотипа О:1 и O:3. При изучении гена порина у этих штаммов мы обнаружили интактный ген у штаммов серотипа О:1 и его отсутствие у штаммов серотипа O:3. В то же время известен штамм Y. pseudotuberculosis III O:3 серотипа, геном которого содержит ген ompY (GenBank NC_010465). У всех изученных нами штаммов Y. pseudotuberculosis серотипа O:3 «бадхызских» и выделенных в других регионах выявлена делеция, захватывающая ген ompY и часть расположенного рядом astE. Это предполагает, что делеция генов ompY и astE у штаммов серотипа O:3 происходит с очень высокой частотой. Подобная структурная организация области hutG-astB не встречается у штаммов Y. pestis и Y. pseudotuberculosis других серотипов. Такая структурно-функциональная особенность штаммов Y. pseudotuberculosis серотипа О: 3 свидетельствует об их значительной эволюционной отдаленности от штаммов Y.pestis.

Ген ompY патогенных иерсиний проявляет высокую степень гомологии с геном порина nmpC штаммов E. coli. У большинства штаммов E. coli ген nmpC инактивирован внедрением IS5. Причина широкой распространенности инактивированных генов nmpC до сих пор неизвестна, но высказывается предположение, что ген может восстанавливаться после исключения IS5 [25, 26]. Экспрессия Nmp-поринов увеличивает чувствительность клеток к ряду колицинов и фагов [27], а также наряду с другими факторами обеспечивает терморезистентность E. coli [28]. Возможно, внедрение и исключение IS5 выполняют роль регулятора экспрессии гена порина в зависимости от условий окружающей среды. Если ген ompY проявляет подобные функциональные свойства, можно предположить, что инактивация порина приводит к резистентности Yersinia к каким-то бактериоцинам и фагам.

Вместе с тем возникает вопрос о том, почему большинство высоковирулентных штаммов Y. pestis несут ген порина, инактивированный й100-элементом, а штаммы с избирательной вирулентностью — интактный. Как показывают наши исследования и исследования зарубежных авторов [29], высокая стабильность сохранения области pgm и признаков пигментации и чувствительности к пестицину у штаммов Y. pestis неосновных подвидов и группы Pestoides связана с отсутствием у них одного из фланкирующих область pgm й100-элементов, а именно IS100 в гене порина. В результате исключается возможность образования мутантов с делецией всей области, которые появляются с высокой частотой 10-5. Такие штаммы с избирательной вирулентностью вызывают более

длительный инфекционный процесс, чем высоковирулентные штаммы Y. pestis основного подвида. Вероятно, внедрение /5100-элемента в ген порина, обеспечивая клеткам возможность элиминировать pgm-область вместе с островом «высокой патогенности», служит своего рода регулятором численности популяции высоковирулентных штаммов, сдерживая молниеносность инфекционного процесса и способствуя распространению эпизоотии. Если это предположение верно, легко объясняется немногочисленность выявленных менее пластичных штаммов Y. pestis основного подвида с интактным геном порина. У штаммов Y. pseudotuberculosis, значительно менее опасных, чем штаммы Y. pestis, внедрение IS100 в ген пори-на не приводит к образованию мутантов с делецией всей области пигментации. Впрочем, в этом и нет необходимости, так как утрата признаков пигментации и/или чувствительности к пестицину происходит у них с высокой частотой (10-4), вероятно, за счет внутригенных мутаций в hms-опероне [30] и делеций острова высокой патогенности или его части, включающей гены psn, ybtE, IS100 [30, 31]. В данном случае внедрение IS100 в ген порина не давало клеткам псевдотуберкулезного микроба никаких преимуществ и, видимо, поэтому штаммы с нарушенным геном порина не получили широкого распространения. Тогда как у Y. pestis прослеживается четкая связь широкого распространения аллеля с трункированным геном порина, с одной стороны, со стабилизацией экспрессии признаков, ассоциированных с областью pgm (по сравнению с Y pseudotuberculosis), и с другой стороны, с усилением вирулентности относительно штаммов неосновных подвидов с интактным геном порина.

