CC BY
51
Rcqiilatorv Mechanisms I
mTnosystems
Regulatory Mechanisms
in Biosystems
ISSN 2519-8521 (Print) ISSN 2520-2588 (Online) Regul. Mech. Biosyst., 9(2), 148-155 doi: 10.15421/021822
Activity of nitrogen fixation and antioxidant enzymes in symbiotic systems Glycine max - Bradyrhizobium japonicum for complex treatment with lectin and fungicides
S. Y. Kots, T. P. Mamenko, A. V. Pavlyshche
Institute of Plant Physiology and Genetics, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, Ukraine
Article info
Received 02.02.2018 Received in revised form
27.03.2018 Accepted 29.03.2018
Institute of Plant Physiology and Genetics, National Academy of Sciences of Ukraine, Vasylkivska st., 31/17, Kyiv, 03022, Ukraine. Tel.: +38-044-257-51-50. E-mail: t_mamenko@ukt.net
Kots, S. Y., Mamenko, T. P., & Pavlyshche, A V. (2018). Activity of nitrogen fixation and antioxidant enzymes in symbiotic systems Glycine max - Bradyrhizobium japonicum for complex treatment with lectin and fungicides. Regulatory Mechanisms in Biosystems, 9(2), 148-155. doi:10.15421/021822
The dynamics of the nitrogen fixation activity of the root nodules, the growth of the vegetative mass of plants and the change in the activity of antioxidant enzymes (superoxide dismutase, ascorbate and guaiacol peroxidase) in different soybean organs for treatment of seeds by rhizobia incubated with lectin, in combination with fungicides have been studied. The objects of the study were symbiotic systems formed with the participation of soybean (Glycine max (L.) Merr.) Almaz and Bradyrhizobium japonicum (standard strain 634b) incubated with lectin. As disinfectants of soybean seeds, the following preparations with fungicidal activity were used - Maxim XL 035 PS, Fever, Standak Top according to one rate of active substance consumption of each preparation specified by the manufacturer. One part of the seeds treated with fungicides was inoculated with pure culture of suspension of rhizobia for one hour (titre of suspension concentration was 108 cells/ml). Another part of the seeds treated with fungicides was inoculated with rhizobia suspension, which was previously incubated with a solution of commercial lectin soybean at a concentration of 100 ^g/ml. The research was conducted in strictly controlled conditions of a model vegetative experiment using microbiological, physiological, biochemical methods, gas chromatography, spectrophotometry. It was found that processing of soybean seeds with fungicides (Fever and Maxim XL) together with rhizobium inoculation contributed to the preservation of the nitrogen fixation activity of the root nodules and the growth of vegetative mass of plants. Under these conditions, the intensification of the activity of superoxide dismutase and ascorbate peroxidase was observed, as well as inhibition of the activity of guaiacol peroxidase in soybean root nodules in the phase of three true leaves and increased activity of all investigated enzymes in the phase of mass flowering. It has been established that the use of complex treatment of seeds by soybean rhizobia incubated with lectin and fungicides leads to an increase in the activity of superoxide dismutase and guaiacol peroxidase in root nodules in the phase of three true leaves and the growth of the activity of ascorbate peroxidase in the phase of mass flowering. At the same time, the inhibition of the growth of vegetative mass of plants and their symbiotic properties occurred, as evidenced by the decrease in the nitrogen fixation activity of the root nodules for the joint treatment of seeds with fungicides and lectin. A specific reaction of investigated enzymes in the roots and leaves of soybean was shown, which was more pronounced in the phase of three true leaves, indicating the development of a typical antioxidant reaction to a complex treatment, as a kind of stress that is leveled to the phase of mass flowering. The degree of reaction of antioxidant enzymes in the studied symbiotic systems Glycine max - Bradyrhizobium japonicum depends on the nature of the active substance fungicides and the manifestation of their joint effect in a complex with rhizobia incubated with lectin.
Keywords: soybean; rhizobia; superoxide dismutase; guaiacol peroxidase; ascorbate peroxidase; symbiosis
Актившсть азотфжсацп та антиоксидантних фермен^в у симбттичних системах Glycine max - Bradyrhizobium japonicum за комплексной обробки лектином i фунгщидами
С. Я. Коць, Т. П. Маменко, А. В. Павлище
1нститут фiзiологiiрослин i генетики НАН Украти, Кшв, Украта
Дослщжено дина]шку азотфжсувально! акгивносп кореневих бульбочок, наростання вегетативно! маси рослин та змши активносп антиоксидантних ферменпв (супероксиддисмутази, аскорбат- i гваяколпероксидази) у рiзних органах со! за обробки насшня ризобiями, шкубованими з лектином, у комплекс з фунгщидами. Об'екти дослщження - симбютичш системи, утвореш за участю со! (Glycine max
(L.) Merr.) сорту Алмаз i Bradyrhizobium japonicum (штам-стандарт 634б), iнкубованих i3 лектином. Як протруювачi насiння со! використано препарати з фунгщидною актившстю Максим XL 035 PS, Февер, Стандак Топ i3 розрахунку одше! норми витрат дточо! речовини кожного препарату, вказано! виробником. Одну частину обробленого фунгiцидами насiння iнокулювали чистою культурою суспензи ризобiй протягом одше! години (титр концентраци суспензи становив 108 кл./мл). 1ншу частину обробленого фунгщидами насiння iнокулювали суспензieю ризобщ, яка попередньо була iнкубована з розчином комерцщного лектину со! у концентраци 100 мкг/мл. Дослщження проводили у суворо контрольованих умовах модельного вегетацщного дослiду з використанням м^обюлопчних, фiзiологiчних, бiохiмiчних методiв, газово! хроматограф», спектрофотометри. Обробка насiння со! фунгщидами (Февер i Максим XL) сшльно з iнокуляцieю ризобiями сприяла збереженню азотфжсувально! активностi кореневих бульбочок i наростанню вегетативно! маси рослин. За таких умов обробки вiдбувалась щтенсифжащя активностi супероксиддисмутази та аскорбатпероксидази, а також пригшчення активностi гваяколпероксидази в кореневих бульбочках со! у фазу трьох справжшх листюв та тдвищення активности всiх дослiджуваних ферментiв у фазу масового цвiтiння. Комплексна обробка насшня со! ризобiями, iнкубованими з лектином, i фунгiцидами, пiдвищувала актившсть супероксиддисмутази та гваяколпероксидази в кореневих бульбочках у фазу трьох справжшх листюв та сприяла зростанню активносп аскорбатпероксидази у фазу масового цвтння. При цьому вiдбувалось пригнiчення наростання вегетативно! маси рослин та !х cимбiотичних властивостей, що проявлялось у зниженш азотфжсувально! активности кореневих бульбочок за сшльно! обробки насiння фунгщидами та лектином. Показано специфiчну реакщю досл1джуваних ферментiв у коренях i листках со!, яка була бшьш вираженою у фазу трьох справжшх листков. Це свiдчить про розвиток типово! антиоксидантно! реакци на комплексну обробку як своeрiдний стрес, який нiвелювався до фази масового цвтння. Стутнь реакци дослiджуваних антиоксидантних ферменпв у симбiотичних системах Glycine max -Bradyrhizobiumjaponicum залежав вщ характеру дючо! речовини фунгщидш та прояву !х впливу в комплекта з ризобiями, iнкубованими з лектином.
Ключовi слова: соя; ризоби; супероксиддисмутаза; гваяколпероксидаза; аскорбатпероксидаза; симбiоз
Вступ
Соя - одна з найбшьш високорентабельних передових культур у сшьськогосподарському виробницт Укра!ни та свпу в целому, цшавють до вирощування яко! з кожним роком штенсивно зростае, що вщмчаеться зростанням посiвних площ i урожайной! насшня (Sergienko, 2012; Kobak et al., 2016). Одна з причин недобору врожаю со! - ураження И фггопатогенними мжрооргашзма-ми - втрати врожаю зерна в!д хвороб досягають 30-40%. Тому важлива складова технолог!! вирошування со! - захист !! ввд фгго-патогенних оргатзмпв (Sergienko, 2012).