ЛИТЕРАТУРА

1. Sulakvelidze A. Yersiniae other than Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis, and Y. pestis: the ignored species. Microbes Infect. 2000; 2 (5): 497—513.

2. Nikaido H. Porins and specific diffusion channels in bacterial outer membranes. J. Biol. Chem. 1994; 269 (6): 3905—8.

3. Новикова О.Д., Хоменко В.А., Емельяненко В.И., Лихацкая Г.Н., Зелепуга Е.А., Ким Н.Ю. и др. OmpC-подобный порин из Yersinia pseudotuberculosis: молекулярная характеристика, физико-химические и функциональные свойства. Биологические мембраны. 2011; 28 (2): 95—110.

4. Gao H., Zhang Y., Yang L., Liu X., Guo Z., Tan Y. et al. Phenotypic and transcriptional analysis of the osmotic regulator OmpR in Yersinia pestis. BMC Microbiol. 2011; 11:39. doi: 10.1186/1471-2180-11-39. (23 Feb 2011).

5. Likhatskaya G.N., Solov'eva T.F., Novikova O.D., Issaeva M.P., Guzev K.V., Kryzhko I.B. et al. Homology models of the Yersinia pseudotu-berculosis and Yersinia pestis general porins and comparative analysis of their functional and antigenic regions. J. Biomol. Struct. Dyn. 2005; 23 (2): 163—74.

6. Stenkova A.M., Isaeva M.P., Shubin F.N., Rasskazov V.A., Rakin A.V. Trends of the major porin gene (ompF) evolution: insight from the genus Yersinia. PLoS One. 2011; 6 (5): e20546. doi: 10.1371/journal. pone.0020546. (Accessed 31 May 2011).

7. Solov'eva T.F., Likhatskaya G.N., Khomenko V.A., Stenkova A.M., Kim N.Y., Portnyagina O.Y. et al. A novel OmpY porin from Yersinia pseudotuberculosis: structure, channel-forming activity and trimer thermal stability. J. Biomol. Struct. Dyn. 2011; 28 (4): 517—33.

8. Perry R.D., Pendrak M., Schuetze P. Identification and cloning of a hemin storage locus involved in the pigmentation phenotype of Yersinia pestis. J. Bacteriol. 1990; 172 (10): 5929—37.

9. Darby C., Hsu J.W., Ghori N., Falkow S. Caenorhabditis elegans: plague bacteria biofilm blocks food intake. Nature. 2002; 417: 243—4.

10. Bobrov A.G., Kirillina O., Forman S., Mack D., Perry R.D. Insights into Yersinia pestis biofilm development: topology and co-interaction of Hms inner membrane proteins involved in exopolysaccharide production. Environ. Microbiol. 2008; 10 (6): 1419—32.

11. Kutyrev V.V., Filippov A.A., Oparina O.S., Protsenko O.A. Analysis of Yersinia pestis chromosomal determinants Pgm(+) and Pst(s) associated with virulence. Microb. Pathog. 1992; 12: 177—86.

12. Fetherston J.D., Schuetze P., Perry R.D. Loss of the pigmentation phe-notype in Yersinia pestis is due to the spontaneous deletion of 102 kb of chromosomal DNA which is flanked by a repetitive element. Mol. Microbiol. 1992; 6 (18): 2693—704.

13. Fetherston J.D., Perry R.D. The pigmentation locus of Yersinia pestis KIM6 + is flanked by an insertion sequence and includes the structural genes for pesticin sensitivity and HMWP2. Mol. Microbiol. 1994; 13 (4): 697—708.

14. Hare J.M., Wagner A.K., McDonough K.A. Independent acquisition and insertion into different chromosomal locations of the same patho-genicity island in Yersinia pestis and Yersinia pseudotuberculosis. Mol. Microbiol. 1999; 31 (1): 291—303.