Все бтьша увага дослщниюв спрямовна до виршення питан-ня порушення р!вноваги в систем! «рослина - патоген - довкшля» (Kobak et al., 2016). У перюд вегетацц рослин варто проводити штегровану систему захисту поов!в, залежно в!д !х фггосантарно-го стану. Це гармоншно поеднан ус! сучаст методи захисту: орга-н!зап!йно-господарськ1, агротехнчн, !мунолопчт, бюлопчш та хмчи засоби (Marco, 2013). Разом !з тим, одна з основних проблем захисту рослин - не стльки використання хмчних засоб!в захисту рослин, сюльки пошук шлях!в зниження р!вня !х шкодо-чинност! для навколишнього середовиша (Mohammadi et al., 2012; Petrichenko & Kots, 2014).
Один !з важливих фактор!в захисту рослин со! в!д хвороб i шюдниюв - обробка насшня протруйниками в комплекс! !з засто-суванням шокулянпв на основ! мжросимбюнпв B. japonicum, яю, у свою чергу, сприяють п1вищенню стресостшкост! та продуктивном! рослин (Nikolaevsky et al., 2017). Рослини со! з активним симб!отичним апаратом ст!йк!ш! до ураження широким спектром хвороб, а ч!тке поеднання вс!х заход!в, направлених на оптим!за-ц!ю симб!озу, сприяе формуванню потужного симб!отичного апа-рату, полыпшенню фггосантарного стану поов!в, п1двищенню ро-дючост! Грунту та отриманню високих урожа!в со! з найкрашими яюсними показниками (Nikolaevsky et al., 2017).
Розкриття особливостей формування захисних реакц!й у сим-б!оз! бобових рослин !з штамами бульбочкових бактер!й важливе для пошуку ефективних симбютичних систем, здатних реал!зува-ти св!й адаптивний потенц!ал за д!! стрес-фактор!в, а розширення та поглиблення дослвджень у цьому напрямку передбачае удос-коналення юнуючих ! створення нових ф!зюлого-бюхмчних засо-б!в регуляц!! !х адаптац!йно! здатност! у стресових умовах (Mo-hammadi et al., 2012).
1нвазш ризобш у клпини кореневих волоск1в бобових подбна до процесу патогенезу - це своер!дний стрес для рослини, який може викликати !нтенсиф!кац!ю окисних процес!в та п!двишення вм!сту активних форм кисню (АФК) (Iturbe-Ormaetxe et al., 2001; Zhiznevskaya, 2001; Matamoros et al., 2003). У свою чергу, АФК можуть виступати як сигнальн! молекули, шо беруть участь в ак-тиващ захисних систем за до стресу, зокрема, шдукувати синтез ферменпв антиоксиданпв (Mittler, 2002). Основний шшктор вть-норадикального окиснення л!п!д!в мембран - супероксид, шо ге-
неруеться у багатьох спонтанних i ензиматичних реакц1ях окис-нення, причому продуктами його вторинного перетворення мо-жуть бути синглетний кисень, цдроксильний радикал, пероксид водню, оргатчт пероксиди та !х радикали (Shao et al., 2008; Shar-ma et al., 2012). Тому ключовий ензим захисту живих оргашзм1в вщ окисно! деструкщ! - супероксиддисмутаза (СОД), яка катал-зуе утворення пероксиду водню та кисню з анюн-радикал1в супероксиду (Raychauhuri & Deng, 2000; Alser et al., 2002). Для утилза-цй пероксиду водню (Н2О2) включаеться комплекс ензим1в: ката-лаза, родина пероксидаз - аскорбатпероксидаза (АПО) та гваяколпероксидаза (ГПО). У лiтературi пероксидазну реакщю розгляда-ють як вщповщь на проникнення ризобш у рослинну клпину (Zhiznevskaya, 2001). Водночас пероксидази можуть нести достат-ньо шформацй про фiзiологiчний стан рослини та слугувати кри-тер!ем стшкосп до дй стресових чинниюв (Matamoros et al., 2003).
1снуе три !зоформи СОД (CuZn-СОД, Fe-СОД i Mn-СОД) у рослинних клпинах, якi вiдрiзняються наявистю металу в активному ценгрi ензиму. Всi вони виявлеш в рослинних фракцях кореневих бульбочок бобових рослин (Moran et al., 2003; Rubio et al., 2004). Р!зна локал1зацк iзоензимiв СОД у тканинах кореневих бульбочок зумовлюе !х спец^ч^ функцй. Зокрема, CuZn-СОД переважае в апекс! бульбочок, особливо в шфекциних нитках, у цитозот, розташованому поряд в клпинними оболонками, та апопласт!. Функця CuZn-СОД може бути пов'язана з ростом rni-тинних стнок у меристемах, шфекциних нитках i апопласт, а також в вщповщдю рослин на бактерТальну шфекцю. Mn-СОД присутнш в шфжованих клпинах кореневих бульбочок i бере участь у процесах, пов'язаних Тз захистом i функцюнуванням сим-бТозу у зртих бульбочках. Fe-СОД локалззований винатково у стромТ хлоропласттв, його функцй менш за все вивчено у бобових рослин. Бактеро!ди м^стять Mn-СОД у цитозол! та CuZn-СОД у периплаз-матичному простор!. Ui ензими кодуються вТдповТдними бактер!-альними sodA i sodC генами (Moran et al., 2003; Rubio et al., 2004).
АПО - ключовий фермент аскорбат-глутатюнового циклу утитзащ Н2О2, основа функцюнування кореневих бульбочок (Dalton et al., 1993). В шфжованих кл^тинах фермент захищае лег-гемоглобТн та шш1 б!лки в!д Н2О2, тод1 як у паренхМ клТтин бульбочок в!н бере участь у створенн! дифузшного бар'еру для кисню, контролюючи таким чином його надходження в 1нф1ковану зону (Schmitz et al., 1997; Dalton et al., 1998).
У рослинних клпинах юнуе так званий Ш клас пероксидаз, як! використовують як субстрати пох1дн1 фенол1в. Ще !х називають неспецифiчними чи класичними. Вони мстяться у вакуолях i ци-топлам, залучена до велико! кТлькост! процеав у рослинних кл!-тинах, зокрема, лнтфшаци, обпробков!ння, катабол!зму ауксину, захисту проти дй патоген1в i окисного стресу (Erofeeva, 2015; Parsiavash et al., 2015). До них вщносять i ГПО.
Важливу роль у формувант захисно! в!дпов1д1 рослин за дй стресових чинникв б!отично! та абютично! природи в1д1грають пол!функц1ональн1 бшки - ф!толектини (Babosha, 2008; Hivrale &
Ingale, 2013). Лектини здатн оборогно та неспециф1чно зв'язувати вуглеводн! залишки р1зно! хмчно! природи, завдяки чому взаемо-дють 1з поверхневими вуглеводами бактер1ально! кл1тини пвд час утворення бобово-ризоб1ального симб1озу (Hoffet al., 2009; Kyry-chenko, 2014). Разом 1з цим, саме лектин-вуглеводна взаемодя забезпечуе зв'язування бактерш i викликае несумсну взаемодю паргнерiв, шдукуючи захисн механзми рослин на ураження патогеном (Chrispeels & Raikhel, 1991; Lehotzky et al., 2010).
Фшолопчна дiя лектинв не обмежуеться лише властивосгя-ми лектин1Б зв'язувати вуглеводнi залишки. 1х розглядать як сиг-нальнi молекули, здатн шдукувати складний ланцюг внугршнх перетворень у клiгинi та И вщповщь (Owens et al., 2001; Kyrychen-ko, 2014). Припускаюгь, що характерна особливють струкгури рослинних лекгинв - це наяБнiсгь ценIрiв цдрофобного зв'язування, що вказуе на наявнють у них самостшних сайга, яю вщповдаюгь за цдрофобну взаемодiю з молекулами невуглеводно! природи, внаслвдок чого вони можуть активно включагися в систему гормонально! регуляцц процеов росгу та розвитку рослин (Moreira et al., 1991; Holf et al., 2009). Зокрема, маючи два центри зв'язування, лектин одним 1з них виб1рково взаемоде з кислими 1зоформами пероксидази, а другим - 1з х1гином. У вщповщь на шфжування патогенами в рослинах активуються кислi 1зоформи пероксидази (анiоннi), яю в комплекс! з лектином виконують захисну функцю (Holf et al., 2009; Kyrychenko, 2014).
Численними дослвдженнями показано, що за викорисгання ек-зогенно! обробки лектинами (передпосiвна обробка насiння чи обприскування рослин июля вегеталщ) змiнююIься ростов1 процеси та метабол1зм рослин (Owens et al., 2001), азотфжсувальних мжро-органiзмiв (Kyrychenko, 2014), фпопатогенних гриб!в (Holf et al., 2009), шдукуеться формування захисних реакцш рослин на дю стресових чинниюв (Babosha, 2008). Як вважае Kyrychenko (2014), це розкривае перспективнють практичного викорисгання таких бткв як природних регуляторiв росгу.
У зв'язку з вищевказаним мета нашо! роботи - дослщити змши активност! АПО та ГПО в р1зних органах рослин со! за обробки насшня ризоб1ями, iнкубованими з лектином спшьно з фунгщидами. Це дозволить з'ясувати додатков1 аспекти рол} цьо-го бшка у формуваннi захисних реакцш симб1огичних систем за участю сполук 1з фунгшидною дею.
Матерiал i методи дослiджень
Об'екги дослщження - симбютичн системи, утворенi за участю со! (Glycine max (L.) Merr.) соргу Алмаз i B. japonicum (штам-сгандарт 634б), шкубован з лектином. Як прогруювачi насшня со! використали препараги з фунгшидною активнютю Февер (Bayer CropScience AG, ННмеччина), Максим XL (Syngenta, Швейцарш), Сгандак Топ (BASF, Кмеччина). Культуру повшьнорослих буль-бочкових бактерiй вирощували на твердому манпно-др1жджово-му середовищ1 прогягом 7 д}6 за 26-28 °С.
Перед пос!вом насiння стерил!зували 70% розчином етанолу та промивали проточною водою. Потм насiння со! обробляли розчинами фунгiцидiБ - Максим XL 035 PS (флудоксонл, 25 г/л, металаксил, 10 г/л), Февер (протюконазол, 300 г/л), Сгандак Топ (фшронш, 250 г/л, тюфанат-метил, 225 г/л, шраклостробш, 25 г/л) 1з розрахунку одна норми витрат дючо! речовини кожного препарату, вказано! виробником. Одну часгину обробленого фунгщидами насшня шокулювали чистою культурою суспензи ризобш прогягом одна години (титр концентращ суспензи сгановив 108 кл./мл). 1ншу часгину обробленого фунгщидами насшня шокулювали суспеняею ризобш, яка попередньо була iнкубована з розчином комерцшного лектину со! («Лектинотест», м. Льв!в) у концентрацц 100 мкг/мл. Тривалiсгь iнкубацii з лектином сганови-ла 20 годин за температури 28 °С.
Рослини вирощували у 4-юлограмових посудинах у пщанш кульгур11з внесенням поживно! сумм Гельрiгеля з 0,25 норми азоту за природного освплення га оптимального водозабезпечен-ня (70% в!д повно! вологоемносп). Контролем слугував вар1ант з шокулящею насiння ризоб1ями без викорисгання лектину га без
обробки фунгщидами. Азотфжсувальну актившсть (АФА) визна-чали ацетиленовим методом (Hardy, 1968) на газовому хромато-граф1 «Agilent GC system 6850» (США) з полуменево-iошзацшним детектором. Роздiлення газiв проводили на колонщ (Supelco Pora-pak N) за темперагури термостата 55 °С i детектора - 150 °С. Газом-нос1ем був гелш (20 мл/хв). Об'ем анажзовано! проби газово! сум!ш! сгановив 1 см3. Як стандарт використовували чистий егилен (Sigma-Aldrich, № 536164, США). Наростання вегетативно! маси рослин контролювали ваговим методом. Вимiрювання показниюв АФА, надземно! маси га маси кореня проводили у 6-разовiй повторном!
Для отримання ензимного екстракгу наважку рослинного ма-гер1алу (0,2 г) розтирали у сгупЛ з 4 мл охолодженого 50 мМ фосфатного буферу (рН 7,5), який мстив 2 мМ егилендамштетраоц-гову кислогу (ЕДТА), 1 мМ феншметилсульфоншфторид, 5 мМ Р-меркаптоетанол i 1% (в/о) пол1в!н1лп!рол1дон. Гомогенат цен-трифугували за 10 000 об./хв прогягом 20 хв за 4 °С. Супернатант використовували для визначення активност! ензимзв за допомо-гою спектрофотометра «Smart Spec Plus» (США).
Активнють АПО (КФ 1.11.1.11) визначали за зменшенням оп-гично! густини за довжини хвил 290 нм прогягом хвилини у результат! окиснення аскорбагу (е = 2,8 мМ-1см-1) (Nakano & Asada, 1981). Реакцшна сумш мiстила 50 мМ калш-фосфатний буфер (рН 7,0), 0,1 мМ ЕДТА, 0,2 мМ аскорбат, 0,1 мМ Н2О2. Реакцю шщювали додаванням 150 мкл супернаганта. Активнють ГПО (КФ 1.11.1.7) - за збшьшенням отлично! густини за 470 нм прогягом хвилини у результат! окиснення гваяколу (е = 26,6 мМ-1см-1) (Egley et al., 1983). Реакцшна сумш мстила 50 мМ калш-фосфат-ний буфер (рН 7,0), 0,1 мМ ЕДТА, 0,5% гваякол, 10 мМ Н2О2. Реакцию шщювали додаванням 50 мкл супернаганта. Активнють СОД (КФ 1.15.1.1) визначали за здатнстю ензиму шпбувати фо-гохiмiчне вщновлення нпросинього тетразолш (Raychauhuri & Deng, 2000). Реакц1йна сумш мстила 50 мМ фосфатний буфер (рН 7,8), 13 мМ метюнш, 2 мкМ рибофлавш, 63 мкМ р-нпросинш гетразолш, 0,1 мМ ЕДТА i 100 мкл ферментного екстракгу. Реакция тривала прогягом 15 хвилин за iнтенсивностi св1тла 70 мкмоль кваппвАм2 • с) осв1тлення флуоресцентними лампами погужнстю 15 Вт. Оптичну гусгину вимiрювали за 560 нм. Вмст загального розчинного проте!ну у ферментному екстракп визначали за Bradford (1976). Активнють ферменпв визначали у 4-крат-нш повторност1. Одержат дат оброблет сгагисгично, значення Р < 0,05 розглядали як кригерш значущосгг р!зниц!. У габлицях 1-4 i на рисунках 1-4 наведено середт арифмегичнi значення га !х сгандаргт похибки (SE).
Результати
1нокуляцк насiння со! ризоб1ями, iнкубованими з лектином, сприяла п1двищенню ефекгивност1 симбютичного апарагу. Це проявлялось у стимуляцц АФА кореневих бульбочок, яка зростала за д!! лектину на 20%о пор!вняно з контролем у фазу трьох справжнзх лисгкв га масового цв1т1ння (рис. 1). Разом 1з гим, у фазу бутонза-ц}! не зафiксовано ютотно! р1зниц! АФА мзж варiантами з викорис-ганням лектину га без його учасп.
Обробка насiння со! фунгщидами по-р1зному впливала на процеси функцюнування симб1огичного апарага в рослин на фон! бактеризащ ризоб1ями. Серед уск досл1джуваних препараггв 1з фунгшидною активнютю у вар1анг1 з обробкою насiння фунг!ци-дом Сгандак Топ зафжсоване найбiльше пригнiчення АФА кореневих бульбочок, особливо у фазу трьох справжнх листюв (на 60% пор!вняно з контрольними рослинами, рис. 1).