15. Куклева Л.М., Ерошенко Г.А., Шавина Н.Ю., Павлова А.И., Ку-тырев В.В. Сравнительный анализ распределения псевдогенов в геномах штаммов основного и неосновных подвидов возбудителя чумы. Мол. генетика. 2009; (2): 32—6.

16. Булгакова Е.Г., Краснов Я.М., Гаева А.В., Сухоносов И.Ю., Аниси-мова Л.В., Новичкова Л.А. и др. Особенности проявления признака пигментации и структурные различия генов hms оперона у штаммов Yersinia pestis и Yersinia pseudotuberculosis разного происхождения. Проблемы особо опасных инфекций. 2011; [2 (108)]: 30—5.

17. Мартиневский И.Л. Биология и генетические особенности чумного и близкородственных ему микробов. М.: Медицина; 1969.

18. Мартиневский И.Л., Степанов В.М., Кенжебаев А.Я. Таксономия, мутация и генетика патогенности чумного и родственных ему микробов. Нукус: Издательство «Каракалпакастан»; 1990.

19. Гаева А.В., Булгакова Е.Г., Сухоносов И.Ю., Анисимова Л.В., Новичкова Л.А., Кутырев В.В. Идентификация и внутривидовое ти-пирование штаммов чумного микроба с определением их потенциальной вирулентности методом ПЦР. Проблемы особо опасных инфекций. 2011; [2 (108)]: 36—41.

20. Слудский А.А., Дерлятко К.И., Головко Э.Н., Агеев В.С. Гиссар-ский природный очаг чумы. Саратов: Издательство Саратовского университета; 2003.

21. Онищенко Г.Г., Кутырев В.В. Природные очаги чумы Кавказа, При-каспия, Средней Азии и Сибири. М.: ОАО «Издательство «Медицина»; 2004.

22. Платонов М.Е., Евсеева В.В., Ефременко Д.В., Кузнецова И.П., Чиркова Е.В., Дентовская С.В. и др. DFR-типирование штаммов Yersinia pestis из природных очагов СНГ. Проблемы особо опасных инфекций. 2011; [2 (108)]: 42—5.

23. Achtman M., Zurth K., Morelli G., Torrea G., Guiyoule A., Carniel E. Yersinia pestis, the cause of plague, is a recently emerged clone of Ye -rsinia pseudotuberculosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999; 96 (24): 14043—8.

24. Куклева Л.М., Проценко О.А., Кутырев В.В. Современные представления о родстве возбудителей чумы и псевдотуберкулеза. Мол. генетика. 2002; (1): 3—7.

25. Prilipov A., Phale P.S., Koebnik R., Widmer C., Rosenbusch J.P. Identification and characterization of two quiescent porin genes, nmpC and ompN, in Escherichia coli BE. J. Bacteriol. 1981; 180 (13): 3388—92.

26. Highton P.J., Chang Y., Marcotte W.J., Jr., Schnaitman C.A. Evidence that the outer membrane protein gene nmpC of Escherichia coli K-12 lies within the defective qsr' prophage. J. Bacteriol. 1985; 162 (1): 256—62.

27. Pugsley A.P., Schnaitman C.A. Identification of three genes controlling production of new outer membrane pore proteins in Escherichia coli K-12. J. Bacteriol. 1978; 135 (3): 1118—29.

28. Ruan L., Pleitner A., Ganzle M.G., McMullen L.M. Solute transport proteins and the outer membrane protein NmpC contribute to heat resistance of Escherichia coli AW1.7. Appl. Environ. Microbiol. 2011; 77 (9): 2961—7. doi: 10.1128/AEM.01930-10. (Accessed 11 Mart 2011).

29. Zhou D., Tong Z., Song Y., Han Y., Pei D., Pang X. et al. Genetics of metabolic variations between Yersinia pestis biovars and the proposal of a new biovar, microtus. J. Bacteriol. 2004; 186 (15): 5147—52.

30. Buchriesier C., Brosch R., Bach S., Guiyoule A., Carniel E. The high-pathogenicity island of Yersinia pseudotuberculosis can be inserted into any of the three chromosomal asn tRNA genes. Mol. Microbiol. 1998; 30 (5): 965—78.

31. Rakin A., Schubert S., Pelludat C., Brem D., Heesemannn J. The high-pathogenicity island of Yersiniae. In: Pathogenicity Island and Other Mobile Virulence Elements. ASM Press. 1999: 77—90.

Поступила 02.02.15

REFERENCES

1. Sulakvelidze A. Yersiniae other than Y. enterocolitica, Y. pseudotuber-culosis, and Y. pestis: the ignored species. Microbes Infect. 2000; 2 (5): 497—513.

2. Nikaido H. Porins and specific diffusion channels in bacterial outer membranes. J. Biol. Chem. 1994; 269 (6): 3905—8.

3. Novikova O.D., Khomenko V.A., Emel'yanenko V.I., Likhatskaya G.N., Zelepuga E.A., Kim N.Yu. et al. OmpC_Like Porin from Yers-inia pseudotuberculosis: molecular characteristics, Physico-chemical and functional properties. Biologicheskie membrany. 2011; 28 (2): 95—110. (in Russian)

4. Gao H., Zhang Y., Yang L., Liu X., Guo Z., Tan Y. et al. Phenotypic and

transcriptional analysis of the osmotic regulator OmpR in Yersinia pestis. BMC Microbiol. 2011; 11:39. doi: 10.1186/1471-2180-11-39. (23 Feb 2011).

5. Likhatskaya G.N., Solov'eva T.F., Novikova O.D., Issaeva M.P., Guzev K.V., Kryzhko I.B. et al. Homology models of the Yersinia pseudotu-berculosis and Yersinia pestis general porins and comparative analysis of their functional and antigenic regions. J. Biomol. Struct. Dyn. 2005; 23 (2): 163—74.

6. Stenkova A.M., Isaeva M.P., Shubin F.N., Rasskazov V.A., Rakin A.V. Trends of the major porin gene (ompF) evolution: insight from the genus Yersinia. PLoS One. 2011, 6 (5): e20546. doi: 10.1371/journal. pone.0020546. (Accessed 31 May 2011).

7. Solov'eva T.F., Likhatskaya G.N., Khomenko V.A., Stenkova A.M., Kim N.Y., Portnyagina O.Y. et al. A novel OmpY porin from Yersinia pseudotuberculosis: structure, channel-forming activity and trimer thermal stability. J. Biomol. Struct. Dyn. 2011; 28 (4): 517—33.

8. Perry R.D., Pendrak M., Schuetze P. Identification and cloning of a hemin storage locus involved in the pigmentation phenotype of Yersinia pestis. J. Bacteriol. 1990; 172 (10): 5929—37.

9. Darby C., Hsu J.W., Ghori N., Falkow S. Caenorhabditis elegans: plague bacteria biofilm blocks food intake. Nature. 2002; 417: 243—4.

10. Bobrov A.G., Kirillina O., Forman S., Mack D., Perry R.D. Insights into Yersinia pestis biofilm development: topology and co-interaction of Hms inner membrane proteins involved in exopolysaccharide production. Environ. Microbiol. 2008; 10 (6): 1419—32.

11. Kutyrev V.V., Filippov A.A., Oparina O.S., Protsenko O.A. Analysis of Yersinia pestis chromosomal determinants Pgm(+) and Pst(s) associated with virulence. Microb. Pathog. 1992; 12: 177—86.

12. Fetherston J.D., Schuetze P., Perry R.D. Loss of the pigmentation phe-notype in Yersinia pestis is due to the spontaneous deletion of 102 kb of chromosomal DNA which is flanked by a repetitive element. Mol. Microbiol. 1992; 6 (18): 2693—704.