Передпоовна обробка насшня фунгщидами Февер i Максим XL проявляла меншу токсичну д!ю на АФА кореневих бульбочок. У фазу трьох справжнх листюв у вар1антах з обробкою цими препаратами спостернали незначне п1двищення АФА, показники яко! у насгупнi фази онтогенезу дещо знижувались пор!вняно з кон-трольним варiантом (за д!! Максиму XL), або були в межах похибки дослщу (за до Феверу). Обробка насiння со! дослвджуваними фунгiцидами на фон! бактер1зацй B. japonicum, шкубованих 1з лек-
тином, викликала пригтачення ефективносп роботи симпатичного апарату, про що сввдчить сутгеве зниження процеов азотфiксацiï кореневих бульбочок поршняно з рослинами контрольного вар1ан-та (рис. 1). Зокрема, у вар1анп з обробкою насшня Стандак Топом i ризоб1ями, шкубованими з лектином, виявлене найбшьше зниження АФА (до 70%) кореневих бульбочок упродовж онтогенезу.
Водночас, оброблення насшня со! фунгшидами Февер i Максим XL спшьно з шокуляцею ризоб1ями, шкубованими з лектином, чинила менш виражений токсичний вплив на симбютичний апарат. У фази трьох справжшх листюв i бутотзащ АФА кореневих бульбочок знижувалась пор1вняно з контролем (на 40% - Февер та 47% -Максим, тод як у фазу цвшння - на 25% i 27%, вщповщно).
х s
ч
К
О4
2
1,6
1,2
< ©
<
0,8
0,4
**
7 **
й
t
i
ь
k
ft
il
Фаза онтогенезу
iii
Рис. 1. Вплив обробки насшня со! B. japonicum 634б, шкубованими з лектином, спшьно iз фунгщидами на азотфжсувальну активнгсть (АФА) кореневих бульбочок у фазу трьох справжЩх листкв (i), бутошзаци (Ii) та масового цвiтiння (Ш) (n = 6, x ± SE): тут i на рис. 2-4: 1 - ризоби (контроль), 2 - (ризоби + лектин), 3 - ризоби + Максим XL, 4 - (ризоби+лектин) + Максим XL, 5 - ризоби + Февер, 6 - (ризоби+лектин) + Февер, 7 - ризоби + Стандак Топ, 8 - (ризоби + лектин) + Стандак Топ; i - шкубащя компонента протягом 20 годин за 28 °С; дат пор!вняно з контролем вiр)огiднi за * - Р < 0,05, ** - Р < 0,01, *** - Р < 0,001
У рослин, насшня яких поддавали обробц фунгщидами та шо-кулювали суспеняею ризобш, шкубованих iз лектином, вщбулось пригтачення ростових процеов у фази трьох справжн1х листкв i бутонiзацiï (табл. 1 ). У фазу цвшння такий ефект впливу комплексно! обробки вже був не так сильно виражений. Найбшьшу ток-сичну дiю на наростання надземно! маси та маси коренево! систе-ми чинив подiбний комплекс iз протруйником Стандак Топ. У фазу трьох справжЩх листкв щ показники були нижчими до 40% вщ контролю, а у фазу бутошзаци - до 30%о. Поеднання подiбного комплексу з фунгшидом Максим викликало зниження коренево! маси рослин со! на 29% пор!вняно з контрольними рослинами у фазу трьох справжнк листкв. У фазу бутошзаци рослини цього
варiанта досл1ду характеризувались нижчою масою як надземних орган1в (на 12%), так i коренево! системи (на 16%о пор1вняно з контролем). Лише комбшащя обробки насшня Февером спшьно з ри-зоб1ями, шкубованими з лектином, не впливала на дослщжуваний показник. У варiантах дослщу без використання лектину не зафж-совано подбного iнгiбувального ефекту ввд дослщжуваних фунгъ цидв на ростовi параметри рослин (табл. 1). Инокулящя со! ризо-б1ями, шкубованими з лектином, шдукувала рвку штенсифшацю активности СОД у кореневих бульбочках у фазу трьох справжшх листкв, майже удач пор1вняно з контролем (табл. 2). У фазу масового цвтння активность ферменту не суттево зростала однак була на 23% вищою за р!вень контрольних рослин.
Таблиця1
Вплив обробки насшня со! B. japonicum 634б, шкубованими з лектином, спшьно з фунгщидами, на наростання вегетативно! маси рослин (г/рослину, n = 6, x ± SE)
Фаза онтогенезу
Вар1ант трьох справжих листгав бутонiзацiï масового цвтння
надземна маса масакореня надземна маса маса кореня надземна маса маса кореня
ризоби(контроль) 3,52 ± 0,21 2,71 ± 0,18 3,63 ± 0,25 2,71 ± 0,21 4,80 ± 0,28 2,50 ± 0,18
(ризоби + лектин) 3,87 ± 0,30* 2,58 ± 0,20* 3,91 ± 0,22* 3,55 ± 0,14** 5,70 ± 0,36* 4,07 ± 0,33***
ризоби + Февер 3,52 ± 0,14 2,46 ± 0,22* 3,60 ± 0,28 3,48 ± 0,27** 5,54 ± 0,22* 3,53 ± 0,29**
ризоби + Максим XL 3,49 ± 0,33 2,60 ± 0,19* 4,48 ± 0,33** 3,30 ± 0,27** 4,70 ± 0,16 4,66 ± 0,29***
ризоби + Стандак Топ 3,11 ± 0,17* 2,11 ± 0,17** 3,30 ± 0,14* 3,06 ± 0,28** 4,93 ± 0,13 3,19 ± 0,29**
(ризоби + лектин) + Февер 3,41 ± 0,27 2,26 ± 0,18** 3,43 ± 0,19* 2,40 ± 0,23* 4,83 ± 0,23 3,10 ± 0,21**
(ризоби + лектин) + Максим XL 3,18 ± 0,17* 1,94 ± 0,08** 3,20 ± 0,12* 2,28 ± 0,18* 5,15 ± 0,29* 2,68 ± 0,25
(ризоби + лектин) + Стандак Топ 2,25 ± 0,22*** 1,71 ± 0,09*** 2,46 ± 0,19*** 2,25 ± 0,19* 4,24 ± 0,32* 2,24 ± 0,11*
Примтка: тут i в табл. 2-4 i - шкубащя компонентв протягом 20 годин за 28 °С; дат порiвняно з контролем вiрогiднi за * - Р < 0,05, ** - Р < 0,01, *** - Р < 0,001.
Обробка насшня со! фунгщидами спшьно з ризоб1ями спричи-няла щдвищення активносп СОД у кореневих бульбочках у фазу трьох справжнк листюв. За таких умов обробки активность ферменту не суттево зростала у фазу масового цвшння. Подбну тенденцию змии активносп СОД у кореневих бульбочках зафжсова-но за комплексно! обробки насшня фунгщидами спшьно з ризо-б1ями, шкубованими з лектином. Динамжа активносп СОД за комплексно! обробки насшня характеризувалась суттевим зрос-танням у фазу трьох справжнк листив i незначним у фазу масового цвтння, незалежно вщ характеру дючо! речовини фунгшиду та !х сп1льного впливу з ризоб1ями, шкубованими з лектином.
Инокуляцк со! ризоб1ями, шкубованими з лектином, спричи-няла щдвищення активносп АПО в кореневих бульбочках, пор!в-няно з контролем у фази трьох справжнк листкв i масового цвшння (табл. 3). При цьому ми не зафжсували суттевих змш активносп ГПО (у межах похибки дослщу) (табл. 4).
Обробка насшня со! препаратами з фунгщидною дею на фон! бактеризац! ризоб1ями шдукувала щдвищення активносп АПО та р!зке пригтачення активносп ГПО у кореневих бульбочках пор!в-няно з контрольними рослинами у фазу трьох справжнк листкв (табл. 3, 4). У фазу масового цвшння, вщбувалась штенсифжащя активносп АПО та наближення р!вня активносп ГПО до контролю.