13. Fetherston J.D., Perry R.D. The pigmentation locus of Yersinia pestis KIM6 + is flanked by an insertion sequence and includes the structural genes for pesticin sensitivity and HMWP2. Mol. Microbiol. 1994; 13 (4): 697—708.

14. Hare J.M., Wagner A.K., McDonough K.A. Independent acquisition and insertion into different chromosomal locations of the same patho-genicity island in Yersinia pestis and Yersinia pseudotuberculosis. Mol. Microbiol. 1999; 31 (1): 291—303.

15. Kukleva L.M., Eroshenko G.A., Shavina N.Yu., Pavlova A.I., Kutyrev V.V. Comparative analysis of the nutrient requirements among Yersinia pestis strains of the main and non-main subspecies as well as genetic causes of their auxotrophy. Mol. genetika. 2009; (2): 32—6. (in Russian)

16. Boolgakova E.G., Krasnov Ya.M., Gaeva A.V., Sukhonosov I.Yu., Ani-simova L.V., Novichkova L.A. et al. Peculiarities of pigmentation expression and structural differences of hms operon genes in Y. pestis and Y. pseudotuberculosis strains of diverse origin. Problemy osobo opas-nykh infektsiy. 2011; [2 (108)]: 30—5. (in Russian)

17. Martinevskiy I.L. Biology and Genetic Features of Plague and the Closely Related to Him Microbes. Moscow: Meditsina; 1969. (in Russian)

18. Martinevskiy I.L., Stepanov V.M., Kenzhebaev A.Ya. Taxonomy, Genetics and Mutation Pathogenicity ofthe Plague and Related Microbes. Nukus: Izdatel'stvo "Karakalpakastan"; 1990. (in Russian)

19. Gaeva A.V., Boolgakova E.G., Sukhonosov I.Yu., Anisimova L.V., Novichkova L.A., Kutyrev V.V. Identification and intraspecific typing of plague microbe strains with their potential virulence determination using PCR. Problemy osobo opasnykh infektsiy. 2011; [2 (108)]: 36— 41. (in Russian)

20. Sludskiy A.A., Derlyatko K.I., Golovko E.N., Ageev V.S. Hissar Natural Foci of Plague. Saratov: Izdatel'stvo Saratovskogo universiteta; 2003. (in Russian)

21. Onishchenko G.G., Kutyrev V.V. Natural Plague Foci in the Caucasus, Caspian Sea Region, Middle Asia and Siberia. Moscow: OAO «Izdatel'stvo «Meditsina»; 2004. (in Russian)

22. Platonov M.E., Evseeva V.V., Efremenko D.V., Kuznetsova @, Chirk-ova E.V., Dentovskaya S.V. et al. DFR-typing of Yersinia pestis strains from the CIS natural foci. Problemy osobo opasnykh infektsiy. 2011; [2 (108)]: 42—5. (in Russian)

23. Achtman M., Zurth K., Morelli G., Torrea G., Guiyoule A., Carniel E. Yersinia pestis, the cause of plague, is a recently emerged clone of Ye -rsinia pseudotuberculosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999; 96 (24): 14043—8.

24. Kukleva L.M., Protsenko O.A., Kutyrev V.V. Modern views on the relationship of plague and pseudotuberculosis. Mol. genetika. 2002; (1): 3—7. (in Russian)

25. Prilipov, A., Phale P.S., Koebnik R., Widmer C., and Rosenbusch J.P. Identification and characterization of two quiescent porin genes, nmpC and ompN, in Escherichia coli BE. J. Bacteriol. 198 l; 180 (13): 3388—92.

26. Highton P.J., Chang Y., Marcotte W.J., Jr., Schnaitman C.A. Evidence that the outer membrane protein gene nmpC of Escherichia coli K-12 lies within the defective qsr' prophage. J. Bacteriol. 1985; 162 (1): 256—62.