*
*
*
* *
0
Таблиця 2
Вплив обробки насшня coï B. japonicum 634б, шкубованого з лектином, сильно i3 фунгщидами, на активнють супероксиддисмутази (СОД) у кореневих бульбочках (од. а./мг бшка, n = 4, x ± SE)
^pionT
Фаза онтогенезу
три справжш листки масового цвiтiння
ризобй' (контроль) 24,3 ± 1,2 20,4 ± 1,2
(ризоби + лектин) 46,5 ± 3,1*** 25,1 ± 1,5*
ризобй' + Февер 43,2 ± 2,6*** 23,8 ± 1,4*
ризобй' + Максим XL 40,4 ± 3,6*** 23,3 ± 1,4*
ризобй' + Стандак Топ 35,5 ± 1,5** 26,9 ± 1,6*
(ризоби + лектин) + Февер 33,3 ± 1,6** 22,9 ± 1,4*
(ризоби + лектин) + Максим XL 38,8 ± 3,8** 24,5 ± 1,5*
(ризоби + лектин) + Стандак Топ 33,9 ± 2,5** 23,1 ± 1,4*
Таблиця 3
Вплив обробки насшня coï B. japonicum 634б, iнкубoванoгo з лектином, спшьно iз фунгщидами, на активнють аскорбатпероксидази (АПО) у кореневих бульбочках (мкмоль аскорбату/мг бiлка • хв, n=4, x ± SE)
Ваpiант
Фаза онтогенезу
три справжш листки масового цвтння
ризоби (контроль) 0,038 ± 0,009 0,096 ± 0,018
(pизoбiï+лектин> 0,091 ± 0,020*** 0,155 ± 0,018**
ризоби + Февер 0,114 ± 0,006*** 0,191 ± 0,016***
ризоби + Максим XL 0,115 ± 0,014*** 0,140 ± 0,022**
ризоби + Стандак Топ 0,217 ± 0,020*** 0,356 ± 0,040***
(ризоби +лекган> + Февер 0,039 ± 0,006 0,261 ± 0,030***
(ризоби + лектин) + Максим XL 0,089 ± 0,012*** 0,194± 0,016***
(pизoбiï+лектин)i + Стандак Топ 0,108 ± 0,011*** 0,260 ± 0,030***
Таблиця 4
Вплив обробки насшня coï B. japonicum 634б, iнкубoванoгo з лектином, спшьно з фунгщидами, на активнють гваяколпероксидази (ГПО) у кореневих бульбочках (мкмоль гваяколу/мг бшка • хв, n = 4, x ± SE)
Ваpiант
Фаза онтогенезу
три справжш листки масового цвтння
ризоби (контроль) 0,145 ± 0,011 0,283 ± 0,027
(ризоби + лекган> 0,162 ± 0,010* 0,204 ± 0,014*
ризоби + Февер 0,078 ± 0,018** 0,225 ± 0,007*
ризоби + Максим XL 0,046 ± 0,008*** 0,173 ± 0,013**
ризобй' + Стандак Топ 0,041 ± 0,008*** 0,266 ± 0,030*
(ризобй +лектин> + Февер 0,151 ± 0,010* 0,176 ± 0,016**
(ризоби + лектин) + Максим XL 0,268 ± 0,011*** 0,173 ± 0,014**
(ризоби + лектин) + Стандак Топ 0,072 ± 0,013** 0,177± 0,020**
Обробка насшня coï фунгщидами Максим XL i Стандак Топ стльно з ризо6!ями iнкубoваними з лектином, спричинила пщви-щення активносп АПО в кореневих бульбочках у фазу трьох справжнк листкв (табл. 3). У ваpiантi з подбною обробкою за використання фунгшиду Февер активность ферменту в кореневих бульбочках coï перебувала на р!ви контрольних рослин. У фазу масового цвтння його активнють зростала в уск вар1антах з обробкою насшня дослвджуваними фунгщидами та шокулящею B. japonicum, шкубованими з лектином.
Обробка насння coï ризо6!ями, iнкубoваними з лектином, у комплекс з фунгшидом Максим XL спричиняла пщвищення активносп ГПО в кореневих бульбочках у фазу трьох справжнк листкв (табл. 4). За таких умов вирощування рослин та використання обробки насшня фунгшидом Февер активнють ферменту була на р!ви контрольних рослин, тод як за до Стандак Топу -знижувалась. У фазу масового цвтння в уск вар1антах з обробкою насшня дослвджуваними фунгщидами спшьно з ризоб1ями, iнкубoваними 1з лектином, акIивнicть ГПО у кореневих бульбоч-ках знижувалась.
За шокуляци наciння œï ризоб1ями, iнкубoваними з лектином, активнють СОД у коренях зростала у фазу трьох справжнк лист-юв i досягала р!вня конрольних рослин у фазу масового цвтння (рис. 2). Обробка насшня œï фунгщидами спшьно з шокуляцкю
B. japonicum викликала щдвищення активносп ферменту в коренях ж^няно з контролем у фазу трьох справжнк листкв за до Максиму (на 97%) та Феверу (на 20%), однак до зниження його активносп за до Стандак Топу на 23%. У фазу масового цвтння за таких умов обробки насшня активтсть ферменту в коренях œï знижувалась, особливо р1зко за до Стандак Топу (на 42%), Феверу (на 35%), та незначно за до Максиму (на 15%) (рис. 2).
В
о
100 80 60 40 20 0
4
Й*
5
ш,
1 2 * гЕЙ3
*6*
Фаза онтогенезу Б
О
и
40
30
20
10
* 6 5|5
1 2 fei
456
* £8
Фаза онтогенезу
Рис. 2. Вплив обробки насшня œï B. japonicum 634б, шкубованими з лектином, спшьно в фунгщидами, на активнють супероксиддисмутази (СОД) у коренях (А) i листках (Б) у фазу трьох справжнк листкв (1) i масового цвшння (ff): n = 4, x ± SE
Використання лектину як компонента шокуляцшжд суспензи спшьно з обробкою насшня œï фунгщидами шдукувало щдвищення активносп СОД у коренях рослин у фазу трьох справжнк листкв за до Максиму (на 55%) та не викликала суттевих змш активносп ферменту пор!вняно з контролем за до Феверу та Стандак Топу. У фазу масового цвшння тенденция активносп СОД залишалась майже на такому ж р!ви, як у фазу трьох справжнк листив, поняло з конрольними рослинами.
Инокуляцк наciння coï ризо6!ями, iнкубoваними з лектином, викликала незначне зниження активносп СОД у листках у фазу трьох справжнк листкв та наближення р!вня активносп ферменту до контрольного у фазу масового цвтння (рис. 2).
Використання обробки насшня coï фунгщидами спшьно з шо-куляцею ризоб1ями спричиняло незначне пщвищення активносп ферменту в листках за до Максиму (на 18%), зниження його активносп за до Феверу (на 18%) та, особливо, за до Стандак Топу (на 39%), пор!вняно з контролем у фазу трьох справжнк листкв. Водночас у фазу масового цвтння активнють СОД у листках не суттево ввдр1знялась вщ конролю за обробки Максимом i Февером i знижувалась за до Стандак Топу.
Комплексна обробка насшня coï фунгщидам i ризоб1ями, шку-бованими з лектином, спричиняла шдвищення активносп СОД у листках у ваpiантi з Максимом (до 50%), зниження - за викорис-
А
11
1
0
I
II
тання Стандак Топу (до 32%) i незначних змш пор!вняно з контролем у варiанri з Февером у фазу трьох справжнк листкв. У фазу масового цвiтiння подбний комплекс обробки за використання ризобш, шкубованих iз лектином, сппричинив зниження активносп СОД у листках за до Стандак Топу (до 20%) i в1дсутн1сть помт-них змш активносп ферменту за до Максиму та Феверу.
Обробка насшня со ризоб1ями, шкубованими з лектином, не викликала суттевих змзн активносп АПО в коренях пор1вняно з контрольними рослинами (рис. 3). Водночас активность ферменту в листках за до лектину зростала у фазу трьох справжнк листкв i була на р1вт контролю у фазу масового цвшння.
У симбютичних системах, утворених за участю соï, шокульо-важд B. japonicum, та за обробки насшня фунгщидами, спостерша-ли щдвищення активносп ферменту в коренях за використання Максиму XL i зниження його активносп за до Феверу та Стандак Топу у фазу трьох справжнк листкв (рис. 3). Реакцк АПО в листках на обробку протилежна до змши ïï активносп в коренях: зро-стала за використання Феверу та Стандак Топу та знижувалась у варiангi з Максимом XL. У фазу масового цвшння р1вень активносп ферменту в коренях дещо зростав або був у межах похибки дослщу, тод як його активность у листках знижувалась у вск дослвджуваних симбютичних системах. Виняток - варiажг !з об-робкою фунгшидом Февер: активн1сть ферменту знижувалась у коренях i листках пор!вняно з контрольними рослинами.
А
0,4 г
0,3
и S
О
С
<
0,2
0,1
3
"Й
il
Й
* *
3 4
6
5 6 7 *
îffi
Фаза онтогенезу Б
0,8 г
0,6
и
.5 0,4
S и S
о
С
<
0,2
***
**
** £
1 2
X 4
4 5
И
Фаза онтогенезу
Рис. 3. Вплив обробки насшня coï B. japonicum 634б, шкубованими з лектином, сильно з фунгщидами, на активность АПО у коренях (А) i листках (Б) у фазу трьох справжих листюв (1) та масового цвшння (II): n = 4, x ± SE
Виявлено поДбну до обробки насшня ризoбiями з фунгшида-ми тенденщю зм1ни активносп АПО в коренях i листках за комплексна обробки coï за участю лектишв (рис. 3). 1ншу тенденцию спостершали лише у фазу трьох справжнк листкв у вар!антах !з
подбним комплексом обробки насшня та використання Максиму ХЬ о Феверу: активность ферменту в листках досягала ровня кон-трольних рослин.
За шокуляцц насшня со! ризоб1ями, шкубованими з лектином, не вщбувалось суттевих змон активносп ГПО в коренях, поровня-но з контрольними рослинами (рис. 4). При цьому активность ферменту в листках подвищувалася у фазу трьох листков та знижува-лася у фазу масового цвшння. Комплексна обробка насшня со! ризоб1ями та фунгщидами Стадак Топ о Максим ХЬ шдукувала рвку штенсифжацою активносп ГПО в коренях у фазу трьох справжнк листков (рис. 4). За до фунгшиду Февер активность ферменту в коренях залишалась на ровно контрольних рослин.
ч
0,8
0,6
О С и
и
.5 0,4
0,2
lÈ
i
** * -7 **
lb
* я
Фаза онтогенезу Б
0,1
4 §
5 и
§ и
ê* *
5 7
CL
* i 2Г±П
4 5 6
Фаза онтогенезу
Рис. 4. Вплив обробки насшня œï B. japonicum 634б, шкубованими з лектином, спшьно в фунгщидами, на активнють ГПО в коренях (А) i листках (Б) у фазу трьох справжнх листкв (I) та масового цвшння (II): n = 4, x ± SE
У фазу масового цвшння рiвень його активносп в коренях зростав у вск дослвджуваних симбютичних системах за учасп ризобш i фунгщида, особливо за до Стандак Топу. За комплексна обробки насшня ризо6!ями та фунгщидами активнтсть ГПО в листках ютотно знижувалась у фазу трьох справжнх листкв. У фазу масового цвшння його активнтсть наближалася до контрольного за да Максиму XL, залишалася на низькому р1вт за дй Феверу та зростала за да Стандак Топу.
Обробка насшня ризоб1ями, шкубованими з лектином, сильно з фунгшидом Максим XL сппричиняла стр1мке зростання активносп ГПО в коренях у фазу трьох справжнх листкв, тод як по-дбна обробка за участю фунгшидв Февер i Стандак Топ шдукувала зниження активносп ферменту в коренях пор!вняно з контролем. У фазу масового цвшння активнють ферменту в коренях пе-ребувала на досить високому р1вт в цих симбютичних системах. Ьокуляця соï ризоб1ями, шкубованими з лектином, спшьно з
А
1
5
2
0
II
1
0
I
II
0
II
*
0
II
обробкою насшня фунгшидами Ондукувала зниження активносто ГПО в листках пор1вняно з контролем як у фазу трьох справжнк листкв, так i у фазу масового цвтння. Особливо у варГанто з комплексною обробкою насшня з1 Стандак Топом, у фазу трьох справжнк листкв.
Обговорення
Складов! механизмов да лектин1в на рослини - к залучення до сигнально! системи регуляцц росту та розвитку за безпocеpедньoï взаемода з фотогормонами. Р1стстимулювальна дя лектин1в пов'я-зана з1 зм1нами балансу фпогормонГв у бОк накопичення шдолш оцтово! кислоти (1ОК) та циток!н]н1в у рослино (Kyrychenko, 2014). Пщвищення активносп пероксидази як потфункцюнального ферменту розглядають серед Гнших ïï функцш у кЕйтин! ще й як вщпо-вщь на збiльшення вмсту ендогенного ауксину, а за р1внем активносп пероксидази у рослинах можна судити про вмост у них аук-син1в, зокрема 1ОК (Fedorova et al., 2000). Зафжсоват нами зм1ни активносто антиоксидантних ферменпв у створених симб1отичних системах за обробки насшня ризоб1ями iнкубoваними з лектином, спшьно з фунгшидами, можуть бути пов'язат саме з порушенням регуляторно! функцй ендогенних лектин1в.
Як зазначено вище, характерна особлив1стъ структури рослин-них лектинiв - наявнють центров гщрофобного зв'язування. Це вка-зуе на наявнicтъ у них самостйних сайтОв, як; вiдпoвiдаютъ за гщ-рофобну взаемодю з молекулами невуглеводно! природи, зокрема фггогормонами, внаслщок чого вони можуть активно включатися в систему гормонально! регуляцц процеав росту та розвитку рослин (Babosha, 2008; Kyrychenko, 2014). Можна припустити, що дюч речовини дослГджуваних фунгшидв Ондукували блокування гщрофобних сайтов зв'язування в мoлекулi болка чим створюва-лась своерОдна конкуренция за сайти зв'язування з шшими хмч-ними сполуками, що спричинило змши процеав формування та функцюнування соево-ризобГального симб1озу.
ДослГдженнями останнк рокв показано, що негативний вплив препаратов в фунгшидною активнОстю на ефективнicтъ бобово-ри-зоб1ального симб1озу пов'язаний 1з порушенням регуляторно! системи сигналГв мож макро- та мжросимбюнтами блокуванням активносп генОв нодуляцй та зменшенням р1вня ризоб1ального Nod-фактора (Bikrol et al., 2005; Fox et al., 2007; Araujo et al., 2017). Пестициди можуть впливати через шгобування флавонощного Nod-рецептора, шдукуючи пригтачення синтезу та секрецй флавонощ-них речовин, що виробляються рослиною, тим самим порушуючи бобово-ризоб1альну взаемодю (Bikrol et al., 2005; Fox et al., 2007; Araujo et al., 2017). Кожна з дослГджуваних хмчних речовин конкурентно обмежувала активацОю генного Nod-фактора залежно вщ ïï концентраци та 1нг1бувально! до.
Отриман1 нами дан cвiдчатъ, що використання Онокуляцшно! cуcпензiï ризобОй, шкубованих 1з лектином, у комплекс1 з фунгшидами пригтачувало р1ст coï (надземно! маси та маси кореня), що супроводжувалось зниженням ефективносто роботи симб1отичного апарату. КрГм того зафОксовано р1зний ступ1нь впливу дослщжува-них препаратов 1з фунгшидною д1ею на ефективнють функцюну-вання соево-ризоб^льного симбюзу. На нашу думку, такий вплив препараттв залежав вод характеру дючих речовин, що входять до ïx складу, та здатносп утворених симбютичних систем pеалiзувати сво! симбютичн! властивосп за певних умов вирощування.