27. Pugsley A.P., Schnaitman C.A. Identification of three genes controlling production of new outer membrane pore proteins in Escherichia coli K-12. J. Bacteriol. 1978; 135 (3): 1118—29.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

28. Ruan L., Pleitner A., Ganzle M.G., McMullen L.M. Solute transport proteins and the outer membrane protein NmpC contribute to heat resistance of Escherichia coli AW1.7. Appl. Environ. Microbiol. 2011; 77 (9): 2961—7. doi: 10.1128/AEM.01930-10. (Accessed 11 Mart 2011).

29. Zhou D., Tong Z., Song Y., Han Y., Pei D., Pang X. et al. Genetics of metabolic variations between Yersinia pestis biovars and the proposal of a new biovar, microtus. J. Bacteriol. 2004; 186 (15): 5147—52.

30. Buchriesier C., Brosch R., Bach S., Guiyoule A., Carniel E. The high-pathogenicity island of Yersinia pseudotuberculosis can be inserted into any of the three chromosomal asn tRNA genes. Mol. Microbiol. 1998; 30 (5): 965—78.

31. Rakin A., Schubert S., Pelludat C., Brem D., Heesemannn J. The high-pathogenicity island of Yersiniae. In: Pathogenicity Island and Other Mobile Virulence Elements. ASM Press. 1999: 77—90.

STRUCTURAL ORGANIZATION OF PORIN GENES (INTACT AND DISRUPTED BY IS100) BORDERING THE PGM LOCUS OF THE YERSINIA PESTIS AND YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS STRAINS

E. G. Boolgakova, Ya. M. Krasnov, I. Yu. Sukhonosov, A. V. Gaeva, L. V.

Anisimova, N. P. Guseva, L. A. Novichkova, V. V. Kutyrev

Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe", Saratov, Russia

In highly virulent strains of Yersinia pestis, the porin gene bordering pigmentation (pgm) locus was observed to be usually broken by IS100. In this case, the pgm locus that carries virulence genes (high pathogenicity island) and biofilm formation genes (hms operon) is flanked by direct copies of IS100, which can cause its destabilization. We studied the prevalence of the intact and disrupted porin genes among 240 strains of Y. pestis from 39 natural centers in Russia and abroad, and 68 strains of Yersinia pseudotuberculosis from different geographical regions. The majority of the highly virulent Y. pestis strains and some phylogenetic lines of Y. pseudotuberculosis 0:1 serotype contain disrupted porin genes. At the same time, deletion of the pgm locus by flanking IS100 in Y. pseudotuberculosis is impossible, because IS100 is integrated in the porin gene in the reverse orientation as compared to Y. pestis. The porin genes are intact in all Y. pestis strains with low epidemic importance and some phylogenetic lines of highly virulent Y. pestis strains from some desert foci and Caspian sandy focus, as well as most strains of Y. pseudotuberculosis 0:1 serotype. Less virulent strains of Y. pseudotuberculosis 0:3 serotype revealed extensive deletion, which included the porin gene and a portion of the gene astE. The nucleotide sequence of the porin genes in Y. pestis and Y. pseudotuberculosis strains from different geographical regions are identical. Three alleles of the porin gene differ solely by the site of integration and orientation of IS100 or by the lack of integration. The nucleotide sequence of IS100, embedded in the porin gene of Yersinia, has minor differences only in two Y. pestis strains isolated in America. Low frequency of Hms- mutations correlates with the intact condition of the porin gene in Y. pestis. This correlation is absent in Y pseudotuberculosis.

Key words: Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis, porin gene, pigmentation (pgm) locus, astE-hutG region, sequencing

DOI 10.18821/0208-0613-2016-34-2-49-57 Funding. The study was not supported by sponsors.

Conflicts of interest. The authors declare that there is no conflict of interest.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.