Аналз отриманих результатов показав, що обробка насшня coï ризобГями шкубованими з лектином, у комплекс! з фунгшидами пвдвищуе активнicтъ СОД i ГПО в кореневих бульбочках у фазу трьох справжнк листкв i стимулюе зростання активносп АПО у фазу масового цвтння. Це свщчить про активацОю захисних реакций рослин на р1вно роботи ферменпв з антиоксидантною активно-стю, ступ1нь яко! вiдpiзняетъcя залежно вщ характеру впливу дю-чо! речовини дослщжуваних фунгшидв. Специф1чною реакцею ферментов (СОД, АПО та ГПО) на комплексну обробку вщрГзняв-ся варГант 1з використанням фунгшиду Стандак Топ. На нашу думку це пов'язано з хмчним складом зазначеного препарату, присутностю трьох дючих речовин (фшроншу, тюфанат-метилу,
пораклостробшу), як! поеднують фунгшидну та шсектицидну дю. Поеднання такого комплексу хмчних сполук негативно впливае на метаботчт процеси рослин coï в симбюя з ризоб1ями При цьому найсильнттий негативний вплив на coевo-pизoбiалъний симб1оз, очевидно, спричинений саме наявнютю у склад препарату дючо! речовини тоофанат-метилу, який належить до класу бензимГдазо-л1в, що вiдpiзняютъcя низькою хмчною cтабiлънicтю та пОд час попаданя у Грунт швидко (протягом декшькох годин або навiтъ хвилин) годролОзуються до спйюшо! сполуки - карбендазиму з пеpioдoм нап1врозпаду (Т0,5) 3-6 мосяцОв (Evtushenko et al., 2004). Як зазначають л1тературн1 джерела, тюфанат-метил потрапляе через корОння та перемшуеться в рослин в акропетальному напрямку ксилемою, точн1ше, його метабол1т карбендазим, який характери-зуеться тератогенними, ембрютоксичними, гонадотоксичними та канцерогенними властивостями (www.demetra-agra.com.ua).
Вплив дючо! речовини (протюконазолу, клас триазоли), що входить до складу препарату Февер, полягае в шпбувант димети-лази - ферменту, який вщповщае за бiocинIез cтеpoлiв (будвель-ний матер1ал кл1тин патогену) та спричиняе порушення ц1л1сност1 кл1тинних стнок гриб1в, ïx загибель (Kobak et al., 2016). Проника-ючи в рослини, триазоли можуть порушувати синтез пберелмв у рослин1 та дяти як регулятори росту, спричиняючи ретардантний ефект. Тpивалicтъ Т0,5 uieï речовини залежись вщ рН навколиш-нього середовища: у лужному - понад р1к, у кислому - до 120 дб, у водних фотолпичних умовах - до 48 годин (Evtushenko et al., 2004). У наших дослщженнях застосовано обробку насшня чистою культурою B. japonicum 634б (рН 7,2) cпiлънo з водним розчином препарату Февер, !з наступним виpoшуванням рослин у пша-н!й культур! з! внесенням поживно! сум1ш1 Гельр1геля, тобто були створенг кoнIpoлъoванi умови з щдтриманням нейтрального рН Грунту, що могло бути причиною для нетривалого перюду дг! препарату та його менш шкодочинного впливу на соево-ризобГальний симбГоз пор1вняно з Гншими дослГджуваними фунгГцидами.
До складу препарату Максим XL входять дв! дГюч! речовини (флудюксонш i металаксил), одна з яких, флудГоксонГл, - аналог природного антибютика, що видГляеться Грунтовими бактерГями Pseudomonas pyrocinia, як! пригн^чують picr патогенних гриб1в (www.demetra-agra.com.ua). Вплив речовин пГдкласу триазолГнтГо-н!в на picr i розмноження патогену пов'язують Гз порушенням функц}! клгтинних мембран. Однак, вбиваючи збудникГв хвороб, цей препарат безпечний, не пригнгчуе корисну мжрофлору Грунту. ТривалГсть Т0,5 в Грунт! - 10-25 дб (Evtushenko et al., 2004). Тому фунгшидна дя Максиму не проявляла значного токсичного впливу на реалГзацгю симбГотичних властивостей coï.
Реакцгя антиоксидантних ферментГв (СОД, АПО i ГПО) в коренях i листках coï як на спшьну обробку ризобГями та фунгшидами, так i на комплексну обробку за участю гомолопчного лектину бшьш виражена у фазу трьох справжнк листкв пор1вняно з фазою масового цвгттння. Очевидно, це повязано з реакцею ферменпв на обробку як своерГдний стрес для рослини, який нГвелю-еться до фази масового цвтння. При цьому ступшь прояву активносп дослГджуваних ферментГв вГдрГзнявся мгж вар1антами залежно в}д характеру впливу дючо! речовини дослГджуваних фунгши-д1в, а також специфГчностГ прояву ïx спшьного впливу з ризобш-ми, Гнкубованими з лектином. У фазу масового цвтння у дослГд-жуваних симбГотичних системах спостерГгали зниження р1вня активност! ферментов (СОД, АПО i ГПО) в листках незалежно в}д хГм1чно! природи фунгГцидних препаратов та прояву ïx да в комплекс! з ризобГями, шкубованими з лектином. З одного боку, це мо-же бути пов'язано з онтогенетичними перебудовами метабол1зму рослин i переходом ïx у генеративну фазу онтогенезу, з шшого - з! зниженням хГм1чно! активност! дючих речовин препаратГв унасл!-док ïx повного чи часткового розпаду у Грунто (Т0,5).
Висновки
1нтенсифОкац0я активносп СОД, АПО та пригтачення активносп ГПО в кореневих бульбочках coï за до фунгшидв у фазу трьох справжнк листкв та подвищення активносто вс1х дослГджу-
ваних ферментш у фазу масового цвшння вказуе на суттевий роз-виток стресзахисних реакци у вщповвдь на обробку. При цьому використання комплексно! обробки насшня со! фунгщидами (Февер i Максим XL) та шокулянтом (штам B. japonicum 634б) сприяе збереженню АФА кореневих бульбочок i наростанню вегетативно! маси рослин.
Оробка насшня со! ризо6!ями, шкубованими з лектином, сп1льно з фунгщидами викликае п1двищення активносп СОД i ГПО в кореневих бульбочках у фазу трьох справжнк листюв i зростан-ня активносп АПО у фазу масового цвшння, що сввдчить про розвиток типово! антиоксидантно! реакци у вщповщь на комплек-сну обробку. Водночас, використання гомолопчного лектину со! в концентраци 100 мкг/мл як компонента шокуляцшно! суспензи для пом'якшення токсично! ди дослвджуваних фунгщидш на функцюнування соево-ризобiапьного симбюзу не виправдало оч1куваних результатов у суворо контрольованих умовах модельного вегетациного дослщу та потребуе подальших догаиджень у Грунговш культур».
Активнють антиоксидантних ферменпв (СОД, АПО i ГПО) в коренях i листках со! як на спшьну обробку ризоб1ями та фунгщидами так i на комплексну обробку за участю гомолопчного лектину була вираженшою у фазу трьох справжшх листкв поршняно з фазою масового цвшння, що пов'язано з реакщею ферменпв на обробку як своервдний стрес для рослини, який ивелюетъся до фази масового цвшння.
References
Alscher, R. G., Erturk, N., & Heath, L. S. (2002). Role of superoxide dismutases (SODs) in controlling oxidative stress in plants. Journal of Experimental Botany, 53(372), 1331-1341. Araujo, R. S., Cruz, S. P., Souchie, E. L., Martin, T. N., Nakatani, A. S., Nogueira, M. A., & Hungria, M. (2017). Preinoculation of soybean seeds treated with agrichemicals up to 30 days before sowing: Technological innovation for large-scale agriculture. International Journal of Microbiology, 1-11. Babosha, A. V. (2008). Inducible lectins and plant resistance to pathogens and
abiotic stress. Biochemistry, 73(7), 812-825 (in Russian). Bikrol, A., Saxena, N., & Singh, K. (2005). Response of Glycine max in relation to nitrogen fixation as influenced by fungicide seed treatment. African Journal of Biotechnology, 4(7), 667-671. Bradford, M. A. (1976). Rapid and sensitive method for the quantitation of the microgram quantities of protein utilising: The principle of protein - dye binding. Analytical Biochemistry, 72, 248-254. Chrispeels, M. J., & Raikhel, N. V. (1991). Lectins, lectin genes and their role in
plant defence. Plant Cell, 3, 1-9. Dalton, D. A, Baird, L. M., Langeber, L., Taugher, C. Y., Anyan, W. R., Vance, C. P., & Sarath, G. (1993). Subcellular localization of oxygen defense enzymes in soybean (Glycine max (L.) Merr.) root nodules. Plant Physiology, 102(1), 481-489.
Dalton, D., Joyner, S. L., Becana, M., Iturbe-Ormaetxe, I., & Chatfield, J. M. (1998). Antioxidant defenses in the peripheral cell layers of legume root nodules. Plant Physiology, 116, 37-43. Egley, G. H., Paul, R. N., Vaughn, K. C., & Duke, S. O. (1983). Role of peroxidase in the development of water impermeable seed coats in Sida sprinosa L. Planta, 157(1), 224-232. Erofeeva, E. A. (2015). Dependence of guaiacol peroxidase activity and lipid peroxidation rate in drooping birch (Betula pendula Roth) and tillet (Tilia cordata Mill.) leaf on motor traffic pollution intensity. Dose-Response: An International Journal, 1-6. Evtushenko, M. D., Marutin, F. M., Turenko, V. P., Zherebko, V. M., & Sekun,
M. P. (2004). Phytopharmacologia. Vusha Osvyta, Kyiv (in Ukrainian). Fedorova, E. E., Zhivnevskaya, G. Y., Kalibernaya, Z. V., Artemenko, E. N., Iz-mailov, S. F., & Guskov, A. V. (2000). Metabolism of IOA with the establishment of symbiosis between Phaseolus vulgaris and Rhizobium phaseoli. Russian Journal of Plant Physiology, 47(2), 231-235 (in Russian). Fox, J. E., Gulledge, J., Engelhaupt, E., Burow, M. E., & McLachlan, J. A. (2007). Pecticides reduce symbiotic efficiency of nitrogen-fixing rhizobia and host plants. Proceeding of the National Academy of Sciences USA, 104(24), 10282-10287.
Hardy, R. W. F., Holsten, R. D., Jackson, E. K., & Burns, R. C. (1968). The acety-lene-ethylene assay for nitrogen fixation: Laboratory and field evalution. Plant Physiology, 43(8), 1185-1207.
Hivrale, A. U., & Ingale, A. G. (2013). Plant as a plenteous reserve of lectin. Plant Signaling and Behavior, 8(12), 1-7.
Hoff, P. L. D., Brill, L. M., & Hirsch, A. M. (2009). Plant lectins: The ties that bind in root symbiosis and plant defense. Molecular Genetics Genomics, 282(1), 1-15.
Iturbe-Ormaetxe, J., Matamoros, M. A., Rubio, M. C., Dalton, D. A., & Becana, M. (2001). The antioxidant of legume nodule mitochondria. Molecular Plant-Microbe Interaction, 14(10), 1189-1196.
Kobak, S. Y., Kolisnik, S. I., & Serevetnyk, O. V. (2016). The most common diseases of soybean and the effectiveness of BASF products for their control. Agrobusiness Today, 10(329), 46-47 (in Ukrainian).
Kyrychenko, E. V. (2014). Phytolectines and diazotrophs - polyfanctional components of complex biological compositions. Biotechnologia Acta, 7(1), 4053 (in Ukrainian).
Lehotzky, R E., Partch, C. L., Mukheijee, S., Cash, H. L., Goldman, W. E., Gardner, K. H., & Hooper, L. V. (2010). Molecular basis for peptidoglycan recognition by a bactericidal lectin. Proceeding of the National Academy of Sciences USA, 107(17), 7722-7727.
Marco, I. (2013). Integrated soybean protection against diseases. Agrobusiness Today, 11(258), 16-21 (in Ukrainian).
Matamoros, M. A., Dalton, D. A., Ramos, J., Clemente, M. R., Rubio, M. C., & Becana, M. (2003). Biochemistry and molecular biology of antioxidants in the rhizobia - legume symbiosis. Plant Physiology, 133(2), 499-509.
Mittler, R. (2002). Oxidative stress, antioxidants and stress tolerance. Trends Plant Sciences, 7, 405-410.
Mohammadi, K., Sohrabi, Y., Heidari, G., Khalesro, S., & Majidi, M. (2012). Effective factors on biological fiation. Agricaltural Research, 7(12), 1782-1788.
Moran, J. F., James, E. K., Rubio, M. C., Sarath, G., Klucas, R. V., & Becana, M. (2003). Functional characterization and expression of a cytosolic iron-super-oxide dismutase from cowpea root nodules. Plant Physiology, 133(2), 773-782.
Moreira, R. A., Ainouz, I. L., Oliveira, J. T., & Cavada, B. S. (1991). Plant lectins, chemical and biological aspects. Memorias Instituto Oswaldo Cruz, 86(2).
Nakano, Y., & Asada, K. (1981). Hydrogen peroxidase is scavenged by ascor-bate-specific peroxidase in spinach chloroplasts. Plant Cell Physiology, 22(5), 867-880.
Nikolaevsky, V., Sirenko, V., & Titova, L. (2017). Effect of pre-seed bacterializa-tion of seeds on disease development and yield of soybean. Stiinta Agricola, 1, 55-59.
Owens, R. A., Blecburn, M., & Ding, B. (2001). Possible involvement of the phloem lectin in long-distance varied movement. Molecular Plant Microbe Interact, 14(7), 905-909.
Parsiavash, L., Saboora, A., & Nejad, S. Z. M. (2015). Investigating on the stability of peroxidase extracted from soybean (Glycine max var. Williams) and effects of Na+ and K+ ions on its activity. Journal of Cell and Molecular Research, 7(2), 94-101.
Petrichenko, V. F., & Kots, S. Y. (2014). Symbiotic systems in modern agricultural production. Bulletin of NAS of Ukraine, 3, 57-66 (in Ukrainian).
Raychauhuri, S. S., & Deng, X. W. (2000). The role of superxide dismutase in combating oxidative stress in higher plants. The Botanical Review, 66(1), 89-98.
Rubio, M. C., James, E. K., Clemente, M. R., Bucciarelli, B., Fedorova, M., Vance, C. P., & Becana, M. (2004). Localization of superoxide dismutases and hydrogen peroxide in legume root nodules. The American Phytopatho-logical Society, 17(12), 1294-1305.
Schmitz, N., Huystee, R., & Gijzen, M. (1997). Characterization of anionic soybean (Glycine max) seed coat peroxidase. Canadian Journal of Botany, 75(8), 1336-1341.
Sergienko, V. (2012). Diseases of soybeans and measures of its limitation. Agrobusiness Today, 11(234), 28-30 (in Ukrainian).
Shao, H.-B., Chu, L.-Y., Lu, Z.-H., & Kang, C.-M. (2008). Primary antioxidant free radical scavenging and redox signaling pathways in higher plant cells. International Journal of Biological Sciences, 4(1), 8-14.
Sharma, P., Jha, A. B., Dubey, R S., & Pessarakli, M. (2012). Reactive oxygen species, oxidative damage, and antioxidative defense mechanism in plants under stressful conditions. Journal of Botany, 20(12), 1-26.
Zhiznevskaya, G. Y., Troitskaya, G. N., Borodenko, L. I., & Izmailov, S. F. (2001). Peroxidase and catalase in root nodules of fodder beans at an effective and ineffective symbiosis with rhizobia. Physiology and Biochemistry of Cultural Plants, 33(4), 285-290 (in Ukrainian).
